Nghiên cứu ứng dụng phương pháp quang phổ hồng ngoại FTIR để phân tích định lượng amoxicillin trong thuốc (tt)

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - - NGUYỄN PHI HÙNG NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HỒNG NGOẠI FTIR ĐỂ PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG AMOXICILLIN TRONG THUỐC Chuyên ngành : Kỹ thuật hóa học Mã số : 8520301 TĨM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT HÓA HỌC Đà Nẵng – 2022 THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội Cơng trình hoàn thành TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Diệu Hằng Phản biện 1: TS Phan Thế Anh Phản biện 2: PGS.TS Lê Minh Đức Luận văn bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ chuyên ngành Kỹ thuật hóa học họp Trường Đại học Bách khoa vào ngày 27 tháng năm 2022 Có thể tìm hiểu luận văn tại: - Trung tâm Học liệu Truyền thông, Trường Đại học Bách khoa – Đại học Đà Nẵng - Thư viện Hóa, Trường Đại học Bách khoa – Đại học Đà Nẵng THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội -1MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Thuốc loại hàng hố đặc biệt, có ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ người chất lượng, hiệu cơng tác phịng bệnh chữa bệnh Do chất lượng thuốc cần kiểm tra, kiểm soát chặt chẽ từ khâu sản xuất, tồn trữ, lưu thông, phân phối đến tay người dùng Chất lượng thuốc mối quan tâm tất nước giới Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), ngày có nhiều báo cáo tình trạng thuốc giả, thuốc chất lượng Vì vậy, việc kiểm soát chất lượng thuốc quan trọng Các loại thuốc lưu thông thị trường phải đảm bảo an toàn hiệu cho người sử dụng Ở Việt Nam nay, chế thị trường, Ngành Dược có thay đổi tạo thị trường thuốc phong phú, đa dạng, thuận lợi cho người sử dụng Tuy nhiên, bên cạnh nảy sinh nhiều vấn đề phức tạp cần phải giải quyết, cộm chất lượng đảm bảo chất lượng thuốc Thuốc chất lượng, thuốc giả, thuốc hết hạn dùng, thuốc không phép lưu hành xuất thị trường có chiều hướng gia tăng Việc kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc nhiệm vụ quan trọng Bộ Y tế, Cục quản lý Dược đặc biệt hệ thống kiểm nghiệm nước Hiện nay, quy trình kiểm tra chất lượng thuốc ngày hoàn thiện Cùng với nước giới, Việt Nam ban hành thường xuyên sửa đổi, bổ sung Dược điển, quy định chất lượng thuốc sản xuất lưu hành phạm vi toàn quốc Tuy nhiên, tùy thuộc vào điều kiện cụ thể phòng thử nghiệm, việc xác nhận hiệu phương pháp phân tích phù hợp với điều kiện phòng thử nghiệm sử dụng kiểm tra chất lượng thuốc bán thị trường điều cần thiết Xác nhận phương pháp phân tích nhằm mục đích chứng minh phương pháp thử nghiệm có phù hợp với mục đích cụ thể hay khơng, nói THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội -2cách khác, liệu phương pháp để phân tích định tính / định lượng loại thuốc chất liên quan dạng bào chế dược phẩm Hiện nay, xu hướng chung giới tìm cách làm giảm tác động hoạt động đến mơi trường Vì vậy, việc giảm thiểu, ngăn ngừa loại bỏ chất thải trình hoạt động điều cần thiết Nhu cầu phát triển lĩnh vực hóa học xanh tăng lên đáng kể trở thành thách thức lớn cho nhà hóa học để tạo sản phẩm mới, quy trình dịch vụ đạt yêu cầu mục tiêu xã hội, kinh tế môi trường cấp thiết tăng nhận thức an tồn mơi trường, kiểm tra ô nhiễm môi trường, bền vững sinh thái công nghiệp cơng nghệ sản xuất tồn giới Trong kiểm nghiệm thuốc, số hành động thực hiện, chẳng hạn thay phương pháp phân tích sử dụng nhiều dung mơi hữu phương pháp khác không sử dụng chúng, thay trình tổng hợp trình an tồn, độc hại Trong năm gần đây, kỹ thuật phân tích quang phổ hồng ngoại trở thành kỹ thuật phân tích có tính ứng dụng cao cho ngành cơng nghiệp dược phẩm phương pháp phân tích nhanh, khơng cần phá hủy mẫu, khơng sử dụng hóa chất dung môi độc hại Ở Việt Nam nay, ứng dụng phương pháp quang phổ hồng ngoại kiểm nghiệm Dược phẩm thực phép thử định