Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sợi (Actinobacteria) từ hải miên vùng biển Hà Tiên và xác định hợp chất sinh học kháng vi sinh vật gây bệnh.Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sợi (Actinobacteria) từ hải miên vùng biển Hà Tiên và xác định hợp chất sinh học kháng vi sinh vật gây bệnh.Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sợi (Actinobacteria) từ hải miên vùng biển Hà Tiên và xác định hợp chất sinh học kháng vi sinh vật gây bệnh.Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sợi (Actinobacteria) từ hải miên vùng biển Hà Tiên và xác định hợp chất sinh học kháng vi sinh vật gây bệnh.Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sợi (Actinobacteria) từ hải miên vùng biển Hà Tiên và xác định hợp chất sinh học kháng vi sinh vật gây bệnh.Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sợi (Actinobacteria) từ hải miên vùng biển Hà Tiên và xác định hợp chất sinh học kháng vi sinh vật gây bệnh.Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sợi (Actinobacteria) từ hải miên vùng biển Hà Tiên và xác định hợp chất sinh học kháng vi sinh vật gây bệnh.Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sợi (Actinobacteria) từ hải miên vùng biển Hà Tiên và xác định hợp chất sinh học kháng vi sinh vật gây bệnh.Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sợi (Actinobacteria) từ hải miên vùng biển Hà Tiên và xác định hợp chất sinh học kháng vi sinh vật gây bệnh.Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sợi (Actinobacteria) từ hải miên vùng biển Hà Tiên và xác định hợp chất sinh học kháng vi sinh vật gây bệnh.BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành Công nghệ sinh học Mã ngành 62420201 TRẦN VŨ PHƯƠNG PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN SỢI (ACTINOBACTERIA) TỪ HẢI MIÊN VÙ.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Mã ngành: 62420201 TRẦN VŨ PHƯƠNG PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN SỢI (ACTINOBACTERIA) TỪ HẢI MIÊN VÙNG BIỂN HÀ TIÊN VÀ XÁC ĐỊNH HỢP CHẤT SINH HỌC KHÁNG VI SINH VẬT GÂY BỆNH Cần Thơ, 2022 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn chính: GS.TS Cao Ngọc Điệp Người hướng dẫn phụ: PGS.TS Ngô Thị Phương Dung Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp Trường Họp tại: Phòng Bảo Vệ Luận Án Tiến Sĩ, Lầu - Nhà Điều Hành, Trường Đại Học Cần Thơ Vào lúc ngày tháng năm 2022 Phản biện 1: Phản biện 2: Xác nhận xem lại chủ tịch Hội đồng Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ Thư viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Tạp chí quốc tế Tran Vu Phuong, Phan Van Ha Lam, and Cao Ngoc Diep, (2018) Bioactive compounds from Marine Streptomyces sp by Gas Chromatography-Mass Spectrometry The Pharmaceutical and Chemical Journal, Volume 5, Issue 1, pp 196-203 Tran Vu Phuong, Ngo Thi Phuong Dung, Cao Ngoc Diep, (2019) Diversified collection of novel sponge-associated actinobacteria of Ha Tien sea, Kien Giang province, Vietnam International Journal of Innovations in Engineering and Technology (IJIET), Volume 14, Issue 2, pp 33-41 