Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng, định tính vi khuẩn bacillus subtilis trong phân bón vi sinh

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC 🙡 🕮 🙣 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG, ĐỊNH TÍNH VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TRONG PHÂN BÓN VI SINH” Sinh viên thực : NGUYỄN THỊ HỒNG Khóa : K63CNSHD Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn : TS ĐẶNG THỊ THANH TÂM Hà Nội – 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết nghiên cứu đƣợc trình bày khóa luận trung thực, khách quan chƣa dùng bảo vệ để lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực khóa luận đƣợc cảm ơn, thơng tin trích dẫn khóa luận đƣợc ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Nguyễn Thị Hồng i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới cô TS Đặng Thị Thanh Tâm tận tình hƣớng dẫn, phân tích tận tâm giúp đỡ suốt q trình làm khóa luận Tiếp theo, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật nói riêng nhƣ thầy khoa Cơng nghệ Sinh học nói chung trực tiếp giảng dạy truyền đạt kiến thức hữu ích thời gian học tập Học viện Nông nghiệp Việt Nam Tơi bày tỏ lịng biết ơn đến Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành đề tài Cuối cùng, gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, ngƣời thân ln bên giúp đỡ động viên chỗ dựa tinh thần vững để tơi hồn thành khóa luận Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Nguyễn Thị Hồng ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC SƠ ĐỒ viii TÓM TẮT x PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích 1.3 Yêu cầu PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Khái quát chung vi khuẩn Bacillus subtilis 2.1.1 Lịch sử phát triển vi khuẩn Bacillus subtilis 2.1.2 Phân loại phân bố vi khuẩn Bacillus subtilis 2.2 Đặc điểm hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis 2.3 Đặc điểm sinh hóa vi khuẩn Bacillus subtilis 2.4 Bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis 2.4.1 Cấu tạo nội bào tử 2.4.2 Quá trình hình thành nội bào tử 2.4.3 Tác dụng nội bào tử 2.5 Cấu trúc gen vi khuẩn Bacillus subtilis 2.6 Lợi ích vi khuẩn Bacillus subtilis thực vật 2.7 Các thị phân tử xác định Bacillus subtilis 10 PHẦN NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 3.1 Địa điểm, thời gian thực đề tài 13 3.2 Vật liệu nghiên cứu 13 3.3 Nội dung nghiên cứu 14 iii 3.4 Trình tự mồi điều kiện PCR để đánh giá có mặt vi khuẩn Bacillus subtilis phân bón vi sinh 17 3.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 21 Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng nhiệt độ, môi trƣờng đến phát triển khuẩn lạc Bacillus subtilis theo thời gian 21 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu xây dựng đặc điểm hình thái khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus subtilis 22 Thí nghiệm 3: Xây dựng hồ sơ đặc điểm sinh hóa chủng Bacillus subtilis ATCC 6633 23 Thí nghiệm 4: Hiệu chỉnh phản ứng PCR mồi đặc hiệu 24 Thí nghiệm 5: Kiểm định phƣơng pháp xác định có mặt định lƣợng Bacillus subtilis dạng phân bón giải định 27 Thí nghiệm 6: Kiểm