tính Với lý vấn đề thực tiễn trên, xin lựa chọn đề tài “Nghiên cứu ứng dụng phương pháp quang phổ hồng ngoại FTIR để phân tích định lượng Amoxicillin thuốc” Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng xác nhận giá trị sử dụng quy trình định lượng Amoxicillin phương pháp quang phổ hồng ngoại FTIR Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài - Về mặt khoa học: xây dựng quy trình phân tích định lượng Amoxicillin phương pháp quang phổ hồng ngoại FTIR, phù THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội -3hợp việc sàng lọc phân tích nhanh hàm lượng Amoxicillin dạng thuốc bào chế - Về mặt thực tiễn: quy trình phân tích nhanh, chuẩn bị mẫu đơn giản, lượng mẫu phân tích ít, khơng cần phá hủy mẫu phân tích, chi phí thấp khơng tốn dung mơi hóa chất (như phương pháp phân tích truyền thống HPLC), hạn chế sai số trình chuẩn bị mẫu nên mở rộng để phân tích nhanh hàm lượng hoạt chất mẫu thuốc thị trường Cấu trúc luận văn Luận văn gồm chương: - Chương Tổng quan: Giới thiệu Amoxicillin tá dược dược sử dụng viên nang Amoxicillin, phương pháp phân tích định lượng thuốc, xác nhận giá trị sử dụng phương pháp - Chương Thực nghiệm: Đối tượng nội dung nghiên cứu - Chương Kết thảo luận - Chương Kết luận CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Amoxicilin Amoxicilin có cơng thức phân tử: C H N O S 16 19 Amoxicilin có cấu trúc mạch vòng beta- lactam (amin nội vòng) gắn với mạch ngang R-CO-NH, gọi amin 6-Amino penicillanie (A.6.A.P) có cơng thức chung R–C9H11N2O4S Amoxicilin chất bột kết tinh màu trắng, dễ bị phá hủy mơi trường oxi hóa, mơi trường có tính kiềm nhiệt độ cao, tác dụng nước, men penicillin naza (do vi khuẩn đường ruột hay vi khuẩn Gram âm sinh ra) THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội -4Amoxicilin thuộc nhóm penicillin, loại aminopenicilin, bền mơi trường acid, có phổ tác dụng rộng, đặc biệt có tác dụng chống trực khuẩn Gram âm Tương tự penicilin khác, amoxicilin tác dụng diệt khuẩn, ức chế sinh tổng hợp mucopeptid thành tế bào vi khuẩn In vitro, amoxicilin có hoạt tính với phần lớn loại vi khuẩn Gram âm Gram dương như: Liên cầu khuẩn, tụ cầu khuẩn không tạo penicilinase, H influenzae, Diplococcus pneumoniae, N gonorrheae, E coli, Proteus mirabilis Amoxicillin bào chế dạng viên nén, viên nang bột pha hỗn dịch uống Ngồi ra, kết hợp với sulbactam acid clavulanic, chất ức chế beta – lactamase, để điều trị bệnh nhiễm trùng vi khuẩn 1.2 Các tá dược thường sử dụng viên nang Amoxicilin 1.2.1 Natri croscarmellose Công thức cấu tạo: Natri croscarmellose dùng làm tá dược rã thuốc Lượng sử dụng viên nén: 0,5 – 5%, viên nang: 10 – 25% (kl/kl) 1.2.2 Natri lauryl sulfat Công thức cấu tạo: Natri lauryl sulfat sử dụng làm chất hoạt động bề mặt, chất nhũ hóa, chất thấm vào da, tá dược trơn viên nén viên nang, chất làm ướt Nồng độ sử dụng làm tá dược thuốc: 1,0 – 2,0% (kl/kl) 1.2.3 Magie stearat Công thức cấu tạo: THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội -5Magnesium stearate sử dụng rộng rãi mỹ phẩm, thực phẩm dược Được dùng làm tá dược trơn – giảm ma sát cho viên nén viên nang với lượng từ 0,25% tới 5% (kl/kl) 1.3 Các phương pháp phân tích định lượng thuốc 1.3.1 Phương pháp chuẩn độ - Chuẩn độ đo - Chuẩn độ sử dụng thị màu - Phương pháp chuẩn độ đo Ampe - Định lượng kháng sinh nhóm penicilin phương pháp đo iod 1.3.2 Phương pháp quang phổ tử ngoại – khả kiến Phương pháp quang phổ tử ngoại – khả kiến dựa vào khả hấp thụ chọn lọc xạ ánh sáng chiếu vào dung dịch chất nghiên cứu dung môi định Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến gọi phương pháp quang phổ hấp thụ điện tử, phương pháp phân tích dựa hấp thụ xạ điện từ Phương pháp đơn giản, dễ tiến hành, thông dụng, ứng dụng nhiều xác định hàm lượng hoạt chất 1.3.3 Phương pháp quang phổ hấp thụ phát xạ ❖ Phương pháp quang phổ phát xạ nguyên tử Phương pháp quang phổ phát xạ nguyên tử