Nghiên cứu phương pháp xác định vi khuẩn bacillus thuringiensis trong chế phẩm sinh học tribi thằn lằn chúa

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VI KHUẨN BACILLUS THURINGIENSIS TRONG CHẾ PHẨM SINH HỌC “ TRIBI - THẰN LẰN CHÚA’’ HANOI – 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VI KHUẨN BACILLUS THURINGIENSIS TRONG CHẾ PHẨM SINH HỌC “TRIBI – THẰN LẰN CHÚA’’ Sinh viên : Ninh Thị Xuân Lớp : K63CNSHC Mã sinh viên : 637293 Giảng viên hƣớng dẫn : Ts Nông Thị Huệ HANOI – 2022 LỜI CAM KẾT Tơi cam đoan tồn quy trình nghiên cứu đƣợc thực tơi dƣới giám sát khoa học Ts Nông Thị Huệ Tôi xin cam đoan tất nội dung nghiên cứu, kết luận thông tin luận văn tốt nghiệp tơi hồn tồn trung thực chƣa đƣợc cơng bố cơng trình i LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp thực Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật – Khoa Công nghệ sinh học- Học viện Nông nghiệp Việt Nam dẫn dắt của: Ts Nông Thị Huệ Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông Nghiệp Việt Nam Tơi xin bày tỏ kính trọng lịng biết ơn sâu sắc tới T.s Nông Thị Huệ tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình thực hồn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô giáo toàn thể cán nhân viên khoa Công Nghệ Sinh Học- Học viện Nông Nghiệp Việt Nam hướng dẫn,truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm cho suốt trình học tập trường Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình thân u tơi,cảm ơn bạn bè người sát cánh bên tôi, chia sẻ tạo động lực cho tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày… tháng….năm 2022 Sinh viên Ninh Thị Xuân ii MỤC LỤC LỜI CAM KẾT i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT viii TÓM TẮT ix CHƢƠNG I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích 1.3 Yêu cầu CHƢƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Khái quát chung vi khuẩn B thuringiensis 2.1.1 Lịch sử phát 2.1.2 Phân loại 2.2 Đặc điểm hình thái vi khuẩn B thuringiensis 2.3 Đặc điểm sinh hóa vi khuẩn B thuringiensis 2.4 Độc tố chế gây độc Bt 2.4.1 Độc tố 2.4.2 Cơ chế gây độc vi khuẩn Bt 2.5 Ứng dụng chế phẩm sinh học B thuringiensis 10 2.5.1 Trên giới 10 2.5.2 Ở Việt Nam 11 2.6 Phƣơng pháp xác định vi khuẩn B thuringiensis 13 2.6.1 Phƣơng pháp truyền thống 13 2.6.2 Phƣơng pháp phân tử 14 2.7 Giới thiệu sản phẩm sinh học “TRIBI – Thằn lằn chúa” 16 iii CHƢƠNG III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Vật liệu nghiên cứu 18 3.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 18 3.3 Nội dung phƣơng pháp nghiên cứu 18 3.3.1 Xác định phƣơng pháp phân lập Bacillus thuringiensis từ mẫu chế phẩm sinh học 18 3.3.2 Xác định vi khuẩn Bt đặc điểm hình thái sinh hóa 21 3.3.3 Xác định vi khuẩn Bt dựa phân tích phân tử 23 3.3.4 Khẳng định vi khuẩn Bt dựa vào PCR phát gen sinh tinh thể có mặt protein tinh thể độc 26 3.4 Các môi trƣờng, hóa chất 27 3.5 Tính tốn tổng số vi khuẩn B thuringiensis mẫu chế phẩm 29 CHƢƠNG IV: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30 4.1 Xác định phƣơng pháp phân lập B thuringiensis từ chế phẩm “TRIBI – Thằn lằn chúa” 30 4.1.1 Ảnh hƣởng tỷ lệ lấy mẫu ban đầu đến kết phân lập vi khuẩn 30 4.1.2 Ảnh hƣởng nồng độ pha loãng mẫu đến kết phân lập vi khuẩn 32 4.1.