định phƣơng pháp xác định có mặt định lƣợng Bacillus subtilis dạng phân bón vi sinh 33 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 5.1 Kết luận 37 5.2 Kiến nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 iv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Diễn giải chữ viết tắt B subtilis Bacillus subtilis NA Nutrient agar LB Luria Bertani DNA Deoxyribonucleic acid PCR Polymerase chain reaction CFU Conoly forming unit CT Công thức v DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ, môi trƣờng thời gian nuôi cấy đến phát triển khuẩn lạc Bacillus subtilis ATCC 6633 theo thời gian 21 Bảng 4.2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Bacillus subtilis với Bacillus amyloliquefaciens 22 Bảng 4.3 So sánh hai quy trình hiệu chỉnh phản ứng PCR Conoly 26 Bảng 4.4 Ảnh hƣởng giai đoạn đun nóng trƣớc pha lỗng 27 Bảng 4.5 Bảng mật độ khuẩn lạc đặc trƣng (CFU/g), tỷ lệ đặc điểm hình thái sinh hóa (%), tỷ lệ khuẩn lạc có trình tự gen đặc hiệu (%) mật độ mẫu phân bón vi sinh giả định loại (CFU/g) 30 Bảng 4.6 Mật độ khuẩn lạc có hình thái đặc trƣng phân bón giả định loại 31 Bảng 4.7 Bảng mật độ khuẩn lạc đặc trƣng (CFU/g), tỷ lệ đặc điểm hình thái sinh hóa (%), tỷ lệ khuẩn lạc có trình tự gen đặc hiệu (%) mật độ mẫu phân bón giả định loại (CFU/g) 33 Bảng 4.8 Mật độ khuẩn lạc có hình thái đặc trƣng phân bón vi sinh VELOX 33 Bảng 4.9 Bảng mật độ khuẩn lạc đặc trƣng (CFU/g), tỷ lệ đặc điểm hình thái sinh hóa (%), tỷ lệ khuẩn lạc có trình tự gen đặc hiệu (%) mật độ mẫu phân bón vi sinh VELOX (CFU/g) 35 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Nội bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis Hình 3.1 Phân bón vi sinh 13 Hình 3.2 Phƣơng pháp pha lỗng nối tiếp 19 Hình 4.1 Hình thái khuẩn lạc Bacillus subtilis ATCC 6633 môi trƣờng dinh dƣỡng thời gian khác 21 Hình 4.2: Hình thái khuẩn lạc môi trƣờng NA 20h 37oC 23 Hình 4.3.Vi khuẩn bắt màu Gram (+) 23 Hình 4.4 Thử hoạt tính enzyme Catalase 23 Hình 4.5 Kết điện di thử nghiệm theo hai quy trình chủng ATCC 6633 với mồi B.sub gel agarose 2% 24 Hình 4.6 Kết điện di với thể tích dịch pha lỗng khác với mồi B.sub gel agarose 1,2% 24 Hình 4.7 Kết điện hiệu chỉnh quy trình B với mồi EN1 gel agarose 2% 25 Hình 4.8 Kết nhuộm Gram 20 khuẩn lạc phân bón giả định loại 28 Hình 4.9 Kết thử nghiệm hoạt tính enzyme Catalase từ mẫu phân bón giả định loại 28 Hình 4.10 Kết điện di khuẩn lạc với trình tự gen 16S rRNA (mồi B.sub Common) gel agarose 2% 29 Hình 4.11 Kết điện di khuẩn lạc với trình tự gen endoglucanase (mồi EN1) gel agarose 2% 29 Hình 4.12 Kết điện di mẫu giả định với trình tự gen endoglucanase (mồi EN1) gel agarose 2% 30 Hình 4.13 Kết nhuộm Gram 20 khuẩn lạc mẫu phân bón giả định loại 32 Hình 4.14 Kết thử nghiệm hoạt tính enzyme Catalase từ mẫu phân bón giả định loại 32 Hình 4.15 Kết điện di 20 khuẩn lạc mẫu phân bón giả định loại với trình tự gen 16S rRNA gel agarose 2% 32 vii Hình 4.16 Kết nhuộm Gram 20 khuẩn lạc từ mẫu phân bón vi sinh VELOX 34 Hình 4.17 Kết thử nghiệm hoạt tính enzyme Catalase từ mẫu phân bón vi sinh VELOX 34 Hình 4.18 Kết điện di 20 