phương pháp xác định nồng độ nguyên tố chất cách đo cường độ vạch phát xạ nguyên tử nguyên tố hóa từ chất Việc xác định nồng độ nguyên tố tiến hành bước sóng tương ứng với vạch phát xạ ❖ Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử phương pháp xác định nồng độ nguyên tố chất cách đo độ hấp thụ xạ nguyên tử tự nguyên tố hóa từ chất thử Việc định lượng tiến hành bước sóng vạch hấp thụ nguyên tố cần xác định THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội -61.3.4 Các phương pháp sắc ký ❖ Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Sắc ký lỏng phương pháp tách sắc ký chất dựa phân bố khác chúng hai pha khơng trộn lẫn, pha động chất lỏng chảy qua pha tĩnh chứa cột Pha tĩnh chứa cột chất rắn phân chia dạng tiểu phân chất lỏng phủ lên chất mang rắn, hay chất mang biến đổi liên kết hóa học với nhóm hữu Sắc ký lỏng tiến hành chủ yếu dựa chế hấp phụ, phân bố khối lượng, trao đổi ion, loại trừ theo kích thước tương tác hóa học lập thể Đây phương pháp phổ biến, ứng dụng rộng rãi để định tính, định lượng hoạt chất thuốc Phương pháp có độ xác, độ nhạy cao, giới hạn phát thấp ❖ Phương pháp sắc ký lớp mỏng Phương pháp sắc ký lớp mỏng dùng để định tính, thử tinh khiết đơi để bán định lượng định lượng hoạt chất thuốc 1.4 Phương pháp quang phổ hồng ngoại Phương pháp phân tích phổ hồng ngoại (FTIR) kỹ thuật phân tích hiệu Các hợp chất hố học có khả hấp thụ chọn lọc xạ hồng ngoại Sau hấp thụ xạ hồng ngoại, phân tử hợp chất hoá học dao động với nhiều tần số dao động xuất dải phổ hấp thụ gọi phổ hấp thụ xạ hồng ngoại Các đám phổ khác có mặt phổ hồng ngoại đặc trưng cho nhóm chức liên kết có phân tử, vào để nhận dạng chúng Một ưu điểm quan trọng phương pháp phổ hồng ngoại vượt trội phương pháp phân tích cấu trúc khác (nhiễu xạ tia X, cộng hưởng từ điện tử,…) phương pháp cung cấp thông tin cấu trúc phân tử nhanh, khơng địi hỏi phương pháp tính tốn phức tạp THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội -71.4.1 Cách chuẩn bị mẫu đo phổ hồng ngoại Một lợi vượt trội phương pháp phổ hồng ngoại (FTIR) phân tích hầu hết dạng vật chất như: chất lỏng, dung dịch, bột nhão, bột khơ, phim, sợi, khí bề mặt… Các kỹ thuật chụp gồm: truyền qua, phản xạ, tán xạ, phản xạ suy giảm toàn phần kỹ thuật truyền qua sử dụng nhiều Phổ FTIR hợp chất ghi pha hơi, pha lỏng hay pha rắn 1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu đo phổ hồng ngoại Tín hiệu đo phổ hồng ngoại đặc trưng cho tần số dao động phân tử Do phổ hồng ngoại bị ảnh hưởng yếu tố sau: - Ảnh hưởng cấu trúc phân tử: tần số dao động phân tử phụ thuộc vào bền vững liên kết, hiệu ứng electron, hiệu ứng không gian liên kết nội phân tử - Ảnh hưởng tương tác phân tử: trạng thái khí phân tử chuyển động tự khơng có tương tác với nên phổ hồng ngoại chất thể kí phản ánh trung thực cấu trúc phân tử - Ảnh hưởng cường độ hình dạng vân phổ hồng ngoại: phương pháp định lượng phổ hồng ngoại có độ xác khơng cao cịn hệ số hấp thu mol lặp lại lần đo Ngoài trình ép viên mẫu khó xác định xác độ dày viên mẫu (do viên mẫu có kích thước tầm vài µm) Bên cạnh trạng thái vật lý, dung mơi, nhiệt độ, đóng góp vào ảnh hưởng đến cường độ, hình dạng peak hợp chất 1.4.3 Ứng dụng phương pháp quang phổ hồng ngoại - Định tính chất: Trước ghi phổ hồng ngoại, nói chung ta có nhiều thơng tin hợp chất hỗn hợp cần nghiên cứu, như: trạng thái vật lý, dạng bên ngồi, độ tan, điểm nóng chảy, điểm cháy Nếu cần biết mẫu chất ngun chất hay hỗn hợp Sau ghi phổ hồng ngọai, chất nghiên cứu hợp THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội -8chất hữu trước tiên nghiên cứu vùng dao động co giãn H để xác định xem mẫu thuộc loại hợp chất vòng thơm hay mạch thẳng hai Sau nghiên cứu vùng tần số nhóm để xác định có hay khơng có nhóm chức - Xác định độ tinh khiết sản phẩm: Phổ hồng ngoại dùng để xác định độ tinh khiết chất Phổ hồng ngoại chất khơng tinh khiết thường độ rõ nét đám phổ riêng biệt bị giảm, xuất thêm đám phổ làm "nhoè" phổ Khi tạp chất hấp thụ mạnh IR mà thành phần khơng hấp thụ hấp thụ yếu việc xác định thuận lợi - Phân tích định lượng: Phân tích định lượng phổ hồng ngoại thường khó xác, nhiên áp dụng với mẫu tinh khiết dựa vào định luật Lambert-Beer xây dựng đường chuẩn Khả ứng dụng phổ FTIR để phân tích định lượng phụ thuộc trang thiết bị trình độ phịng thí nghiệm 1.4.4 Một số nghiên cứu ứng dụng phổ hồng ngoại để định lượng hoạt chất thuốc - Andréia de Haro Moreno cộng tiến hành định lượng Ceftazidime phương pháp phổ hồng ngoại mẫu dược phẩm dạng bột pha tiêm việc khảo sát cường độ hấp thụ đỉnh peak đặc trưng cho vòng thơm vùng 1475 – 1600 cm-1 Kết cho thấy tá dược khơng làm ảnh hưởng đến độ xác phép phân tích Đường chuẩn thiết lập khoảng nồng độ 0,5 – 0,7 mg, phần trăm hiệu suất thu hồi 98,98 ± 0,70 - Tác giả Macedo Vieira cộng sử dụng phương pháp phổ hồng ngoại để định lượng cefuroxime dạng bột dùng để tiêm, phương pháp đo cường độ hấp thụ đỉnh peak hấp thụ đặc trưng cho vòng thơm vùng từ 1475 – 1600 cm-1 Khoảng tuyến tính xác định từ 5,0 – 20,0 μg/ml (phương trình hồi qui: y=0,5053x + 0,0114; r2 = 0,9991) Độ xác phương pháp cho tốt với giá trị RSD gần %, không lớn 5% - Eliane Gandolpho Tótoli cộng phân tích định lượng Natri Ampicilin dạng bột dùng để tiêm phương pháp phổ THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội -9FTIR đo cường độ hấp thụ đỉnh peak đặc trưng cho nhóm cacbonyl phân tử vùng 1800 – 1700 cm-1 Hệ số tuyến tính r2 = 0,9993, khoảng nồng độ – mg/viên - S.T.H.Sherazi sử dụng phương pháp hồng ngoại biến đổi Fourier để xác định roxithromycin từ phổ mẫu thuốc kết hợp với phương pháp hồi quy phân tích thống kê đa biến Phương pháp cho phép rút ngắn thời gian phân tích xuống cịn khoảng phút nên phù hợp để áp dụng kiểm tra nhanh mẫu 1.5 Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp (Thẩm định phương pháp) khẳng định việc kiểm tra cung cấp chứng khách quan chứng minh phương pháp đáp ứng yêu cầu đặt (fitness for the purpose) Theo quy định USFDA, AOAC, USP ICH, phương pháp phân tích hóa học thơng số cần thẩm định bao gồm: - Tính đặc hiệu/ tính chọn lọc - Khoảng tuyến tính - Giới hạn phát (Limit of Detection – LOD) - Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation – LOQ) - Độ (Trueness) - Độ chụm (Precision) - Độ vững (Robustness) hay độ ổn định (Ruggedness) Việc lựa chọn thông số thẩm định tùy thuộc vào kỹ thuật áp dụng phương pháp, yêu cầu phương pháp, điều kiện nguồn lực phòng thử nghiệm Từng trường hợp cụ thể thông số thẩm định có khác CHƯƠNG THỰC NGHIỆM Mục đích nghiên cứu thực nghiệm: - Định lượng Amoxicilin phương pháp FTIR; - So sánh với phương pháp định lượng Amoxicilin phương pháp HPLC theo quy trình DĐVN 5; THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội - 10 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Thiết bị, dụng cụ - Máy quang phổ hồng ngoại Shimadzu IRAffinity - 1S (Japan) máy ép viên (lực ép tối đa 10 tấn) - Cân phân tích số lẻ Mettler Toledo MS205DU, d=0.01mg (Switzerland) - Máy sắc ký lỏng hiệu cao Dionex Thermo Ultimate 3000 (USA) 2.1.2 Hóa chất, thuốc thử - Chất chuẩn Amoxicillin, Viện kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh, Số lơ: QT010 140719, Hàm lượng: 87,2% (nguyên trạng) - Mẫu thử: viên nang Amoxicilin 500mg, nhà sản xuất Mekophar, số đăng ký VD - 20020 - 13, số lô 19035AN, ngày sản xuất 03/10/2019, hạn dùng 03/04/2022; công thức bào chế đăng ký: Amoxicilin, tá dược Magnesi stearat - Các chất tá dược thường sử dụng viên nang Amoxicilin: Natri lauryl sulfat (Merck); Magie stearat (Sigma Aldrich); Natri croscarmellose (Himedia) - Kali bromua (KBr) loại tinh khiết phân tích IR: hãng sản xuất Merck Prolabo 2.2 Nội dung nghiên cứu 2.2.1 Khảo sát điều kiện định lượng Amoxicillin Tất thử nghiệm thực phịng thí nghiệm với điều kiện: nhiệt độ 25 ± 10C, độ ẩm: 50 – 55 %RH ❖ Lựa chọn vùng phổ hồng ngoại để định lượng Amoxicillin - Sấy KBr 1050C đến khối lượng không đổi - Mẫu chuẩn: cân xác 4,0 mg chuẩn Amoxicilin, đồng với 196mg KBr, nén thành viên có đường kính 13 mm - Mẫu thử: cân bột thuốc tương ứng 4,0 mg Amoxicilin, đồng với 196,0 mg KBr tiến hành ép viên tương tự mẫu chuẩn - Các mẫu tá dược: viên nén độc lập chứa tá dược: Natri croscarmellose, Natri lauryl sulfat Magie stearat Với nồng độ 1,0 THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội - 11 mg/viên (1,0 mg thành phần đồng với 199,0 mg KBr tiến hành tương tự mẫu thử mẫu chuẩn) - Quét phổ mẫu vùng từ 4000 đến 400 cm-1 - So sánh phổ thu từ mẫu chuẩn, mẫu thử mẫu tá dược Lựa chọn vùng phổ đặc trưng Amoxicillin mà không bị ảnh hưởng tá dược để tiến hành định lượng Amoxicilin ❖ Khảo sát tỉ lệ khối lượng mẫu /KBr - Tiến hành trộn chất chuẩn Amoxicillin với KBr theo tỷ lệ khối lượng mẫu KBr x/y với x= 1→10 y = 100 - x - Lựa chọn tỷ lệ có độ hấp thụ phù hợp với điều kiện phân tích ❖ Khảo sát khối lượng mẫu dùng để nén viên độ lặp lại trình nén viên Lượng mẫu ép viên ảnh hưởng đến bề dày viên, có ảnh hưởng trực tiếp đến độ hấp thụ quang hoạt chất Để thu viên nén có đường kính 13 mm, tiến hành khảo sát lượng mẫu dùng ép viên để thu viên nén có độ hấp thụ phù hợp 2.2.2 Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp Tiến hành xác nhận giá trị sử dụng phương pháp phân tích với thơng số: tính tuyến tính, độ xác, độ đúng, độ ổn định độ chọn lọc, theo yêu cầu AOAC ❖ Độ tuyến tính - Chuẩn bị viên chuẩn có nồng độ khác - Đo độ hấp thụ, xây dựng đường hồi quy tuyến tính, tính hệ số tương quan phân tích phương sai để xác định phù hợp dựa kết khảo sát ngày khác ❖ Độ chụm Độ chụm đánh giá dựa độ lặp lại (trong ngày) độ xác trung gian (giữa ngày phân tích) - Độ lặp lại: đồng KBr mẫu thử Amoxicilin theo tỷ lệ khảo sát Ép thành 06 viên nén khác nhau, đo độ hấp thụ điều kiện phịng thí nghiệm ngày Xác định hàm lượng Amoxicilin mẫu thử Tính giá trị độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) kết thu THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội - 12 - Độ xác trung gian ngày thực cách phân tích lặp lại 06 mẫu thử Amoxicillin vào hai ngày khác nhau, điều kiện thí nghiệm Tương quan hàm lượng Amoxicilin mẫu thử ngày khác đánh giá phân tích phương sai ANOVA ❖ Độ Chuẩn bị viên nén thử thêm chuẩn ba mức nồng độ R1, R2 R3 tương ứng 80, 100 120% nồng độ làm việc phương pháp, nồng độ tiến hành lần Tính tỷ lệ thu hồi mẫu chuẩn thêm vào ❖ Tính chọn lọc Tính chọn lọc phân tích để xác minh khả phương pháp định lượng thuốc có mặt tá dược dạng bào chế viên nang Phương pháp sử dụng mô tả phần lựa chọn vùng phổ hồng ngoại để định lượng Amoxicillin ❖ Độ ổn định Các thông số đánh giá: nhiệt độ phòng làm việc (250C 300C), thời gian nén viên (± phút so với thời gian nén làm việc), hãng sản xuất KBr (Merck Prolabo) Tiến hành phân tích lặp lại 06 lần mẫu thử Amoxicillin điều kiện Đánh giá kết dựa so sánh điều kiện thí nghiệm t-test ❖ Độ khơng đảm bảo đo phương pháp Độ không đảm bảo đo phương pháp tính dựa kết thẩm định độ độ thu hồi (đánh giá độ không đảm bảo đo theo phương pháp Top – Down) 2.2.3 Định lượng số mẫu viên nang Amoxicillin lưu hành thị trường Định lượng 10 mẫu thuốc viên nang Amoxicillin hãng sản xuất khác lưu hành địa bàn tỉnh Quảng Ngãi ❖ Phương pháp phổ hồng ngoại Tiến hành định lượng Amoxicilin phương pháp FTIR dựa điều kiện phân tích khảo sát THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội - 13 - ❖ Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao theo quy trình Dược điển Việt Nam - Dung dịch đệm pH 5,0: Hòa tan 13,6 g kali dihydrophosphat 2000 ml nước, điều chỉnh tới pH 5,0  0,1 với dung dịch kali hydroxyd 45% - Pha động: Dung dịch đệm pH 5.0 - acetonitril (96 : 4) Điều chỉnh tỷ lệ acetonitril để đạt điều kiện sắc ký yêu cầu (nếu cần) - Điều kiện sắc ký: + Cột