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ ủ mẫu đến kết phân lập vi khuẩn 33 4.1.4 Ảnh hƣởng thời gian ủ mẫu đến kết phân lập vi khuẩn 36 4.2 Xác định vi khuẩn Bt đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào 38 4.3 Xác định vi khuẩn Bt dựa vào đặc điểm sinh hóa 39 4.3.1 Kiểm tra sản sinh lecithinase 40 4.3.2 Thử nghiệm catalase 40 4.3.3 Kiểm tra lên men sucrose 41 4.4 Xác định vi khuẩn Bt dựa phân tích phân tử 42 4.4.1 Tách chiết DNA 42 iv 4.4.2 Xác định vi khuẩn Bt dựa vào PCR sử dụng mồi đặc hiệu loài 44 4.5 Khẳng định vi khuẩn Bt dựa vào PCR phát gen sinh tinh thể có mặt protein tinh thể độc 46 4.6 Tính tốn tổng số vi khuẩn B thuringiensis mẫu chế phẩm 48 CHƢƠNG V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 5.1 Kết luận 50 5.2 Kiến nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 v DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Các mồi PCR đƣợc sử dụng nghiên cứu 24 Bảng 3.2 Các thành phần phản ứng PCR 24 Bảng 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 25 Bảng 3.4 Mồi PCR đƣợc sử dụng nghiên cứu 26 Bảng 4.1 Ảnh hƣởng tỷ lệ lấy mẫu ban đầu đến phát triển vi khuẩn sau 24h nuôi cấy 30 Bảng 4.2 Ảnh hƣởng nồng độ pha loãng mẫu đến phát triển vi khuẩn sau 24h nuôi cấy 32 Bảng 4.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ ủ mẫu đến phát triển vi khuẩn sau 24 nuôi cấy 34 Bảng 4.4 Ảnh hƣởng thời gian ủ mẫu đến phát triển vi khuẩn sau 24h nuôi cấy 36 Bảng 4.5 Kết xét nghiệm sinh hóa 42 Bảng 4.6 Độ tinh khiết nồng độ DNA tổng số đƣợc tách chiết từ gen Bt 43 Bảng 4.7 Tổng số vi khuẩn B thuringiensis mẫu thử 48 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Hình thái tế bào (a) khuẩn lạc (b) vi khuẩn Bacillus thuringiensis Hình 2.2 Quét hình ảnh hiển vi điện tử loại hình thái tinh thể khác bào tử (S) đƣợc tạo chủng Bt Hình 2.3 Cơ chế diệt sâu hại Bacillus thuringiensis 10 Hình 3.1 Chế phẩm sinh học TRIBI – Thằn lằn chúa 18 Hình 4.1 Hình thái khuẩn lạc chủng Bt tiêu chuẩn phân lập môi trƣờng T3 38 Hình 4.2 Nhuộm gram chủng tiêu chuẩn chủng phân lập độ phóng đại 100X 39 Hình 4.3 Kết thử nghiệm sản sinh lecithinase 40 Hình 4.4 Kết thử nghiệm hoạt tính enzyme catalase 41 Hình 4.5 Kết thử nghiệm lên men sucrose 41 Hình 4.6 Kết điện di sản phẩm DNA vi khuẩn tách chiết phƣơng pháp xử lý nhiệt 43 Hình 4.7 Sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu cho gen XRE 44 Hình 4.8 Sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu cho gen GyrB 45 Hình 4.9 Sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu cho gen GroEL 46 Hình 4.10 Sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu cho gen Cry2 47 Hình 4.11 Hình ảnh nhuộm bào tử tinh thể chủng tiêu chuẩn 4T1 chủng phân lập T 48 vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Giải thích Bt CFU CTAB Cetyl trimethylammonium bromide DNA Deoxyribonucleic Acid LB MYP Mannitol Egg Yolk Polymyxin PCR Polymerase chain reaction CT Bacillus thuringiensis Conoly forming