Tran Vu Phuong and Cao Ngoc Diep, (2021) Spongeassociated actinobacteria Kien Giang sea exhibiting antimicrobial activity against human pathogenic Salmonella typhimurium International Journal of Innovations in Engineering and Technology (IJIET), Volume 19, Issue 4, pp 33-41 Tran Vu Phuong and Cao Ngoc Diep, 2021 Screening of Sponge-associated Actinobacteria against Human Pathogenic Candida albicans in Kien Giang Sea, Vietnam International Journal of Environmental & Agriculture Research (IJOEAR), Volume 7, Issue 7, pp 21-26 Tran Vu Phuong and Cao Ngoc Diep, 2021 Testing the ability against Bacillus cereus of actinobacteria strains isolated from sponges in Kien Giang Sea, Vietnam International Journal of Environmental & Agriculture Research (IJOEAR), Volume 19, Issue 9, pp 37-42 Tran Vu Phuong and Cao Ngoc Diep, 2021 Bioactive Compounds from Marine Microbacterium tumbae ND2.7c Strain by Gas Chromatography-Mass Spectrometry The Pharmaceutical and Chemical Journal, Volume 8, Issue 5, pp 12-18 Tạp chí nước Tran Vu Phuong, Phan Van Ha Lam, Duong Xuan Chu, and Cao Ngoc Diep, (2018) Secondary Metabolite Produced from Marine Bacterium Streptomyces sp strain ND7c Can Tho University Journal of Science, Volume 54, Issue 5, pp 88-90 Trần Vũ Phương, Phạm Ngọc Hân Cao Ngọc Điệp, (2019) Phân lập vi khuẩn liên kết với hải miên Hòn Nghệ, vùng biển Hà Tiên, tỉnh Kiên Giang, Việt Nam Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần thơ, Tập 55, Chuên đề công nghệ sinh học 2019(2), tr 1-9 CHƯƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết nghiên cứu Vi sinh vật nguyên nhân gây nhiều bệnh nguy hiểm cho người động vật Tuy nhiên, có vấn đề ngày phổ biến, xuất vi sinh vật kháng kháng sinh Do đó, nhiệm vụ đặt cho ngành cơng nghiệp sản xuất chất kháng sinh cải tiến chất kháng sinh cũ để tránh tình trạng kháng thuốc, đồng thời thúc đẩy nghiên cứu để tìm chất kháng sinh (Alanis, 2005) Trong số vi sinh vật có khả sinh kháng sinh vi khuẩn sợi (actinobacteria) hay cịn gọi xạ khuẩn đóng vai trò quan trọng hàng đầu, khoảng 80% chất kháng sinh phát có nguồn gốc từ vi khuẩn sợi, đặt biệt loài thuộc chi Streptomyces (Aslan, 1999) Tuy nhiên, việc tìm kháng sinh từ Streptomyces phân lập từ đất ngày trở nên khó khăn, vậy, việc phân lập loài vi khuẩn sợi từ nguồn đặc biệt khác để tìm kiếm kháng sinh cần thiết (Sirisha et al., 2013) Trong xu hướng này, loài vi khuẩn sợi phân lập từ biển quan tâm nhiều khả sản sinh hợp chất thứ cấp có nhiều hoạt tính sinh học có giá trị kháng sinh, hợp chất kháng ung thư, kháng khối u, thuốc bảo vệ thực vật …Trong đó, nhóm vi khuẩn sợi cộng sinh với hải miên nhiều nhà khoa học quan tâm (Asha Devi et al., 2006) Vùng biển Hà Tiên có nguồn nước biển sạch, trong, nơng ấm nên có nhiều lồi sinh vật sống phong phú có nhiều lồi hải miên Hải miên nguồn chứa nhiều vi sinh vật cộng sinh, đ1o có vi khuẩn sợi có khả sản xuất chất có hoạt tính sinh học, góp phần mang lại lợi ích kháng sinh phục vụ cho y học, nhiên cơng trình nghiên cứu nhóm vi khuẩn sợi cịn hạn chế Từ lý trên, đề tài nghiên cứu: “Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sợi (Actinobacteria) từ hải miên vùng biển Hà Tiên xác định hợp chất sinh học kháng vi sinh vật gây bệnh” tiến hành nhằm góp phần làm phong phú sản phẩm có giá trị cao khai thác từ nguồn tài nguyên biển phục vụ cho sống ứng dụng y học 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Phân lập tuyển chọn dòng vi khuẩn sợi có khả sản xuất hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn cao, đồng thời xác định hợp chất có hoạt tính sinh học, tạo nguồn vật liệu phục vụ cho nghiên cứu sản xuất hợp chất ứng dụng lĩnh vực dược phẩm 1.3 Nội dung nghiên cứu Luận án có nội dung nghiên cứu bao gồm: (1) Phân lập vi khuẩn sợi từ hải miên vùng biển Hà Tiên; (2) Đánh giá tuyển chọn dòng vi khuẩn sợi có khả kháng với vi sinh vật gây bệnh thử nghiệm gồm Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Escherichia coli Candida albicans, có khả sản xuất hợp chất sinh học có hoạt tính kháng khuẩn cao; (3) Nhận diện khảo sát mối liên hệ di truyền dòng vi khuẩn sợi tuyển chọn kỹ thuật sinh học phân tử; (4) Khảo sát diện gen PKS-I, PKS-II NRPS thị cho sản xuất hợp chất có hoạt tính sinh học dòng vi khuẩn sợi tuyển chọn; (5) Xác định hợp chất có hoạt tính sinh học dịng vi khuẩn sợi tiềm 1.4 Đóng góp luận án Đã phân lập 198 dòng vi khuẩn sợi từ hải miên vùng biển Hà Tiên, 130/198 dịng (đạt 65,7%) có khả kháng lại năm lồi vi sinh vật thử nghiệm gồm Bacillus cereus (82 dòng, đạt 41,4%), Salmonella typhimurium (73 dòng, đạt 36,9%), Candida albicans (42 dòng, đạt 21,2%), Escherichia coli (39 dòng, đạt 19,7%) Staphylococcus aureus (22 dòng, đạt 11,4%) Đã tuyển chọn định danh 23 dịng vi khuẩn sợi có khả kháng hai dịng vi sinh vật thị trở lên với mức độ kháng từ trung bình đến kháng mạnh Các dịng vi khuẩn sợi tuyển chọn thuộc họ bao gồm họ Actinomycetaceae, Microbacteriaceae, Nocardiaceae Gordoniaceae Tỷ lệ diện gen thị sản xuất chất có hoạt tính sinh học ghi nhận có khác nhau, bao gồm PKS-I 69,6%, PKS-II 60,9% NRPS 47,8% Hai dịng vi khuẩn sợi tiềm có khả kháng khuẩn cao định danh Streptomyces tateyamensis ND1.7a Microbacterium tumbae ND2.7c Bảy hợp chất có hoạt tính sinh học sản xuất từ Streptomyces tateyamensis ND1.7a xác định, gồm có: thymine; 2-Pentanone-4-hydroxy-4-methyl; cyclohexasiloxane dodecamethyl; cycloheptasiloxane tetradecamethyl; oxime- methoxyphenyl; hexanedioic acid bis (2-ethylhexyl) ester diisooctyl phthalate Đối với Microbacterium tumbae ND2.7c, 11 hợp chất có hoạt tính sinh học xác định bao gồm: cyclopentasiloxane decamethyl-, tetrasiloxane 3.5-diethoxy-1,1,1,7,7,7-hexamethyl-3,5bis(trimethylsiloxy), 1-dodecene, 3-isopropoxy-1,1,1,7,7,7-hexamethyl3,5,5-tris(trimethylsiloxy) tetrasiloxane, 3,5-di-t-butylphenol, phthalic acid, 3,4-dihydroxymandelic acid 4TMS, 1.6-dioxacyclododecane-7-12dione, 2-propyl-1-pentanol, 2-(2’,4’,4’,6’,6’,8’,8’heptamethyltetrasiloxan-2’yloxy)-2,4,4,6,6,8,8,10.10nonamethylcyclopentasiloxane phthalic acid monoethyl ester Kết đề tài hợp chất có hoạt tính sinh học hữu ích, đặc biệt khả kháng nấm kháng khuẩn, sở khoa học cho nghiên cứu nhằm tìm loại