Nghiên cứu phương pháp chẩn đoán nấm bệnh Aspergillus Flavus sinh độc tố Aflatoxin bằng kỹ thuật PCR

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ®ỔV LÊ THỊ THU HẰNG NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN NẤM BỆNH Aspergillus flavus SINH Độc TỐ AFLATOXIN BẰNG KỸ THUÂT PCR LUẬN VĂN THẠC sĩ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: BẢO VỆ THựC VẬT Mã số: 60.62.10 Người hướng dẫn khoa học: TS. PHẠM XUÂN HỘI HÀ NỘI - 2009 - Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa hề sử dụng để bảo vệ một học vị nào. - Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả  LỜI CAM ĐOAN Nhân dịp này, tôi xin gửi lời cám ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Phạm Xuân Hội, người đã tận tình dạy bảo, trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình làm việc cũng như thực hiện nghiên cứu khoa học và hoàn thành luận văn này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô và các cán bộ trong Bộ môn Bệnh Cây đã tận tình dạy dỗ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại Bộ môn. Nhân dịp này tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa, các thầy cô trong Khoa Nông học, Viện đào tạo Sau đại học - Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội đã dạy dỗ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường. Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ, anh chị em trong Bộ môn Bệnh học Phân tử Thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp đã giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình công tác và nghiên cứu khoa học tại Bộ môn trong thời gian vừa qua. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã nhiệt tình động viên giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu khoa học và trong cuộc sống. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 9 năm 2009 Lê Thị Thu Hằng LỜI CẢM ƠN 3 MỤC LỤC 5 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1Sự có mặt của Ả. flavus và Aflatoxin ở các mẫu lạc (từ 1967-1983 So sánh kết quả phương pháp Multiplex PCR và phương pháp dựa vào Ả. Candidas Aspergillus Candidas A. glacus Aspergillus glacus A. flavus Aspergillus flavus A. paracỉtỉcus Aspergillus paraciticus A. nomius Aspergillus nomius A. fumigatus Aspergillus fumigatus A. ochraceus Aspergillus ochraceus A. oryzae Aspergillus oryzae cDNA Complementary DNA CTAB Cetyltrimethylammonium bromide cs Cộng sự DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs Deoxy nucleotide triphosphates DC Đối chứng EDTA Ethylenediaminetetra acetic acid HPLC High - performance liquid chromatography HPTLC High performance thin layer chromatography KAc Kalipotassium acetate PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp SDS Sodium lauryl sulfate TLC Thin - layer chromatography TE Tris- EDTA 7 màu sắc chủng nấm trên môi trường CAM để phát hiện chủng nấm A. flavus sinh độc tố Aflatoxin 53  !"#$% &'()*+,-.'/0*A. flavus,1'2 345  67 8 4.9 DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1Chu kỳ của nấm A. flavus trên ngô vàng Error! Bookmark not defined. 2.2Cấu tạo vi thể của nấm Aspergillus flavus Link - Cơ quan sinh sản gồm: bọng (vesicular); thể bình (metular); và bào tử (conidi) 11 2.3Mối quan hệ di truyền của một số loài nấm Aspergillus spp.Error! Bookmark n 2.4Hình thái cuống sinh bào tử của nấm A.flavus và nấm A. oryzaeError! Bookmark 2.5Màu sắc khuẩn lạc của các loài nấm Aspergillus spp. trên môi trường nuôi cấy (PDA) Error! Bookmark not defined. 2.6 2.7 2.8 4.1B Thu nhận mẫu nấm A. flavus từ các mẫu, A: Ngô; B: Đậu tương 2.9 trên môi trường PDA đặcError! Bookmark not defined. 4.2Hình ảnh thể bình và cuống sinh bào tử của nấm A. flavus quan 2.10 sát dưới kính hiển vi (x 1600) Error! Bookmark not defined. 4.3Hình ảnh nấm A. flams được phân lập từ các mẫu gạo tại Hà Nội 2.11 phát triển trên môi trường PDA (trái) và môi trường Czapek (phải)Error! Bookmar 4.4Các chủng nấm được bảo quản trong dung dịch glycerol 50%, 2.12 4°c Error! Bookmark not defined. 4.5Tốc độ phát triển của nấm A. flavus tại các ngưỡng nhiệt độ 2.13 20°c, 28°c, 30°c trên các nông sản sau, A: 4 ngày; B: 6 ngày nuôi cấy 39 2.14 Hình ảnh phát triển của nấm A. flavus được phân lập từ các mẫu 2.15 Ngô tại Thanh Hóa; A: sau 2 ngày ; B: sau 4 ngày nuôi cấy; C: 4.6 4.7 4.8 4.9 4.10 4.11 4.12 4.13 4.14 2.16 sau 6 ngày nuôi cấy trên môi trường PDAError! Bookmark not defined. 2.17 Nuôi cấy nấm A.flavus trong môi trường PDA lỏngError! Bookmark not defi Sợi nấm A. flavus đã làm khô dùng làm nguyên liệu cho quá trình tách chiết ADN tổng số Error! Bookmark not defined. 2.18 Hình ảnh điện di ADN tổng số trên gel Agarose 1% của các mẫu nấm A. flavus phân lập từ các mẫu nông sản A: Đậu tương; B: 2.19 Gạo Error! Bookmark not defined. 2.20 Sản phẩm PCR được nhân lên từ ADN tổng số các chủng A. flavus được phân lập từ các mẫu Gạo, phân tích trên gel Agarose 1% với các cặp mồi: A: mồi ver-1; B: mồi omt-1; C: mồi nor-l\ D: mồi apa-2 nhân các đoạn genError! Bookmark not defined. 2.21 Mật độ xuất hiện của ba, hai và một gen trong phản ứng PCR đặc hiệu với các cặp mồi riêng rẽ, sử dụng khuôn là các mẫu ADN nấm A. Jlavus 48 2.22 H ình ảnh điện di sản phẩm khuyếch đại Multiplex PCR của các mẫu nấm A. flavus phân lập từ các mẫu Đậu tương trên gel agarose 1%: M: marker; 1-4: A.flavus Hà Nội; 4 - 8: A.jlavus Thanh Hoá; 9: đối chứng A. niger chuẩn 54 2.23 Hình ảnh điện di sản phẩm khuyếch đại Multiplex PCR của các mẫu nấm A. flavus phân lập từ các mẫu Ngô trên gel agarose 1%: 2.24 M: marker; 1 - 11: A. flavus Thanh Hoá ; 12 - 15: A. jlavus Hà Nội; 16: đối chứng A. nỉger chuẩn 54 2.25 Hình ảnh điện di sản phẩm khuyếch đại Multiplex PCR của các mẫu nấm A. flavus phân lập từ các mẫu Gạo trên gel agarose 1%: [...]... chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: "Nghiên cứu phương pháp chẩn đoán nấm bệnh Aspergillus flavus sinh độc tố Aílatoxin bằng kỹ thuật PCR" với các mục tiêu chính như sau: - Thu thập và phân lập các chủng nấm A flavus trên một số nông sản (lạc, ngô, đậu tương, gạo) - Nghiên cứu phương pháp chẩn đoán nấm bệnh A flavus sinh độc tố Aflatoxin bằng kỹ thuật PCR để phát hiện tình trạng nhiễm Aflatoxin trên... việc nghiên cứu phát triển các phương pháp chẩn đoán sớm nấm Aspergillus sinh độc to Aflatoxin có ý nghĩa cực kỳ quan trọng trong việc hạn chế lây lan và giảm thiểu tác hại của nấm Phương pháp phát hiện mầm bệnh nấm Aspergillus sinh độc tố Aflatoxin bằng kỹ thuật PCR chưa được nghiên cứu ở Việt nam Với mục tiêu xây dựng phương pháp chẩn đoán sớm, nhanh và nhạy góp phần làm giảm thiểu tác hại của nấm Aspergillus. .. các phương pháp dựa vào kỹ thuật PCR và kỹ thuật kháng thể đơn dòng đang được nghiên cứu và áp dụng rộng rãi do có ưu điểm là phát hiện nhanh, nhậy, chính xác nấm Aspergillus sinh độc to Aflatoxin Ngoài ra, phương pháp PCR còn có thể phát hiện được chủng nấm Aspergillus lây nhiễm [40] 2.37 Phương pháp chẩn đoán sử dụng kỹ thuật PCR được dựa trên kết quả nghiên cứu hệ gen nấm