unit Luria Bertani broth Công thức viii 4.3.1 Kiểm tra sản sinh lecithinase Tiến hành kiểm tra sản sinh lecithinase cách nuôi chấm khuẩn lạc Bt mơi trƣờng MYP có chứa lịng đỏ trứng hai chất thị: mannitol phenol đỏ nuôi cấy 37 °C 18-24 h Kết quả: phản ứng dƣơng tính (+) cho thấy vòng kết tủa lecithinase xung quanh khuẩn lạc chủng phân lập Chủng tiêu chuẩn (4T1) Chủng phân lập (T) Hình 4.3 Kết thử nghiệm sản sinh lecithinase 4.3.2 Thử nghiệm catalase Để kiểm tra có mặt enzyme catalase tiến hành phản ứng với H2O2 3% Kết quả: phản ứng dƣơng tính (+) cho thấy có bọt khí sinh ra, bọt có màu trắng sữa, lƣợng bọt thay đổi chủng 40 Chủng tiêu chuẩn (4T1) Chủng phân lập (T) Hình 4.4 Kết thử nghiệm hoạt tính enzyme catalase 4.3.3 Kiểm tra lên men sucrose Phản ứng dƣơng tính (+): mơi trƣờng chuyển màu từ đỏ cam thành hồng A B C Hình 4.5 Kết thử nghiệm lên men sucrose (A) Chủng phân lập T, (B) Đối chứng âm (nƣớc), (C) Chủng chuẩn 4T1 41 Bảng 4.5 Kết xét nghiệm sinh hóa Chủng tiêu chuẩn Phân lập giả định “4T1” “T” Kiểm tra sản sinh Lecithinase + + Thử nghiệm Catalase + + Lên men Sucrose + + Phân lập Phản ứng Note: (+): phản ứng dương tính Kết bảng 4.5 cho thấy chủng phân lập (T) thể đặc điểm sinh hóa giống với chủng tiêu chuẩn (4T1) Tóm lại, chủng phân lập (T) mang đầy đủ đặc điểm khác biệt vi khuẩn Bt bao gồm đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, bào tử nhƣ đặc điểm sinh hóa (Baumann cs, 1984; Claus cs, 1986; Slepecky cs, 1992; Carlson cs, 1993; Hansen cs, 1998) Do đó, bƣớc đầu khẳng định chủng phân lập (T) Bacillus thuringiensis Tuy nhiên, theo Alippi cs (2019) B cereus có hình thái khuẩn lạc đặc điểm sinh hóa tƣơng tự nhƣ B thuringiensis Vì cần phải xác định đồng thời đặc điểm phân tử thị di truyền cụ thể theo loài 4.4 Xác định vi khuẩn Bt dựa phân tích phân tử 4.4.1 Tách chiết DNA Xác định nồng độ độ tinh DNA Sau tách chiết DNA, nồng độ sản phẩm độ tinh khiết DNA đƣợc xác định DNA có tỷ lệ OD260/280 nm 1,8 2,0 đƣợc coi tinh khiết (Nicklas cs, 2003) Kết OD260/280 , OD260/230 nồng độ DNA tổng số từ phƣơng pháp đƣợc trình bày bảng 4.6 42 Bảng 4.6 Độ tinh nồng độ DNA tổng số vi khuẩn B thuringiensis Nồng độ Mẫu vi khuẩn B thuringiensis (ng/ µl) OD260/280 OD260/230 Chủng tiêu chuẩn 4T1 120 1.23 1.02 Chủng phân lập T 475 1.00 0.97 Kết bảng 4.6 cho thấy sản phẩm DNA cho giá trị OD260/280 nhỏ 1.8 DNA tách chiết thu đƣợc khơng đáp ứng yêu cầu độ tinh khiết, điểm hạn chế phƣơng pháp DNA tổng số sau tách chiết đƣợc kiểm tra kích thƣớc điện di gel agarose 1%, sau hiển thị kết điện di máy quét gel chụp ảnh kết Hình 4.6 Kết điện di sản phẩm DNA vi khuẩn tách chiết phƣơng pháp xử lý nhiệt Ghi chú: Ladder 100 bp, DT, S, T, E, B, V (các chủng Bt phân lập từ mẫu chế phẩm) 4T1 (chủng tiêu chuẩn) 43 Với quy trình tách DNA phƣơng pháp xử lý nhiệt, kết điện di DNA tổng số gel agarose cho thấy băng vạch cịn ngun vẹn, khơng bị đứt gãy Mặc dù độ tinh DNA tổng số chƣa đƣợc cao, nhiênđây phƣơng pháp dễ làm, không tốn thời gian (khoảng 15 phút chuẩn bị), không phụ thuộc vào hóa chất đặc thù… Và chúng tơi tiến hành kiểm tra phản ứng PCR sử dụng