khuẩn lạc mẫu phân bón vi sinh VELOX với trình tự gen 16S rRNAtrên gel agarose 2% 35 viii DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ Thử nghiệm phƣơng pháp xác định mật độ vi khuẩn B subtilis 26 Sơ đồ Phƣơng pháp xác định mật độ vi khuẩn B subtilis phân bón vi sinh 36 ix Hình 4.8 Kết nhuộm Gram 20 khuẩn lạc phân bón giả định loại - Hoạt tính enzyme Catalase: 20/20 Hình 4.9 Kết thử nghiệm hoạt tính enzyme Catalase từ mẫu phân bón giả định loại - Kiểm tra 10 khuẩn lạc dựa vào trình tự gen 16S rRNA gen endoglucanase Chọn khuẩn lạc có hình thái đặc trƣng B subtilis (trừ GD1) từ mẫu phân bón giả định tạm gọi mẫu là: GD2, GD3, GD4, GD5, GD6 kiểm tra lần lƣợt với mồi, kết hiển thị hai hình bên dƣới: 28 Hình 4.10 Kết điện di khuẩn lạc với trình tự gen 16S rRNA (mồi B.sub Common) gel agarose 2% 1: Đối chứng trắng H2O, 2: Đối chứng dương TO55.1, 3: GD2, 4: GD3, 5: GD4, 6: GD5, 7: GD6 Hình 4.11 Kết điện di khuẩn lạc với trình tự gen endoglucanase (mồi EN1) gel agarose 2% 1: Đối chứng trắng H2O, 2: Đối chứng dương TO55.1, 3: GD2, 4: GD3, 5: GD4, 6: GD5, 7: GD6 Kết cho thấy khuẩn lạc thuộc nhóm B subtilis có chủng GD3, GD6 vi khuẩn Bacillus subtilis Kiểm tra khuẩn lạc (trừ khuẩn lạc kiểm tra) từ mẫu phân bón giả định tạm gọi GD từ - 11 kiểm tra 10 khuẩn lạc mẫu đối chứng tạm gọi ĐCGD từ - 10 Kết ghi nhận hình sau: 29 Hình 4.12 Kết điện di mẫu giả định với trình tự gen endoglucanase (mồi EN1) gel agarose 2% 1: Đối chứng trắng H2O, 2: GD7, 3: GD8, 4: GD9, 5:GD10, 6: GD11, 7: ĐCGD, 8: ĐCGD2, 9: ĐCGD3, 10: ĐCGD4, 11: ĐCGD5, 12: ĐCGD6, 13: ĐCGD7, 14: ĐCGD8, 15: ĐCGD9, 16: ĐCGD10 Kết cho thấy khơng có chủng Bacillus subtilis Mật độ mẫu phân bón giả định loại đƣợc hiển thị bảng 4.5: Bảng 4.5 Bảng mật độ khuẩn lạc đặc trƣng (CFU/g), tỷ lệ đặc điểm hình thái sinh hóa (%), tỷ lệ khuẩn lạc có trình tự gen đặc hiệu (%) mật độ mẫu phân bón vi sinh giả định loại (CFU/g) Cơng thức thí M1 A B Mật độ nghiệm (CFU/g) % % mẫu (CFU/g) Đối chứng 2,78.109 100 Khơng xác định Thí nghiệm 5,28.109 100 20 1,06.109 *Kết làm tròn đến hàng thập phân thứ Ta thấy ủ mẫu 80oC 15 phút có mật độ cao Từ áp dụng trực tiếp vào mẫu phân bón vi sinh Kiểm định mẫu phân bón giả định loại biết mật độ 30 Với phân bón vi sinh có loại chất mang khác nhau, phân bón giả định loại có chất mang dạng tinh bột nên bƣớc ủ 80oC 15 phút dẫn đến mẫu đơng thành dạng keo hỗn hợp tinh bột tiếp xúc với nhiệt độ sinh hồ tinh bột Vậy nên loại phân bón khơng tiến hành ủ pha lỗng ln bƣớc Mật độ khuẩn lạc có hình thái đặc trƣng qua quan sát đƣợc thị dƣới bảng sau: Bảng 4.6 Mật độ khuẩn lạc có hình thái đặc trƣng phân bón giả định loại Số lần lặp lại Lần Lần Đĩa (khuẩn lạc/đĩa) Đĩa (khuẩn lạc/đĩa) Đĩa (khuẩn lạc/đĩa) 10-6 76 96 93 Thể tích dịch mẫu cấy vào đĩa (ml) 0,1 10-7 16 14 0,1 10-6 69 68 85 0,1 10-7 9 0,1 M1 (CFU/g) 9,21.108 7,51.108 8,36.108 Trung bình *Khuấn lạc đếm nồng độ pha lỗng 10-6, 10-7 Kết làm trịn đến hàng thập phân thứ Kiểm tra đặc điểm sinh hóa 20 khuẩn lạc bất kì: - Vi khuẩn Gram (+): 20/20 31 Hình 4.13 Kết nhuộm Gram 20 khuẩn lạc mẫu phân bón giả định loại - Hoạt tính enzyme