Nghiên cứu phương pháp chuẩn đoán nấm bệnh aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin bằng môi trường thạch nước dừa luận văn tốt nghiệp đại học

i TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA NÔNG LÂM NGƯ - - Phan Thị Phương NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN NẤM BỆNH Aspergillus flavus SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN BẰNG MÔI TRƯỜNG THẠCH NƯỚC CỐT DỪA (COCONUT AGAR MEDIUM) ii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ NGÀNH NÔNG HỌC VINH – 07.2011 iii Lời cam đoan! Quá trình thực tập tốt nghiệp khoảng thời gian để người sinh viên có điều kiện rèn luyện tính tự lực, độc lập suy nghĩ, bổ sung kiến thức mẻ từ thực tiễn, nâng cao trình độ lý luận chuyên môn Tiếp tục rèn luyện đạo đức tác phong, quan điểm phục vụ người cán khoa hoc kỹ thuật Để hoàn thành luân văn xin cam đoan: Trong trình nghiên cứu thân nhiệt tình với công việc Số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực Kết nghiên cứu thân có nhờ giúp đỡ tận tình, chu đáo thầy giáo hướng dẫn PGS TS Trần Ngọc Lân cô giáo hướng dẫn KS Hồ Thị Nhung thầy cô giáo phòng thí nghiệm Mọi giúp đỡ cho việc thực khóa luận cảm ơn thông tin trích dẫn khóa luận rõ nguồn gốc Nghi lộc, tháng năm 2010 Tác giả luận văn Phan Thị Phương Lời cảm ơn iv Trong suốt thời gian thực đề tài khóa luận tốt nghiệp nhận giúp đỡ tận tình quý thầy cô giáo khoa Nông Lâm Ngư Trường Đại học Vinh, nhà khoa học, người dân nơi thu mẫu bạn bè thân hữu gần xa Hoàn thành luận văn cho phép bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Ngọc Lân nhiệt tình hướng dẫn suốt trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn KS Hồ Thị Nhung nhiệt tình truyền đạt kỹ năng, kinh nghiệm nghiên cứu khoa học cho Đặc biệt cô động viên khuyến khích mang đến cho niền tin, lòng say mê nghiên cứu khoa học Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán công chức khoa Nông Lâm Ngư, tổ bảo vệ thực vật phòng thí nghiệm, thư viện tạo điều kiện giúp đỡ cho hoàn thành khóa luận Để hoàn thành khóa luận này, nhận động viên, hỗ trợ lớn vật chất tinh thần gia đình, bạn bè Tôi xin trân trọng biết ơn hướng dẫn, giúp đỡ, động viên Xin chân thành cảm ơn! Nghi lộc, tháng năm 2011 Tác giả luận văn Phan Thị Phương v MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn .ii 1.1.Tính nguy hại việc nhiễm nấm Aspergillus spp độc tố Aflatoxin lương thực, thực phẩm 1.2 Sơ lược loài Aspergillus spp sinh độc tố Aflatoxin 1.3 Độc tố Aflatoxin 10 Hình 1.2 Cấu trúc hoá học Aflatoxin (Jones, 1977) 13 1.3.2 Aflatoxin tác động sức khỏe người 13 Bảng 1.2 Các loài thuộc chi Aspergillus mycotoxin tạo thành 15 Hình 1.3 Kết hợp phương pháp để đánh giá chủng sinh độc tố Aflatoxin loài Aspergillus spp 18 2.