DNA tách chiết từ phƣơng pháp cho kết khả quan Do sử dụng phƣơng pháp xử lý nhiệt để tách chiết DNA vi khuẩn 4.4.2 Xác định vi khuẩn Bt dựa vào PCR sử dụng mồi đặc hiệu loài Để xác nhận chủng phân lập Bt Bacillus thuringiensis cấp độ phân tử, xác định diện số gen đặc trƣng cho vi khuẩn Bt, bao gồm gen GroEL, GyrB, XRE phƣơng pháp PCR (Chelliah et al., 2019) Các kết đƣợc hiển thị hình sau Hơn nữa, tính đặc hiệu đoạn mồi (gen XRE, gen gyrB, gen GroEL) Bt đƣợc xác định cách thực PCR nhóm khơng phải Bt bao gồm ATCC79530 (Bacillus subtilis), NT 1.8 (B amyloliquefaciens), ATCC 25923 (S aureus), ATCC 85922 (E coli) Kết cho thấy khuếch đại cụ thể đoạn ~ 246 bp (gen XRE); ~ 600 bp (GroEL); ~ 221bp (gen gryB) đƣợc phát chủng B thuringiensis tiêu chuẩn (4T1, 4T4, 4D4) chủng Bt phân lập (T) Hình 4.7 Sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu cho gen XRE 44 Ghi chú: Đối chứng âm: DW (nƣớc cất); Đối chứng dƣơng: 4T1, 4T4, 4D4; Đối chứng âm ATCC79530 (Bacillus subtilis), NT 1.8 (B amyloliquefaciens), ATCC 25923 (S aureus), ATCC 85922 (E.coli); Chủng Bt phân lập: T, V, E, S, B, DT, BM Kết cho thấy chủng tiêu chuẩn (4T1, 4D4, 4T4) chủng Bt phân lập xuất băng DNA đặc hiệu, kích thƣớc ~ 246 bp tƣơng ứng với gen XRE (7/7 chủng nghiên cứu, tỉ lệ 100%), nhóm vi khuẩn khơng phải Bt (Bacillus subtilis, B Amyloliquefaciens, S Aureus, E.coli) không xuất băng đặc hiệu ( 0/4, tỉ lệ 0%) Điều cho thấy độ xác XRE 100% để phát B thuringiensis số nhóm vi khuẩn đƣợc thử nghiệm Hình 4.8 Sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu cho gen GyrB Ghi chú: Đối chứng âm: DW (nƣớc cất); Đối chứng dƣơng: 4T1, 4T4, 4D4; Đối chứng âm ATCC79530 (Bacillus subtilis), NT 1.8 (B amyloliquefaciens), ATCC 25923 (S aureus), ATCC 85922 (E.coli); Chủng Bt phân lập: T, V, E, S, B, DT, BM Kết cho thấy chủng tiêu chuẩn (4T1, 4D4, 4T4) chủng Bt phân lập xuất băng DNA đặc hiệu, kích thƣớc ~ 221 bp tƣơng ứng với gen GyrB (6/6 chủng đƣợc nghiên cứu, tỉ lệ 100%) Tƣơng tự nhƣ vậy, nhóm vi khuẩn khơng phải Bt (Bacillus subtilis, B Amyloliquefaciens, S Aureus, E.coli) không xuất băng DNA đặc hiệu (0/4, tỉ lệ 0%) Do đó, mồi GyrB đƣợc cho đặc hiệu Bacillus thuringiensis 45 Hình 4.9 Sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu cho gen GroEL Ghi chú: Đối chứng âm: DW (nƣớc cất); Đối chứng dƣơng: 4T1, 4T4, 4D4; Đối chứng âm ATCC79530 (Bacillus subtilis), NT 1.8 (B amyloliquefaciens), ATCC 25923 (S aureus), ATCC 85922 (E.coli); Chủng Bt phân lập: T, V, E, S, B, DT, BM Kết cho thấy chủng tiêu chuẩn (4T1, 4D4, 4T4) chủng Bt phân lập xuất băng DNA đặc hiệu, kích thƣớc 600 bp (6/6 chủng nghiên cứu, tỉ lệ 100%) Và nhóm vi khuẩn khơng phải Bt (Bacillus subtilis, B Amyloliquefaciens, S Aureus, E.coli) không xuất băng đặc hiệu (0/4, tỉ lệ 0%) Do mồi GroEL đƣợc cho đặc hiệu Bt Kết luận: Sau xác định kỹ thuật PCR điện di với đoạn mồi đặc hiệu, xác định đƣợc chủng phân lập T B thuringiensis xuất băng DNA có kích thƣớc ~ 246 bp, ~ 600bp ~ 221 bp băng đặc trƣng đoạn mồi tƣơng ứng XRE, GroEL, GryB, chủng cịn lại khơng xuất băng khơng phải B thuringiensis 4.5 Khẳng định vi