dược phẩm sản xuất từ vi sinh vật cộng sinh với hải miên góp phần bảo vệ sức khỏe cho người 1.5 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn luận án Luận án cung cấp thơng tin khoa học nhóm vi khuẩn sợi sống cộng sinh với hải miên có khả sản xuất hợp chất có hoạt tính sinh học hữu ích, đặc biệt khả kháng nấm kháng khuẩn Các kết luận án sử dụng nguồn tài liệu tham khảo giảng dạy cho sinh viên bậc đại học sau đại học sở đào tạo nghiên cứu lĩnh vực Các dịng vi khuẩn sợi có hoạt tính kháng khuẩn cao phân lập từ hải miên nguồn vật liệu sử dụng phục vụ cho nghiên cứu tinh sạch, sản xuất hợp chất có hoạt tính sinh học cao góp phần ứng dụng việc điều trị bệnh bảo vệ sức khỏe cho người CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Hải miên (bọt biển, sponges) sinh vật biển xuất trái đất lâu, cách 580 triệu năm (Li et al., 1998), sống thành cộng đồng nơi nước biển trong, sạch, nông (Watson & Barnes, 2004) Đây ngành động vật đơn giản nguyên thủy nhất, có mơ khác khơng có cơ, hệ thần kinh, quan bên trong, hay khả vận động Hải miên xem tách từ động vật khác trước đây, nhiên, chúng thiếu tổ hợp phức tạp tìm thấy hầu hết ngành động vật khác Các tế bào hải miên khác biệt hầu hết trường hợp không tổ chức thành mô riêng biệt Động vật thân lỗ thường ăn cách hút nước qua mạng lưới lỗ có nhiều vi khuẩn nước biển bơm thể tích nước lớn (24 m3/kg/ngày) (Kennedy et al., 2009) Hải miên có cộng đồng vi sinh vật đa dạng mơ chúng, đa dạng giải thích phần thay đổi điều kiện lý, hóa, sinh hải miên, ảnh hưởng đến sinh thái vi sinh vật tiến hóa Vacelet & Donadey (1977) phát số vi sinh vật cộng sinh với loài bọt biển này, vi khuẩn ngành (phyla) khác xác định hải miên Proteobacteria, Cyanobacteria, Acidobacteria, Chloroflexi, Bacteroidetes, Nitrospira Planctomycetes ngành Poribacteria Sự tiến hóa cân sinh thái bền vững hải miên có lẽ phần cộng sinh chúng với cộng đồng vi sinh vật Tuy nhiên, khơng giống vật chủ khác có số vi sinh vật có khả cộng sinh, hải miên có nhóm vi sinh vật cộng sinh đa dạng Taylor et al., (2007) phát có liên kết lồi thuộc ba giới Vi khuẩn (Bacteria), Cổ vi khuẩn (Archaea) Vi sinh vật chân hạch hay nhân thật (Eukarya) với hải miên Các quần thể vi sinh vật khác sống hải miên cịn có vi nấm vi tảo, đa dạng giải thích phần thay đổi điều kiện lý, hóa, sinh hải miên, ảnh hưởng đến sinh thái vi sinh vật tiến hóa Vi sinh vật liên kết với hải miên có nội bào ngoại bào (Calcinai et al., 2006; Cho et al., 2010) Các vi sinh vật chiếm đến 40% tổng sinh khối hải miên, nội bào tế bào tế bào lớp cấu trúc xốp (Wilkinson et al., 1978) Nhiều tác giả phát nhóm gen polyketide synthase vi sinh vật liên đới hải miên phân tích metagenomics (Piel et al., 2004; Schirmer et al., 2005; Kennedy et al., 2009) Nghiên cứu hai enzyme Non-ribosome peptide synthetases (NRPS) I Polyketide synthases (PKS-I) multimodular enzyme tham gia vào tổng hợp oligopeptide chất chuyển hóa thứ cấp polyketide sản xuất vi sinh vật vi khuẩn nấm Polyketide synthases (PKS) non ribosomal peptide synthases (NRPS) tham gia vào sản xuất nhiều sản phẩm tự