Catalase: 20/20 Hình 4.14 Kết thử nghiệm hoạt tính enzyme Catalase từ mẫu phân bón giả định loại Do bao bì sản phẩm ghi thành phần Bacillus sp nghiên cứu kiểm định mật độ Bacillus sp phân bón giả định có xác khơng Kiểm tra 20 khuẩn lạc đƣợc khẳng định đặc tính sinh hóa tạm gọi ĐT từ – 20 với trình tự gen 16S rRNA Kết đƣợc hiển thị hình sau: Hình 4.15 Kết điện di 20 khuẩn lạc mẫu phân bón giả định loại với trình tự gen 16S rRNA gel agarose 2% 32 1: Đối chứng trắng H2O, 2: Đối chứng dương (GD3), 3: ĐT1, 4: ĐT2, 5: ĐT3, 6: ĐT4, 7: ĐT5, 8: ĐT6, 9: ĐT7, 10: ĐT8, 11: ĐT9, 12: ĐT10, 13: ĐT11, 14: ĐT12, 15: ĐT13, 16: ĐT14, 17: ĐT15, 18: ĐT16, 19: ĐT17, 20: ĐT18, 21: ĐT19 22: ĐT20 Kết cho thấy ĐT2 ĐT7 khơng có sản phẩm đặc hiệu nên chủng khơng phải Bacillus Đối với 18 chủng cịn lại có sản phẩm PCR đặc hiệu nên chúng Bacillus Bảng 4.7 Bảng mật độ khuẩn lạc đặc trƣng (CFU/g), tỷ lệ đặc điểm hình thái sinh hóa (%), tỷ lệ khuẩn lạc có trình tự gen đặc hiệu (%) mật độ mẫu phân bón giả định loại (CFU/g) Phân bón M1 (CFU/g) A % B % Mật độ mẫu (CFU/g) Loại 8,36.108 100 90 7,52.108 *Kết làm tròn đến hàng thập phân thứ Nhƣ mật độ kiểm định 7,52.108 lớn mật độ đƣợc ghi bao bì sản phẩm (106) Do mật độ Bacillus sp sản phẩm phân bón giả định cơng ty Điền Trang khơng xác Thí nghiệm 6: Kiểm định phƣơng pháp xác định có mặt định lƣợng Bacillus subtilis dạng phân bón vi sinh Bảng 4.8 Mật độ khuẩn lạc có hình thái đặc trưng phân bón vi sinh VELOX Đĩa Đĩa Đĩa Thể tích dịch (khuẩn (khuẩn (khuẩn mẫu cấy vào lạc/đĩa) lạc/đĩa) lạc/đĩa) đĩa (ml) 10-6 119 95 112 0,1 10-7 14 13 13 0,1 10-6 172 198 199 0,1 10-7 19 29 31 0,1 Số lần lặp lại Lần Lần Trung bình M1 (CFU/g) 1,11.109 1,96.109 1,54.109 *Khuấn lạc đếm nồng độ pha loãng 10-6, 10-7 Kết làm tròn đến hàng thập phân thứ 33 Kiểm tra đặc điểm sinh hóa 20 khuẩn lạc bất kì: - Vi khuẩn Gram (+): 20/20 Hình 4.16 Kết nhuộm Gram 20 khuẩn lạc từ mẫu phân bón vi sinh VELOX - Hoạt tính enzyme Catalase: 20/20 Hình 4.17 Kết thử nghiệm hoạt tính enzyme Catalase từ mẫu phân bón vi sinh VELOX Do bao bì sản phẩm ghi thành phần Bacillus sp nghiên cứu kiểm định mật độ Bacillus sp phân bón vi sinh VELOX có xác khơng Kiểm tra 20 khuẩn lạc đƣợc khẳng định đặc tính sinh hóa tạm gọi VL từ – 20 với trình tự gen 16S rRNA Kết đƣợc hiển thị hình 4.8 sau: 34 Hình 4.18 Kết điện di 20 khuẩn lạc mẫu phân bón vi sinh VELOX với trình tự gen 16S rRNAtrên gel agarose 2% 1: Đối chứng trắng H2O, 2: Đối chứng dương (GD3), 3: VL1, 4: VL2, 5: VL3, 6: VL4, 7: VL5, 8: VL6, 9: VL7, 10: VL8, 11: VL9, 12: VL10, 13: VL11, 14: VL12, 15: VL13, 16: VL14, 17: VL15, 18: VL16, 19: VL17, 20: VLVL18, 21: VL19, 22:VL20 Từ kết cho thấy có 15/20 khuẩn lạc có sản phẩm đặc hiệu gen 16S rRNA Các chủng VL2, VL5, VL6, VL17, VL19 khơng có sản phẩm đặc hiệu, chủng khơng phải Bacillus Cịn 15 chủng cịn lại Bacillus sp Bảng 4.9 Bảng mật độ khuẩn lạc đặc trƣng (CFU/g), tỷ lệ đặc điểm hình thái sinh hóa (%), tỷ lệ khuẩn lạc có trình tự gen đặc hiệu (%) mật độ mẫu phân bón vi sinh VELOX (CFU/g) Phân bón VELOX M1 A B Mật độ mẫu (CFU/g) % % (CFU/g) 1,54.109 100 75 1,16.109 *Kết làm tròn đến