khuẩn Bt dựa vào PCR sử dụng mồi gen sinh tinh thể có mặt protein tinh thể độc Nhiều tài liệu chứng minh Bt sản xuất cách chọn lọc protein tinh thể diệt trùng, đƣợc sử dụng nhƣ chất đánh dấu thích hợp để nhận dạng thích hợp (Bioeng B, 2010) Chủng phân lập T sau đƣợc xác định phƣơng pháp nhƣ xác định hình thái khuẩn lạc, tế bào, phản ứng sinh 46 hóa gen đặc hiệu sau đƣợc khẳng định cách kiểm tra có mặt gen mã hóa tinh thể độc Cry2 protein tinh thể độc Hình 4.10 Sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu cho gen Cry2 Blank: DW (nƣớc cất); Đối chứng dƣơng: 4T1, 4T4, 4D4; Đối chứng âm ATCC79530 (Bacillus subtilis), NT 1.8 (B amyloliquefaciens), ATCC 25923 (S aureus), ATCC 85922 (E.coli); Chủng Bt phân lập: V, E, S, B, T, DT Trong nghiên cứu này, mồi Cry2 xuất băng ~700 bp - băng đặc trƣng cho kích thƣớc gen Cry2 chủng Bt phân lập chủng tiêu chuẩn (4T1, 4D4, 4T4) (6/6 chủng nghiên cứu, tỉ lệ 100%) Nhóm khơng phải Bt (Bacillus subtilis, B Amyloliquefaciens, S Aureus, E.coli) cho thấy tỷ lệ khuếch đại 0% (0/4, tỉ lệ 0%) Do đó, chúng tơi mong đợi diện protein tinh thể chủng phân lập (T) Để kiểm tra khả sinh tinh thể bào tử độc, khuẩn lạc môi trƣờng T3 đƣợc kiểm tra khả sinh nội bào tử qua dung dịch Coomassie Brilliant Blue quan sát dƣới kính hiển vi Kết bào tử tinh thể chủng phân lập T đƣợc thể Hình 4.13 Mơ tả tinh thể bào tử Các dòng phân lập cho thấy đặc điểm tinh thể bào tử giống nhƣ dòng Bt tiêu chuẩn, bao gồm: - Tinh thể có hình thoi, hình trịn, hình lệch tâm nhiều hình dạng khác - Bào tử hình trụ hình trứng, đầu có màu, đầu cịn lại khơng nhuộm, dù bên hay bên 47 - Tế bào hoàn toàn nhuộm màu, hình trụ Chủng tiêu chuẩn (4T1) Chủng phân lập (T) Hình 4.11 Hình ảnh nhuộm bào tử tinh thể chủng tiêu chuẩn 4T1 chủng phân lập T Kết luận: chủng tiêu chuẩn chủng phân lập T có diện protein tinh thể dạng hình trám, hình thoi với nhiều kích thƣớc khác Kết luận chung: kết hợp tất kết thu đƣợc đặc điểm hình thái, sinh hóa, PCR với mồi đặc hiệu cho lồi nhuộm protein tinh thể độc ta khẳng định chủng phân lập T Bacillus thuringiensis 4.6 Tính tốn tổng số vi khuẩn B thuringiensis mẫu chế phẩm Tổng số N vi khuẩn B thuringiensis đƣợc nhận dạng/khẳng định có mẫu thử đƣợc tính theo cơng thức: Bảng 4.7 Tổng số vi khuẩn B thuringiensis mẫu thử Đĩa Đĩa Thể tích dịch (Khuẩn ( Khuẩn mẫu cấy vào lạc/ đĩa) lạc/ đĩa) đĩa (ml) 10 -4 489 520 0,01 10 -5 435 450 0,01 10 -4 365 392 0,01 Cơng thức thí nghiệm 1: 1: 29 48 N (CFU/ g) 8,6x 10 6,7x 10 1: 39 1: 49 1: 59 10 -5 345 342 0,01 10 -4 265 224 0,01 10 -5 226 185 0,01 10 -4 90 150 0,01 10 -5 74 124 0,01 10 -4 20 40 0,01 10 -5 18 29 0,01 4,1x 10 2x 10 4,9x 10 4,4 x 10 Trung bình Kết bảng 4.7 cho thấy số lƣợng vi khuẩn trung bình 1g chế phẩm “TRIBI – Thằn lằn chúa” 4,4 x 10 CFU/g cao kết in bao bì 1x 10 Theo TCVN 7304-1 : 2003, số lƣợng vi khuẩn chế phẩm vi sinh vật dạng bột khơng nhỏ 1x 10 CFU/g, kết luận số lƣợng vi khuẩn chế phẩm sinh học “TRIBI – Thằn lằn chúa” đặt tiêu chuẩn 49 CHƢƠNG V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - Với phƣơng pháp phân lập vi khuẩn Bt từ chế phẩm sinh