Aspergillus sinh độc to Aflatoxin. .. defined 1 MỞ ĐẦU 2.34 Nấm bệnh là một trong những tác nhân gây bệnh chính làm giảm năng suất và chất lượng sản phẩm nông sản Ngoài ra, nhiều loại nấm còn sinh ra độc tố mycotoxin làm ảnh hưởng đến sức khoẻ của con người và vật nuôi Nhóm nấm sinh độc tố phổ biến nhất là Aspergillus (A Jlavus, A parasiticus và A nomius) sản sinh ra Aflatoxin, là độc tố nguy hiểm nhất trong nhóm độc tố mycotoxin và là hợp... (Hiscocks) đã nghiên cứu hơn 1000 mẫu lạc thí nghiệm thì thấy lạc hạt có 3,3% số củ là rất độc - lkg chứa trên 0,25mg Aflatoxin BI (độc tố chủ yếu của A flavus) và 21,7% số củ độc vừa, 75% số củ không độc Còn trên lạc khô: 42% số mẫu là rất độc; 49,3% độc vừa và chỉ có 8,7% là không độc [3,4], 2.51 Loài nấm sản sinh Aflatoxin là A flaws được phân lập từ 13-21% trong các mẫu gạo Những nghiên cứu ở Thái... rất tốt cho việc sản xuất Aflatoxin của nấm A jlavus Chủng nấm A flavus sau khi được cấy lên môi trường CAM, để ở nhiệt độ 28° c, khoảng 30 - 40 ngày, kết họp cả xem xét màu sắc chủng nấm lên môi trường và dưới đèn uv để phát hiện chủng nấm sinh độc tố Tuy nhiên, phương pháp này rất mất thời gian [20, 45] 2.4.2 2.93 Phương pháp vật lý hóa học Hiện nay, các phòng thí nghiệm đang sử dụng các phương pháp. .. hiện nấm Aspergillus sinh độc tố Aflatoxin như: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lớp mỏng cao áp (HPLC) [43] Ưu điểm của phương pháp này là có thể định lượng chính xác hàm lượng Aflatoxin nhiễm trong mẫu thí nghiệm Tuy nhiên, phương pháp này lại có nhược điểm là cần phòng thí nghiệm được trang bị các máy chuyên dụng đắt tiền 2.94 * Phương pháp sắc kỷ lớp mỏng (Thin layer chromatography-TLC) 2.95 Phương pháp. .. thư cao nhất [29, 52] 2.35 Nam Aspergillus sinh độc to Aflatoxin có phổ hoạt động rất rộng, lây nhiễm trên nhiều loại nông sản đặc biệt là ngô, lạc, bông, đậu tương, ở hầu hết các nước trên thế giới đặc biệt là các nước có khí hậu nhiệt đới [52] 2.36 Phương pháp truyền thống phát hiện nấm Aspergillus sinh độc tố Aflatoxin chủ yếu dựa vào đặc điểm sinh học, hình thái sợi nấm và vết loang để lại trên môi... phát hiện độ nhiễm Aflatoxin cao quá mức cho phép Vì vậy, việc nghiên cứu phát hiện sớm và nhanh nấm Aspergillus spp sinh độc to Aflatoxin đang đuợc đặc biệt quan tâm nghiên cứu Mức độ nhiễm Aflatoxin trên ngô và một số tỉnh miền Nam và Bắc Việt nam cho thấy tần xuất nhiễm Aflatoxin giao động từ 73,3% đến 95,8% trong đó hàm luợng Aflatoxin trung bình cao nhất là 63,8 ppb và hàm luợng Aflatoxin trung bình... a- Aflatoxin Bj; b- Tông sô 4 loại Ạ/ỉatoxin 2.161 2.88 —— -— 9 7 2.89 2.4 Các biện pháp chẩn đoán nấm A flavus sinh độc tổ Aílatoxỉn 2.90 Việc phát hiện Aflatoxin trong nhiều loại nông sản cả trên đồng mộng lẫn trong bảo quản đã thúc đẩy các nỗ lực trên toàn Thế giới nhằm phát triển các phương pháp phát hiện họp chất này 3 4 2.4.1 2.91 Phương pháp . thiểu tác hại của nấm. Phương pháp phát hiện mầm bệnh nấm Aspergillus sinh độc tố Aflatoxin bằng kỹ thuật PCR chưa được nghiên cứu ở Việt nam. Với mục tiêu xây dựng phương pháp chẩn đoán sớm, nhanh. ra, phương pháp PCR còn có thể phát hiện được chủng nấm Aspergillus lây nhiễm [40]. 2.37 Phương pháp chẩn đoán sử dụng kỹ thuật PCR được dựa trên kết quả nghiên cứu hệ gen nấm Aspergillus sinh độc. sản (lạc, ngô, đậu tương, gạo). - Nghiên cứu phương pháp chẩn đoán nấm bệnh A. flavus sinh độc tố Aflatoxin bằng kỹ thuật PCR để phát hiện tình trạng nhiễm Aflatoxin trên nông sản. 1 4 2. TỔNG