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm thời gian nghiên cứu 25 2.2 Nội dung nghiên cứu .25 31 31 31 Hình 2.2 Mầu sắc A flavus môi trường CAM theo thứ tự: vàng sậm (có độc tố Aflatoxin), vàng nhạt (có thể có độc tố Aflatoxin) trắng (không có Aflatoxin) 31 Hình 2.3 Hình ảnh quan sát độc tố Aflatoxin sinh chủng nấm A flavus ánh sáng đèn UV (huỳnh quang màu xanh: Có độc tố Aflatoxin, màu tím: Không chứa độc tố Aflatoxin) 32 Bảng 3.1 Thành phần mức độ phổ biến nấm bệnh hại hạt giống ngô 33 Bảng 3.2 Thành phần mức độ phổ biến nấm hại hạt lạc giống 33 Bảng 3.3: Bảng thành phần nấm hại đất trồng lạc (ngô) số huyện Nghệ An, Thanh Hóa, Hà Tĩnh 37 Bảng 3.4 : Tỷ lệ nhiễm A.flavus nông sản thu từ chợ vùng Nghi Lộc phụ cận .41 vi Hình 3.1 Tỷ lệ nhiễm A.flavus nông sản thu từ chợ vùng Nghi Lộc phụ cận .41 Bảng 3.5 Tỷ lệ nhiễm A.flavus nông sản thu từ kho bảo quản nông hộ vùng Nghi Lộc phụ cận 42 Bảng 3.6: Tỷ lệ nhiễm A.flavus đất trồng lạc vùng Nghi Lộc phụ cận.44 Hình 3.3 Tỷ lệ nhiễm A.flavus đất trồng lạc vùng Nghi Lộc phụ cận 45 Bảng 3.7.1 Khả sinh độc tố Aflatoxin môi trường CAM chủng A flavus thu thập từ đất trồng lạc Thanh Hóa, Hà Tĩnh 46 Bảng 3.7.2 Khả sinh độc tố Aflatoxin môi trường CAM chủng A flavus thu thập từ đất trồng lạc Nghệ An 46 Bảng 3.7.3 Tỷ lệ chủng A flavus sinh độc tố Aflatoxin Nghệ An, Thanh Hóa Hà Tĩnh 47 Bảng 3.8 Khả sinh độc tố Aflatoxin môi trường CAM chủng A flavus thu thập từ nông sản thu từ chợ vùng Nghi Lộc phụ cận 49 vii BẢNG CHỮ CÁI VIẾT TẮT Chữ viết tắt A candidus A flavus A fumigatus A glacus A nomius A ochraceus A oryzae A paraciticus AFB1 CAM ELISA HPLC HPTLC PCR PDA TLC UV Nội dung Aspergillus candidus Aspergillus flavus Aspergillus fumigatus Aspergillus glacus Aspergillus nomius Aspergillus ochraceus Aspergillus oryzae Aspergillus paraciticus Aflatoxin B1 Coconut agar medium Enzyme – linked immunoabsorbant assay High – performance liquid chromatography High performance thin layer chromatography Phản ứng chuỗi trùng hợp Potato- Dextrose- Agar Thin – layer chromatography Đèn tia cực tím viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.2 Cấu trúc hoá học Aflatoxin (Jones, 1977) 13 Hình 1.3 Kết hợp phương pháp để đánh giá chủng sinh độc tố Aflatoxin loài Aspergillus spp 18 31 31 31 Hình 2.2 Mầu sắc A flavus môi trường CAM theo thứ tự: vàng sậm (có độc tố Aflatoxin), vàng nhạt (có thể có độc tố Aflatoxin) trắng (không có Aflatoxin) 31 Hình 2.3 Hình ảnh quan sát độc tố Aflatoxin sinh chủng nấm A flavus ánh sáng đèn UV (huỳnh quang màu xanh: Có độc tố Aflatoxin, màu tím: Không chứa độc tố Aflatoxin) 32 Hình 3.1 Tỷ lệ nhiễm A.flavus nông sản thu từ chợ vùng Nghi Lộc phụ cận .41 Hình 3.3 Tỷ lệ nhiễm A.flavus đất trồng lạc vùng Nghi Lộc phụ cận .45 ix DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Sự có mặt A flavus Aflatoxin mẫu lạc (từ 1967-1983 Philippin) Bảng 1.2 Các loài thuộc chi Aspergillus mycotoxin tạo