hàng thập phân thứ Nhƣ mật độ kiểm định 1,16.109 lớn mật độ đƣợc ghi bao bì sản phẩm (1,0.108) Do mật độ Bacillus sp sản phẩm phân bón vi sinh VELOX khơng xác 35 Sơ đồ Phƣơng pháp xác định mật độ vi khuẩn B subtilis phân bón vi sinh 36 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng, định tính vi khuẩn Bacillus subtilis phân bón vi sinh”, chúng tơi đƣa số kết luận thông số kỹ thuật phƣơng pháp bao gồm: - Xác định đƣợc môi trƣờng đặc hiệu cho vi khuẩn Bacillus subtilis NA (Nutrient agar), 37oC - Việc đun nóng mẫu phân bón điều kiện 80oC 15 phút trƣớc pha lỗng dựa vào chất mang Nếu chất có chứa tinh bột tiếp xúc với nhiệt keo lại nên bỏ qua bƣớc ủ nhiệt - Mồi EN1 kết hợp với mồi B sub Commom phân biệt đƣợc B subtilis - Đề xuất đƣợc phƣơng pháp xác định mật độ vi khuẩn B subtilis phân bón vi sinh - Xây dựng đƣợc phƣơng pháp xác định có mặt, mật độ vi khuẩn Bacillus subtilis mẫu phân bón vi sinh 02 mẫu phân bón giả định 5.2 Kiến nghị Đề tài khảo sát số thông số kỹ thuật phƣơng pháp xác định có mặt, mật độ vi khuẩn B subtilis mẫu phân bón Cần có chủng chuẩn thử nghiệm mẫu phân bón khác để kiểm định hiệu phƣơng pháp đề xuất 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tài liệu tiếng Việt Công ty TNHH SX DV Đặng Gia Trang (2020) Tác dụng phân bón hữu vi sinh trồng Truy cập từ https://sfarm.vn/tac-dung-cua-phanbon-huu-co-vi-sinh-doi-voi-cay-trong/ ngày 18/12/2021 Luật Việt Nam (2020) Thông tƣ 10/2020/TT-BNNPTNT thuốc bảo vệ thực vật đƣợc phép sử dụng, cấm sử dụng Truy cập từ https://luatvietnam.vn/nong-nghiep/thong-tu-10-2020-thuoc-bao-ve-thuc-vatduoc-phep-su-dung-190508-d1.html ngày 20/11/2021 Khánh N D (2006) Khảo sát điều khiện nuôi cấy sinh bào tử vi khuẩn Bacllus subtilis, Trƣờng đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, 58 trang Thƣớc T L (2006) Phƣơng pháp phân tích vi sinh vật Nhà xuất Giáo dục 103-104 trang 230 trang Vi H T (2008) Xây dựng quy trình định danh Lactobacillus acidophilus Bacillus subtilis có chế phẩm sinh học dùng thủy sản kỹ thuật giải trình tự rDNA 16S Đại học Bách Khoa, 94 trang B Tài liệu tiếng Anh Ara K., Ozaki K., Nakamura K., Yamane K., Sekiguchi J & Ogasawara N (2007) Bacillus minimum genome factory: effective utilization of microbial genome information Biotechnol Appl Biochem 46(Pt 3): 169-78 Ash C., Farrow J., Wallbanks S & Collins M (1991) Phylogenetic heterogeneity of the genus Bacillus revealed by comparative analysis of small‐subunit‐ribosomal RNA sequences Letters in applied microbiology 13(4): 202-206 Ashe S., Maji U J., Sen R., Mohanty S & Maiti N K (2014) Specific oligonucleotide primers for detection of endoglucanase positive Bacillus subtilis by PCR Biotech 4(5): 461-465 38 Bandow J E., Brötz H & Hecker M (2002) Bacillus subtilis tolerance of moderate concentrations of rifampin involves the sigma(B)-dependent general and multiple stress response J Bacteriol 184(2): 459-67 10.Borshchevskaya L N., Kalinina A N & Sineokii S P (2013) Design of a PCR test based on the gyrA gene sequence for the identification of closely related species of the Bacillus subtilis group Applied