nhiên NRPS liên quan đến tạo số thuốc chống khối u, ức chế miễn dịch, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus quan trọng có hàng trăm sản phẩm tự nhiên, gồm hợp chất giảm cholesterol lovastatin từ PKS Hải miên cung cấp thuốc tiềm chống lại nhiều mầm bệnh giới, hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus chống viêm Trong số 18.000 sản phẩm tự nhiên từ biển mô tả, 30% từ hải miên (Koopmans et al., 2009) Nghiên cứu vi sinh vật cộng sinh với hải miên, Cường et al (2014) sàng lọc 41 dòng vi khuẩn 11 dịng xạ khuẩn có hoạt tính đối kháng từ hải miên thu biển vùng biển Hải vân - Sơn Chà, có dịng vi khuẩn có hoạt tính đối kháng nguồn vi khuẩn gây bệnh trở lên dòng xạ khuẩn LC19b4 có khả ức chế sinh trưởng nguồn vi khuẩn gây bệnh với đường kính kháng khuẩn từ 14-17,5 mm Các nghiên cứu vi sinh vật liên kết với hải miên Việt Nam hạn chế có nghiên cứu tính đối kháng hệ vi sinh vật với dòng vi sinh vật gây bệnh, phát chất có hoạt tính sinh học khác từ hệ vi sinh vật vi khuẩn sợi chia hai nhánh nhỏ nhánh B1 với bốn dòng gồm dòng Microbacterium tumbae ND2.7c nhánh riêng ba dòng Streptomyces coelicolor HD2.3c (nguồn gốc Hòn Đầm), Streptomyces coelicolor ND1.1a (nguồn gốc Núi Đèn) Streptomyces variabilis N10b (nguồn gốc Hịn Nghệ) thuộc nhóm Streptomyces, điều cho thấy, ba dịng có vị trí địa lý khác chúng có mối liên hệ di truyền gần Nhánh B2 với năm dòng gồm Rhodococcus rhodochrous HD2.4a nhánh riêng, nhánh hai dòng Streptomyces recifensis HD1.2c Streptomyces olivaceus HD1.3d nhánh lại gồm hai dòng Rhodococcus hoagii HD2.3a Rhodococcus pyridinivorans HD2.5d, tất năm dòng thuộc nhánh B2 điều có vị trí địa lý thu mẫu từ Ba Hịn Đầm có mối liên hệ di truyền gần Có thể thấy, dịng vi khuẩn sợi có mối quan hệ gần mặc di truyền chúng phân lập hai địa điểm xa (Hòn Đầm Núi Đèn), ngược lại có dịng phân lập địa điểm lại phân làm hai nhánh phân tích sơ đồ phả hệ Những thay đổi dựa phân tích trình tự dịng vi khuẩn sợi cộng đồng vi sinh vật liên kết với hải miên đa dạng theo loài hải miên điều kiện nước biển (Hentschel et al., 2002) 4.4 Nhận diện gen PKS-I, PKS-II NRPS dòng vi khuẩn sợi Hai mươi ba dòng vi khuẩn sợi tuyển chọn khảo sát diện gen polyketide synthase type I (PKS-I), polyketide synthase type II (PKS-II) gen nonribosomal peptide synthetase (NRPS) thị hoạt tính kháng khuẩn kỹ thuật PCR với cặp mồi chuyên biệt A3F/A7R cho gen NPRS, K1F/M6R cho gen PKS-I cặp mồi KSαF/KSαR cho gen PKS-II 15 ... nhóm vi khuẩn sợi hạn chế Từ lý trên, đề tài nghiên cứu: ? ?Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sợi (Actinobacteria) từ hải miên vùng biển Hà Tiên xác định hợp chất sinh học kháng vi sinh vật gây bệnh? ??... hợp chất có hoạt tính sinh học dòng vi khuẩn sợi tuyển chọn; (5) Xác định hợp chất có hoạt tính sinh học dịng vi khuẩn sợi tiềm 1.4 Đóng góp luận án Đã phân lập 198 dòng vi khuẩn sợi từ hải miên. .. nội dung nghiên cứu bao gồm: (1) Phân lập vi khuẩn sợi từ hải miên vùng biển Hà Tiên; (2) Đánh giá tuyển chọn dịng vi khuẩn sợi có khả kháng với vi sinh vật gây bệnh thử nghiệm gồm Bacillus cereus,