thành .15 Bảng 3.1 Thành phần mức độ phổ biến nấm bệnh hại hạt giống ngô 33 Bảng 3.2 Thành phần mức độ phổ biến nấm hại hạt lạc giống 33 Bảng 3.3: Bảng thành phần nấm hại đất trồng lạc (ngô) số huyện Nghệ An, Thanh Hóa, Hà Tĩnh 37 Bảng 3.4 : Tỷ lệ nhiễm A.flavus nông sản thu từ chợ vùng Nghi Lộc phụ cận .41 Bảng 3.5 Tỷ lệ nhiễm A.flavus nông sản thu từ kho bảo quản nông hộ vùng Nghi Lộc phụ cận 42 Bảng 3.6: Tỷ lệ nhiễm A.flavus đất trồng lạc vùng Nghi Lộc phụ cận 44 Bảng 3.7.1 Khả sinh độc tố Aflatoxin môi trường CAM chủng A flavus thu thập từ đất trồng lạc Thanh Hóa, Hà Tĩnh 46 Bảng 3.7.2 Khả sinh độc tố Aflatoxin môi trường CAM chủng A flavus thu thập từ đất trồng lạc Nghệ An 46 Bảng 3.7.3 Tỷ lệ chủng A flavus sinh độc tố Aflatoxin Nghệ An, Thanh Hóa Hà Tĩnh 47 Bảng 3.8 Khả sinh độc tố Aflatoxin môi trường CAM chủng A flavus thu thập từ nông sản thu từ chợ vùng Nghi Lộc phụ cận 49 MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết nghiên cứu chẩn đoán nấm bệnh Aspergillus flavus sinh độc tố Aflatoxin Lạc, đậu tương, ngô loại công nghiệp, lương thực phổ biến giới nước ta, xem mũi nhọn chiến lược kinh tế việc sản xuất khai thác lợi vùng khí hậu nhiệt đới Phần lớn nấm mốc loại hạt thuộc giống Aspergillus, Penicillium, Fusarium số chúng sản sinh độc tố Theo nghiên cứu, người ta kết luận có độc tố diện hạt lạc là: Aflatoxin, Citrinin Ochratoxin A Aflatoxin đặc biệt ý tính độc Aflatoxin nhóm chất độc mạnh hình thành tự nhiên Chúng bao gồm họ độc tố sinh từ nấm Aspergillus flavus Aspergillus paraticus Điều kiện thời tiết Việt Nam xem môi trường lý tưởng cho sinh trưởng phát triển nấm mốc nói chung nấm Aspergillus spp nói riêng Nấm mốc có mặt khắp nơi thường phát sinh, phát triển sản phẩm lương thực, thực phẩm…và hoa Bên cạnh việc nấm mốc gây hư hỏng, thối rữa, làm hỏng, giảm chất lượng giá trị sử dụng có nhiều loài nấm mốc tiết độc tố gây bệnh cho người gây tổn thương gan, gây ung thư, gây giảm sức đề kháng cho thể Chính tác hại độc tố gây nên với người nên nhiều nước phát triển giới như: Mỹ, Nhật Bản, nước EU, …khi nhập lương thực, thực phẩm như: ngô, lạc, cà phê, chè,…đã đưa khung giới hạn hàm lượng Aflatoxin phải mức cho phép Thực tế có nhiều lô hàng nông sản xuất nước ta như: lạc, đậu tương bị trả lại phát độ nhiễm Aflatoxin cao mức cho phép Vì vậy, việc nghiên cứu phát triển phương pháp chẩn đoán sớm nấm Aspergillus sinh độc tố Aflatoxin có ý nghĩa quan trọng việc hạn chế lây lan giảm thiểu tác hại nấm Nhiều nghiên cứu liên quan đến việc giảm thiểu độc tố Aflatoxin sinh A flavus từ năm thập niên 1970 kỷ trước Từ đến 48 Nghệ An Tổng 48 65 10 29 80 73,9 Môi trường CAM môi trường tốt cho việc sản xuất độc tố Aflatoxin chủng nấm A flavus Độc tố tiết môi trường làm cho môi trường chuyển màu vàng xuất huỳnh quang màu xanh quan sát đèn tia cực tím (UV) Đây sở giúp đánh