Purospher Star Rp18e (250  mm, m); + Detector quang phổ tử ngoại đặt bước sóng 230 nm; + Tốc độ dịng: 1,5 ml/min; + Thể tích tiêm: 10 l; + Nhiệt độ cột: 250C - Cách tiến hành: Kiểm tra khả thích hợp hệ thống: Tiêm dung dịch chuẩn, tính peak thu sắc ký đồ: hệ số dung lượng phải nằm khoảng 1,1 đến 2,8; số đĩa lý thuyết cột không nhỏ 1700; hệ số đối xứng không lớn 2,5 độ lệch chuẩn tương đối diện tích peak từ lần tiêm lặp lại mẫu chuẩn không lớn 2,0 % Tiêm riêng biệt dung dịch thử dung dịch chuẩn Tính hàm lượng amoxicilin, C16H19N3O5S, viên từ diện tích peak sắc ký đồ dung dịch chuẩn dung dịch thử hàm lượng C16H19N3O5S amoxicilin trihydrat chuẩn ❖ So sánh kết định lượng Amoxicillin hai phương pháp Đánh giá kết định lượng Amoxicillin cách đánh giá độ lệch chuẩn tương đối hai phương pháp THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội - 14 - CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát điều kiện định lượng Amoxicillin 3.1.1 Lựa chọn vùng phổ hồng ngoại để định lượng Amoxicillin So sánh phổ Amoxicillin phổ tá dược có thành phần viên nang Amoxicillin Hình 3.4: Phổ FTIR chuẩn Amoxicilin Quan sát thấy vùng phổ 1815 - 1730 cm−1, xuất peak đại diện cho nhóm cacbonyl Amoxicillin, khơng có ảnh hưởng tá dược Do đó, dải phổ chọn để phân tích định lượng 3.1.2 Khảo sát tỉ lệ khối lượng Amoxicilin/KBr Tiến hành cân chất chuẩn Amoxicilin lượng có hàm lượng thay đổi khoảng - 20 mg KBr (đã sấy đến khối lượng không đổi nghiền mịn) cho hàm lượng tổng gồm mẫu bột KBr 200 mg Các mẫu trộn đồng cối mã não Chuyển toàn vào dụng cụ ép viên, nén viên 10 phút, tiến hành đo chiều cao peak vùng 1815 - 1730 cm-1 Kết cho thấy, độ hấp thụ A có thay đổi lần đo Khi tăng tỷ lệ khối lượng Amoxicilin/KBr độ hấp thụ quang tăng dần Nếu độ hấp thụ quang A lớn dẫn đến sai số phép đo lớn cịn lượng mẫu q nhỏ lượng cân khơng xác Do để lựa chọn tỷ lệ phù hợp cho phương pháp phân tích, chọn tỷ lệ khối lượng Amoxicilin/KBr = 3/97 phù hợp THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội - 15 3.1.3 Khảo sát khối lượng mẫu dùng để nén viên độ lặp lại trình nén viên Để thu viên nén đường kính 13 mm có bề dày phù hợp, tiến hành khảo sát lượng mẫu đem ép viên từ 150 mg, 200 mg 250 mg Nhận thấy rằng, lượng mẫu đem ép viên tăng kéo theo độ hấp thụ tăng Tuy nhiên, cân lượng ép viên 150 mg, viên dễ bị rạn, nứt Với lượng mẫu đem ép viên lớn (250 mg), bề dày viên lớn, độ lặp lại độ hấp thụ quang (bảng kết đây) Vì vậy, lượng mẫu đem ép viên để viên nén có độ hấp thụ phù hợp 200 mg Qua khảo sát trên, ta rút điều kiện để định lượng Amoxicilin: - Tỉ lệ Amoxicilin/KBr: 3/97; - Lượng mẫu để ép thành viên nén có đường kính 13 mm: 200 mg với thời gian ép viên 10 phút; - Vùng phổ định lượng: 1815 – 1730 cm−1; - Điều kiện phịng thí nghiệm: nhiệt độ 25 ± 10C, độ ẩm 50 – 55%RH 3.2 Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp 3.2.1 Độ tuyến tính Chuẩn bị viên chuẩn có hàm lượng Amoxicilin lần lượt: 2, 4, 6, 8, 10 mg/viên Đo độ hấp thụ vào ngày khác Đường chuẩn thu cách lấy trung bình ba đường chuẩn, ta có phương trình hồi quy: y= 0,0677x + 0,0087 (với y chiều cao độ hấp thụ, x khối lượng Amoxicilin), hệ số tương quan r2= 0,9992 Giá trị r2 phù hợp với yêu cầu giá trị r2 theo hướng dẫn thẩm định chấp nhận WHO 0,800 0,700 Độ hấp thụ 0,600 y = 0,0677x + 0,0087 R² = 0,9992 0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 Khối lượng Amoxicilin THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội - 16 - Hình 3.6: Đường hồi quy tuyến tính Giá trị r phù hợp với yêu cầu giá trị r2 theo hướng dẫn thẩm định chấp nhận WHO Kết phân tích phương sai cho thấy: Significance F = 9.919E - 06 < a = 5% Do đó, phương trình hồi quy phù hợp với thực nghiệm 3.2.2 Độ chụm ❖ Độ lặp lại - Chuẩn bị 06 viên mẫu thử, hàm lượng Amoxicilin viên khoảng 6mg Đồng thời chuẩn bị viên chuẩn Amoxicilin có hàm lượng tương đương điều kiện - Tiến hành phân