học "TRIBI – Thằn lằn chúa" đề nghị sử dụng phƣơng pháp sau: hòa tan mẫu với NaCl 0,85% theo tỷ lệ 1:39 , xử lý mẫu 80°C thời gian phút, sau ni cấy 10 µl dung dịch mẫu nồng độ pha loãng 10 -5 mơi trƣờng LB - Kết phân tích đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào đặc điểm sinh hóa chủng phân lập T thể khuẩn lạc đơn lẻ, gram dƣơng, phản ứng dƣơng tính với thử nghiệm lethicinase, sucrose catalase Bên cạnh chủng phân lập T hình thành bào tử đặc điểm chi Bacillus, đặc biệt Bacillus thuringiensis - Tách chiết DNA phƣơng pháp xử lý nhiệt dƣờng nhƣ phƣơng pháp đơn giản, hiệu thuận tiện để tách chiết DNA vi khuẩn - Phân tích PCR cụ thể theo loài với gen đặc hiệu XRE, GroEL, GyrB gen sinh tinh thể Cry2 cho thấy độ đặc hiệu cao B thuringiensis - Sự diện protein tinh thể chủng phân lập T phƣơng pháp nhuộm protein tinh thể, khẳng định chủng phân lập T B Thuringiensis 5.2 Kiến nghị - Bổ sung thêm xét nghiệm sinh hóa khác: kiểm tra Esculin, thử nghiệm lên men salicin - Phƣơng pháp multiplex PCR đƣợc sử dụng để xác định xác vi khuẩn Bt 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tài liệu tiếng việt Trƣơng Phúc Hƣng (2010) Nghiên cứu nhân xác định trình tự gen cry1Ab, cry1Ac mã hóa protein tinh thể diệt trùng có vảy từ chủng Bacillus thuringiensis phân lập từ số mẫu đất tỉnh Thái Ngun Ngơ Đình Bính (2005) Đặc điểm chủng Bacillus thuringiensis Bộ sƣu tập Bacillus thuringiensis Việt Nam, Kỷ yếu Hội nghị Vành đai Thái Bình Dƣơng lần thứ Cơng nghệ Sinh học Bacillus thuringiensis Tác động Môi trƣờng Nguyễn Thị Thơm, Nguyễn Văn Bình, Trần Băng Diệp, Hoàng Đăng Sáng, Trần Xuân An, Hoàng Phƣơng Thảo, Trần Minh Quỳnh (2017) Nghiên cứu sử dụng xạ gamma để khử hoạt tính bào tử Bacillus thuringiensis thuốc trừ sâu sinh học Khoa học Công nghệ hạt nhân Tập (1) trang 43-48 Tạp chí Khoa học Công nghệ Việt Nam (2020) Nguy dịch, bệnh hại trồng định hƣớng phòng chống Truy cập từ https://vjst.vn/vn/_layouts/15/ICT.Webparts.TCKHCN/mt_poup/Intrangweb aspx?IdNews=3280 ngày 26/05/2020 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 6404: 2016 (2013) Vi sinh thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Yêu cầu chung hƣớng dẫn kiểm tra vi sinh Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9330-2 (2012) Xác định độ tin cậy số đếm khuẩn lạc đĩa song song bƣớc pha loãng liên tiếp B Tài liệu tiếng anh Alaeddinolu Fasang (1998) A rapid and simple method for staining of the crystal protein of Bacillus thuringiensis Journal of Industrial Microbiology Vol pp 227-229 Navon, A (2000) Bacillus thuringiensis insecticides in crop protectionreality and prospects, Crop Protection, 19, pp669-676 Lacey, L.A., Frutos, R., Kaya, H.K & Vail, P (2001) Insect pathogens as biological control agents: Do they have a future? Biological Control, 21, pp230-248 Bauce, E., Carisey, N., Dupont, A & van Frankenhuyzen (2004) Bacillus thuringiensis subsp kurstaki aerial spray prescriptions for balsam fir stand protection against spruce.pp621-630 Crickmore (2006) Beyond the spore - past and future developments of Bacillus thuringiensis as a biopesticide