Biochemistry and Microbiology 49(7): 646-655 11.Cazorla F M., Romero D., Pérez-García A., Lugtenberg B J., Vicente A & Bloemberg G (2007) Isolation and characterization of antagonistic Bacillus subtilis strains from the avocado rhizoplane displaying biocontrol activity J Appl Microbiol 103(5): 1950-9 12.Davey M E., Caiazza N C & O'toole G A (2003) Rhamnolipid surfactant production affects biofilm architecture in Pseudomonas aeruginosa PAO1 J Bacteriol 185(3): 1027-36 13.García-Gutiérrez M S., Ortega-Álvaro A., Busquets-García A., Pérez-Ortiz J M., Caltana L., Ricatti M J., Brusco A., Maldonado R & Manzanares J (2013) Synaptic plasticity alterations associated with memory impairment induced by deletion of CB2 cannabinoid receptors Neuropharmacology 73: 388-96 14.Hashem A., Tabassum B & Fathi Abd Allah E (2019) Bacillus subtilis: A plant-growth promoting rhizobacterium that also impacts biotic stress Saudi J Biol Sci 26(6): 1291-1297 15.Jamil B., Hasan F., Hameed A & Ahmed S (2007) Isolation of bacillus subtilis MH-4 from soil and its potential of polypeptidic antibiotic production Pak J Pharm Sci 20(1): 26-31 16.Joshi R & Mcspadden Gardener B B (2006) Identification and Characterization of Novel Genetic Markers Associated with Biological Control Activities in Bacillus subtilis Phytopathology 96(2): 145-54 17.Kobayashi K., Ehrlich S D., Albertini A., Amati G., Andersen K K., Arnaud M., Asai K., Ashikaga S., Aymerich S., Bessieres P., Boland F., Brignell S 39 C., Bron S., Bunai K., Chapuis J., Christiansen L C., Danchin A., Débarbouille M., Dervyn E., Deuerling E., Devine K., Devine S K., Dreesen O., Errington J., Fillinger S., Foster S J., Fujita Y., Galizzi A., Gardan R., Eschevins C., Fukushima T., Haga K., Harwood C R., Hecker M., Hosoya D., Hullo M F., Kakeshita H., Karamata D., Kasahara Y., Kawamura F., Koga K., Koski P., Kuwana R., Imamura D., Ishimaru M., Ishikawa S., Ishio I., Le Coq D., Masson A., Mauël C., Meima R., Mellado R P., Moir A., Moriya S., Nagakawa E., Nanamiya H., Nakai S., Nygaard P., Ogura M., Ohanan T., O'reilly M., O'rourke M., Pragai Z., Pooley H M., Rapoport G., Rawlins J P., Rivas L A., Rivolta C., Sadaie A., Sadaie Y., Sarvas M., Sato T., Saxild H H., Scanlan E., Schumann W., Seegers J F., Sekiguchi J., Sekowska A., Séror S J., Simon M., Stragier P., Studer R., Takamatsu H., Tanaka T., Takeuchi M., Thomaides H B., Vagner V., Van Dijl J M., Watabe K., Wipat A., Yamamoto H., Yamamoto M., Yamamoto Y., Yamane K., Yata K., Yoshida K., Yoshikawa H., Zuber U & Ogasawara N (2003) Essential Bacillus subtilis genes Proc Natl Acad Sci U S A 100(8): 4678-83 18.Kunst F., Ogasawara N., Moszer I., Albertini A M., Alloni G., Azevedo V., Bertero M G., Bessières P., Bolotin A., Borchert S., Borriss R., Boursier L., Brans A., Braun M., Brignell S C., Bron S., Brouillet S., Bruschi C V., Caldwell B., Capuano V., Carter N M., Choi S K., Cordani J J., Connerton I F., Cummings N J., Daniel R A., Denziot F., Devine K M., Düsterhöft A., Ehrlich S D., Emmerson P T., Entian K D., Errington J., Fabret C., Ferrari E., Foulger D., Fritz