tích định lượng tính kết hàm lượng Amoxicilin theo công thức: Kết cho thấy hàm lượng Amoxicilin mẫu thử đạt theo yêu cầu hàm lượng DĐVN (hàm lượng Amoxicilin từ 90,0 đến 110,0% so với hàm lượng ghi nhãn) Độ lặp lại 06 viên mẫu thử đạt theo yêu cầu AOAC (RSD% ≤ 1,3) ❖ Độ xác trung gian Phân tích lặp lại viên thử tương tự độ lặp lại vào ngày khác Kết định lượng ngày khác thể bảng sau: Kết định lượng Amoxicilin 06 mẫu thử ngày có giá trị %RSD ≤ 1,3 %PRSD ≤ 2,0, cho thấy độ lặp lại độ xác trung gian phương pháp đạt yêu cầu theo quy định AOAC Phân tích thống kê ANOVA cho thấy khác kết thu ngày phân tích khơng có ý nghĩa thống kê 3.2.3 Độ (Độ thu hồi) Chuẩn bị viên nén thử thêm chuẩn KBr với lượng ép viên 200mg nồng độ 80, 100, 120% so với nồng độ định lượng (mỗi nồng độ thực viên) THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội - 17 Dựa vào độ hấp thụ thu được, hàm lượng Amoxicilin mẫu thử, hàm lượng chất chuẩn, tính độ thu hồi mẫu chuẩn thêm vào Bảng 3.8: Kết độ thu hồi TT % so với định lượng 80% Lượng cân thử (mg) KL chuẩn thêm vào (mg) Độ hấp thụ Lượng Amoxicilin định lượng (mg) Chuẩn thu hồi (mg) Tỷ lệ thu hồi (%) 3,48 1,43 0,302 4,28 1,43 99,73 3,40 1,58 0,309 4,38 1,59 100,80 3,38 1,65 0,311 4,41 1,64 99,24 3,70 3,07 0,432 6,12 3,09 100,58 100% 3,58 3,43 0,451 6,39 3,45 100,81 3,46 3,12 0,419 5,94 3,10 99,30 3,68 4,09 0,505 7,15 4,14 101,17 3,89 4,81 0,568 8,05 4,86 100,93 3,76 4,25 0,516 7,31 4,23 99,56 120% Kết cho thấy tỷ lệ thu hồi trung bình nồng độ 100,24% (từ 99,24% đến 101,17%), phù hợp với yêu cầu thẩm định phương pháp WHO 3.2.4 Độ ổn định - Phân tích 06 viên mẫu thử cách thay đổi điều kiện so với điều kiện khảo sát - Đánh giá giá trị thực nghiệm thu t -test, cách so sánh giá trị độ hấp thụ điều kiện bình thường điều kiện khác - Đối với điều kiện mơi trường phịng làm việc, thay đổi từ nhiệt độ 250C lên 310C (độ ẩm thay đổi từ 50 - 55%RH lên 65 70%RH), độ hấp thụ mẫu tăng, tStat cao tCritical (5,57 2,23), có nghĩa phương pháp khơng ổn định thay đổi điều kiện mơi trường phịng làm việc Do đó, mơi trường phịng làm việc phải kiểm soát chặt chẽ để thực phương pháp Khi tắt máy điều hòa máy hút ẩm, độ ẩm mơi trường tăng lên, ngun nhân khiến thơng số khơng ổn định THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội - 18 - Về thời gian nén viên, độ hấp thụ thu điều kiện làm việc bình thường (10 phút) so sánh riêng lẻ với điều kiện khác (8 12 phút) So sánh 10 phút cho thấy tStat tCritical 0,10 2,23 Kết khơng có ý nghĩa thống kê Thời gian nén viên lâu (10 12 phút), tStat tCritical 0,32 2,23, ý nghĩa thống kê - Liên quan đến nhãn hiệu KBr, độ hấp thụ thu từ hai nhãn hiệu khác so sánh (Merck Prolabo) Trong trường hợp này, giá trị tStat và tCritical tương ứng 1,48 2,23, khơng có ý nghĩa thống kê Như vậy, nhiệt độ độ ẩm phịng thí nghiệm thay đổi làm ảnh hưởng đến kết phân tích Trong đó, thời gian nén viên (10 ± phút) KBr hãng sản xuất khảo sát (Merck Prolabo) không ảnh hưởng đến kết phân tích Để ổn định phương pháp đo, phịng thí nghiệm cần kiểm sốt có máy điều hịa hoạt động liên tục 3.2.5 Tính đặc hiệu - Tính đặc hiệu phương pháp thể phần khảo sát vùng phổ định lượng - Ba loại tá dược thường sử dụng công ty dược để sản xuất Amoxicilin là: Natri croscamellose, Magnesi stearat natrilaurylsulfat Phổ hấp thụ tá dược không ảnh hưởng đến vùng phổ định lượng Amoxicilin - Phổ mẫu chuẩn phổ mẫu thử tương ứng có peak đặc trưng nằm khoảng 1815 – 1730 cm-1 Do đó, chứng minh tính đặc hiệu phương pháp 3.2.6 Ước lượng độ không đảm bảo đo phương pháp Ước lượng độ không đảm bảo đo phương pháp dự liệu thẩm định độ độ thu hồi độ xác trung gian Độ khơng đảm đảm bảo đo phương pháp U = 2,65% với k = 2, p = 95% 3.3 Định lượng số mẫu viên nang Amoxicilin thị trường THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội - 19 Để xác định hàm lượng Amoxicilin viên nang , tiến hành phân tích 10 mẫu thuốc