Journal of Applied Microbiology, 101, pp616-619 51 Pugliara A., (2016) Elaboration of thin nanocomposite layers based on Ag nanopartiles embedded in silica for controlled biocide properties Angela R Schug, B.A., Meurer M., Anissa D.Scholtzek, Brombach J., Hensel.V,Fanning.S, Schwarz S., Andrea T Feßler (2020) Comparison of two methods for cell count determination in the course of biocide susceptibility testing Veterinary Microbiology Vol 251 Arthur I., William B., Peter D.,(1986) Bacillus thuringiensis and Related Insect Pathogens American Society for Microbiology, Vol 50 (1) Microbiogical Reviews pp 1-24 Mukhija B., & Khanna V., (2018) Isolation, characterization and crystal morphology study of bacillus thuringiensis isolates from soils of Punjab Journal of Pure and Applied Microbiology Vol 12 (2) pp 189-193 10 Chang Y.H., Shangkuan Y.H., Lin H.C & Liu H.W (2003) PCR Assay of the groEL Gene for Detection and Differentiation of Bacillus cereus Group Cells Applied and environmental microbiology Vol 69 (8) pp 4502–4510 11 Chelliah R., Wei S., Park B J., Rubab M., Banan Mwine Dalirii E., Barathikannan K., Jin Y G., & Oh D H (2019) Whole genome sequence of Bacillus thuringiensis ATCC 10792T Agricultural Microbiome R&D Program 12 Mullane E.G., A.A., Petruzzello M., (2017) Bacillus thuringiensis Encyclopedia Britannica Retrieved on 17th May 2022 at https://www.britannica.com/science/Bacillus-thuringiensis 13 Porcar, Victor J.,(2003) PCR-based identification of Bacillus thuringiensis pesticidal crystal genes FEMS Microbiology Reviews Vol 26 (5) pp 419432 14 Marie T Esselmann and Pinghui V Liu (1961) Lecithinase production by gram-negative bacteria J Bacteriol Vol 81(6) pp 939-945 15 Rabha M., S.S., Acharjee S and Sarmah (2017) Isolation and characterization of Bacillus thuringiensis strains native to Assam soil of North East India Biotech Vol 7(5) pp 303 16 Mohammed S., Alishtayeh and Yahya R.F., (2000) Laboratory Experiments in General Microbiology 2nd ed 17 Sohrabi M., (2016) The yield and quality of cellular and bacterial DNA extracts from human oral rinse samples are variably affected by the cell lysis methodology Journal of Microbiological Methods 18 National Agency for Science and Technology Information Biopesticides towards sustainable agriculture Number 06 52 (2015) 19 Thorne C B (1993) Bacillus anthracis In: Sonenshein A L, Hoch J A, Losick R, editors Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria Washington, D.C.: American Society for Microbiology; pp 113– 124 20 Carozzi N.B, Kramer V.C, Warren G.W, Evola S Koziel M.G (1991) Prediction of insecticidal activity of Bacillus thuringiensis strains by polymerase chain reaction product profiles Appl Environ Microbiol 57, 3057– 3061 21 Park, S., Kim, H., Kim, J., Kim, T., and Kim, H (2007) Simultaneous detection and identification of Bacillus cereus group bacteria using multiplex PCR J Microbiol Biotechnol 17, 1177–1182 22 Böhm, M.