C., Fujita M., Fujita Y., Fuma S., Galizzi A., Galleron N., Ghim S Y., Glaser P., Goffeau A., Golightly E J., Grandi G., Guiseppi G., Guy B J., Haga K., Haiech J., Harwood C R., Hènaut A., Hilbert H., Holsappel S., Hosono S., Hullo M F., Itaya M., Jones L., Joris B., Karamata D., Kasahara Y., Klaerr-Blanchard M., Klein C., Kobayashi Y., Koetter P., Koningstein G., Krogh S., Kumano M., Kurita K., Lapidus A., Lardinois S., Lauber J., Lazarevic V., Lee S M., Levine A., Liu H., Masuda S., Mauël C., Médigue C., Medina N., Mellado R P., Mizuno M., Moestl D., 40 Nakai S., Noback M., Noone D., O'reilly M., Ogawa K., Ogiwara A., Oudega B., Park S H., Parro V., Pohl T M., Portelle D., Porwollik S., Prescott A M., Presecan E., Pujic P., Purnelle B., Rapoport G., Rey M., Reynolds S., Rieger M., Rivolta C., Rocha E., Roche B., Rose M., Sadaie Y., Sato T., Scanlan E., Schleich S., Schroeter R., Scoffone F., Sekiguchi J., Sekowska A., Seror S J., Serror P., Shin B S., Soldo B., Sorokin A., Tacconi E., Takagi T., Takahashi H., Takemaru K., Takeuchi M., Tamakoshi A., Tanaka T., Terpstra P., Togoni A., Tosato V., Uchiyama S., Vandebol M., Vannier F., Vassarotti A., Viari A., Wambutt R., Wedler H., Weitzenegger T., Winters P., Wipat A., Yamamoto H., Yamane K., Yasumoto K., Yata K., Yoshida K., Yoshikawa H F., Zumstein E., Yoshikawa H & Danchin A (1997) The complete genome sequence of the gram-positive bacterium Bacillus subtilis Nature 390(6657): 249-56 19.Kwon G H., Lee H A., Park J Y., Kim J S., Lim J., Park C S., Kwon D Y., Kim Y S & Kim J H (2009) Development of a RAPD-PCR method for identification of Bacillus species isolated from Cheonggukjang Int J Food Microbiol 129(3): 282-7 20.Members of the Fnca (2014) Quantification of beneficial microbes in biofertilizer Biofertilizer Project (1) Forum for Nuclear Cooperation in Asia (FNCA) Japan 3-4 trang 29 trang 21.Morikawa M (2006) Beneficial biofilm formation by industrial bacteria Bacillus subtilis and related species J Biosci Bioeng 101(1): 1-8 22.Perez A R., Abanes-De Mello A & Pogliano K (2000) SpoIIB localizes to active sites of septal biogenesis and spatially regulates septal thinning during engulfment in bacillus subtilis J Bacteriol 182(4): 1096-108 23.Romero D., De Vicente A., Rakotoaly R H., Dufour S E., Veening J W., Arrebola E., Cazorla F M., Kuipers O P., Paquot M & Pérez-García A (2007) The iturin and fengycin families of lipopeptides are key factors in antagonism of Bacillus subtilis toward Podosphaera fusca Mol Plant Microbe Interact 20(4): 430-40 41 24.Schaechter M., Ingraham J & Neidhardt F (2006) Microbe trang trang 25.Wang X., Zhao D., Shen L., Jing C & Zhang C (2018) Application and mechanisms of Bacillus subtilis in biological control of plant disease Trong: Role of rhizospheric microbes in soil Springer: 225-250 trang 26.Wattiau P., Renard M E., Ledent P., Debois V., Blackman G & Agathos S N (2001) A PCR test to identify bacillus subtilis and closely related species and its application to the monitoring of wastewater biotreatment Appl Microbiol Biotechnol 56(5-6): 816-9 42