nhà sản xuât khác phương pháp phổ hồng ngoại phương pháp HPLC theo dược điển Việt Nam (phương pháp đối chứng) Kết thể bảng sau: Bảng 3.14: Kết định lượng Amoxicilin viên nang phương pháp FTIR phương pháp HPLC Kết định lượng (%) Hàm lượng Ký hiệu ghi nhãn Phương pháp Phương pháp mẫu (mg) FTIR HPLC Độ chệch tương đối (%) %PRSD T1 500 96,62 99,82 3,19 1,88 T2 500 92,90 94,97 2,07 1,33 T3 250 99,83 101,61 1,78 1,39 T4 500 92,16 93,67 1,51 1,42 T5 250 97,67 98,56 0,90 0,84 T6 500 94,04 97,24 3,19 1,95 T7 500 93,65 94,93 1,28 1,18 T8 250 92,76 94,53 1,77 1,47 T9 500 95,04 97,87 2,83 1,79 Từ bảng kết cho thấy, tất mẫu thử có hàm T10 500 nằm 96,29 97,02 0,73 0,79 lượng Amoxicilin giới hạn cho phép DĐVN (90,0% đến 110,0% so với hàm lượng ghi nhãn) Độ chệch tương đối phương pháp phân tích từ 0,7 đến 3,2%; kết định lượng phương pháp tất mẫu thử có giá trị %PRSD < 2,0; cho thấy phương pháp phổ hồng ngoại áp dụng để phân tích mẫu thuốc Amoxicilin thị trường THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội - 20 KẾT LUẬN Luận văn nghiên cứu thành công việc ứng ứng dụng kỹ thuật đo phổ FTIR để định lượng hoạt chất kháng sinh Amoxicilin thuốc viên nang Các kết luận văn đạt sau: Đã lựa chọn điều kiện phù hợp phép đo phổ hồng ngoại để định lượng Amoxicilin thuốc - Mẫu đo trực tiếp dạng rắn mà khơng cần phải qua q trình xử lý mẫu Vùng phổ IR tối ưu để định lượng từ 1815 -1730cm1 Trong vùng phổ xuất peak đặc trưng nhóm Carbonyl Amoxicilin khơng bị ảnh hưởng tá dược - Tỷ lệ khối lượng trộn mẫu với KBr 3:97; khối lượng cân đem ép viên có đường kính 13 mm 200 mg - Phương pháp có ổn định thay đổi thời gian nén viên (10 ± phút) thay đổi hãng sản xuất KBr (Merk Prolabo) - Nhiệt độ độ ẩm phịng thí nghiệm ảnh hưởng đến kết phân tích Do đó, cần kiểm sốt chặt chẽ điều kiện mơi trường phịng thí nghiệm suốt q trình phân tích Kết xác nhận giá trị sử dụng phương pháp đạt theo yêu cầu AOAC hướng dẫn WHO phương pháp định lượng dược phẩm - Đường chuẩn thiết lập khoảng – 10 mg Amoxicilin/viên Phương trình hồi quy tuyến tính đường chuẩn phù hợp với thực nghiệm: y= 0,0677x + 0,0087 (với y chiều cao độ hấp thụ, x khối lượng Amoxicilin), hệ số tương quan r2= 0,9992 - Phương pháp có độ lặp lại ngày ổn định (%RSD < 1.3) độ lặp lại ngày phân tích (độ xác trung gian) đạt yêu cầu (%PRSD < 2.0) - Tỷ lệ thu hồi mẫu chuẩn từ 99,24 đến 101,17% Kết định lượng Amoxicilin viên nang hãng sản xuất khác thị trường phương pháp quang phổ hồng THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội - 21 ngoại phương pháp đối chứng cho thấy khác kết định lượng phương pháp khơng có ý nghĩa mặt thống kê Thành công nghiên cứu góp phần vào xu hướng phát triển phương pháp phân tích đơn giản, nhanh, xử lí mẫu đơn giản, không sử dụng dung môi độc hại Phương pháp ứng dụng để phân tích nhanh hoạt chất thuốc, thay phương pháp bán định lượng phương pháp sắc ký lớp mỏng áp dụng Hướng phát triển đề tài: Trên sở kết nghiên cứu đề tài, phịng thí nghiệm xây dựng thành Quy trình thao tác chuẩn (SOP) để đưa phương pháp vào áp dụng phịng thí nghiệm, đồng thời tiến hành thử nghiệm so sánh liên phịng để tạo điều kiện đưa phép phân tích khỏi phạm vi phịng thí nghiệm THƯ VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Lưu hành nội ... ? ?Nghiên cứu ứng dụng phương pháp quang phổ hồng ngoại FTIR để phân tích định lượng Amoxicillin thuốc? ?? Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng xác nhận giá trị sử dụng quy trình định lượng Amoxicillin phương pháp. .. ❖ Phương pháp sắc ký lớp mỏng Phương pháp sắc ký lớp mỏng dùng để định tính, thử tinh khiết để bán định lượng định lượng hoạt chất thuốc 1.4 Phương pháp quang phổ hồng ngoại Phương pháp phân tích. .. thí nghiệm 1.4.4 Một số nghiên cứu ứng dụng phổ hồng ngoại để định lượng hoạt chất thuốc - Andréia de Haro Moreno cộng tiến hành định lượng Ceftazidime phương pháp phổ hồng ngoại mẫu dược phẩm dạng