-E., Huptas, C., Krey, V M., and Scherer, S (2015) Massive horizontal gene transfer, strictly vertical inheritance and ancient duplications differentially shape the evolution of Bacillus cereus enterotoxin operons hbl, cytK and nhe BMC Evol Biol 15:246 doi: 10.1186/s12862-015-0529-4 23 Osman, G., Already, R., Assaeedi, A., Organji, S., El-Ghareeb, D., Abulreesh, H., et al (2015) Bioinsecticide Bacillus thuringiensis a comprehensive review Egyptian J Biol Pest Control 25, 271–288 24 Lone, S A., Malik, A., & Padaria, J C (2017) Characterization of lepidopteran-specific cry1 and cry2 gene harbouring native Bacillus thuringiensis isolates toxic against Helicoverpa armigera Biotechnology Reports 15, pp27-32 25 Sauka, D H., Amadio, A F, Zandomeni, R O., & Benintende, G B (2007) Strategy for amplification and sequencing of insecticidal cry1A genes from Bacillus thuringiensis Antonie van Leeuwenhoek 91(4), pp423-430 26 Kalman S Kiehne K.L Libs J.L Yamamoto T (1993) Cloning of a novel cryIC-type gene from a strain of Bacillus thuringiensis subsp galleriae Appl Environ Microbiol.59, pp1131–1137 27 Schnepf, E., Crickmore, N., Van Rie, J., Lereclus, D.,Baum, J., Feitelson, J., Zeigler, D R., & Dean, D H (1998) Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins Microbiology and Molecular Biology Reviews 62(3), pp775-806 28 Obeidat, B., Masa’deh, R and Abdallah, A (2004) The Relationship among Human Resource Management Practices, Organizational Commitment, and Knowledge Management Processes: A Structural Equation Modeling Approach International Journal of Business and Management – 26 29 Peng, P.C., Hassan Samee, M.A., Sinha, S (2015) Incorporating Chromatin Accessibility Data into Sequence-to-Expression Modeling Biophys J 108(5): 1257-1267 53 30 Lambert and Peferoen ( 1992) lnsecticidal promise of Bacillus thuringiensis Bioscience 31 Mohammed, A J.; Hamodi, S J.; Alkilani, F M H., (2018) Effect of adding different levels of Annatto seed powder (Bixa orellana) in laying chicken diets on oxidation indicators Biochem Cell Arch., 18 (2): 16211624 32 Han, Z., Yi, P., Li, X., Olson, E.N (2006) Hand, an evolutionarily conserved bHLH transcription factor required for Drosophila cardiogenesis and hematopoiesis Development 133(6): 1175 1182 33 Kuo W.S Chak K.F (1996) Identification of novel cry-type genes from Bacillus thuringiensis strains on the basis of restriction fragment length polymorphism of the PCR-amplified DNA Appl Environ Microbiol.62, pp1367–1377 34 Kalman S Kiehne K.L Libs J.L Yamamoto T (1993) Cloning of a novel cryIC-type gene from a strain of Bacillus thuringiensis subsp galleriae Appl Environ Microbiol.59, pp1131–1137 35 Herrero, S., González-Cabrera, J., Tabashnik, B & Ferré, J (2001) Shared binding sites in Lepidoptera for Bacillus thuringiensis Cry1Ja and Cry1A toxins Appl Environ Microb 67, 5729–5734 36 Bravo, A., Gill, S S & Soberón, M (2007) Mode of action of Bacillus thuringiensis Cry and Cyt toxins and their potential for insect control Toxicon 49, 423–435 37 Eugene W Nester , Linda S Thomashow , Matthew Metz Milton Gordon (2002) 100 Years of Bacillus thuringiensis: A Critical Scientific Assessment Washington (DC): American Society for Microbiology 54