giá chủng nấm A flavus sinh độc tố Aflatoxin hay không sau cấy lên môi trường CAM khoảng – ngày Những chủng không sinh độc tố Aflatoxin môi trường giữ màu trắng ban đầu đèn UV có màu tím Qua bảng 3.7.1, bảng 3.7.2 bảng 3.7.3 nhận thấy, chủng nấm A flavus làm môi trường đổi màu từ màu trắng ban đầu thành màu vàng vàng nhạt sau – ngày nuôi cấy xuất huỳnh quang màu xanh đèn UV Qua bảng 3.7.3 ta thấy khu vực Thanh Hóa, Hà Tĩnh: Có 14 chủng Hà Tĩnh 16 chủng Thanh Hóa đó: Hà Tĩnh có chủng biến đổi môi trường có màu vàng sẫm, chủng màu vàng nhạt; Thanh Hóa có chủng vàng sẫm chủng màu vàng nhạt Tất chủng biến đổi môi trường thành màu vàng sẫm hay màu vàng nhạt xuất huỳnh quang màu xanh đèn tia cực tím Kết giúp chấn đoán được, Hà Tĩnh có 10 chủng A flavus có khả sinh độc tố Aflatoxin Thanh Hóa có chủng sinh độc tố Aflatoxin Bảng 3.7.2 khu vực Nghệ An phân lập 58 chủng có 38 chủng có màu vàng sẫm, 10 chủng màu vàng nhạt, 10 chủng màu trắng 48 chủng A flavus làm biến đổi màu môi trường sang màu vàng vàng nhạt quan sát thấy huỳnh quang màu xanh Như vậy, Nghệ An có 48 chủng sinh độc tố Aflatoxin tổng số 58 chủng A flavus thí nghiệm Bảng 3.7.3 cho thấy tỷ lệ chủng A flavus có khả sinh độc tố Aflatoxin cao Với tổng số chủng thí nghiệm 88 chủng có đến 65 chủng sinh độc tố Aflatoxin, chiếm 73,9% Không thể so sánh tỉnh số chủng A flavus không nhau, thấy rằng, Nghệ An, Thanh Hóa, tỷ lệ chủng sinh độc tố Aflatoxin cao 71,4% chủng 49 sinh độc tố Hà Tĩnh 80% Nghệ An Thanh Hóa thấp với 43,8% chủng A flavus có khả sinh độc tố Aflatoxin Như vậy, qua bảng 3.7.1; 3.7.2 3.7.3 rút kết luận sau: Hà Tĩnh có 10/14, Nghệ An có 48/58 Thanh Hóa có 7/16 chủng A flavus phân lập từ đất có khả sinh độc tố Aflatoxin Tỷ lệ chủng A flavus có khả sinh độc tố Aflatoxin phạm vi nghiên cứu cao chiếm 71,4 % Những chủng A flavus làm cho môi trường biến đổi sang màu vàng nhạt – màu sắc chưa thể khẳng định chủng nấm có sinh độc tố Aflatoxin hay không Chúng kiểm tra lại cách quan sát huỳnh quang đèn tia cực tím thấy xuất huỳnh quang màu xanh Điều chứng tỏ rằng, chủng có sắc tố vàng nhạt môi trường CAM nghiên cứu chủng sinh độc tố Aflatoxin 3.7 Khả sinh độc tố Aflatoxin môi trường CAM chủng A.flavus thu thập từ nông sản thu từ chợ vùng Nghi Lộc phụ cận Sự nhiễm Aflatoxin lạc vấn đề nghiêm trọng có tính chất toàn cầu tất nước trồng lạc giới Sự nhiễm Aflatoxin không làm ảnh hưởng đến sản lượng lạc gây rào cản cho trình tiêu thu độc tố gây hại cho sức khỏe người Các loài nấm sinh Aflatoxin, A flavus A parasiticus, xâm nhập vào hạt lạc đồng ruộng trước thu hoạch, trình sấy sau thu hoạch, bảo quản, trình giao lưu buôn bán vận chuyển Các chủng A flavus thu thập từ nông sản chợ vùng Nghi Lộc chợ đầu mối thành phố Vinh nuôi cấy theo dõi môi trường CAM quan sát huỳnh quang đèn UV thu kết đánh giá khả sinh độc tố chúng sau: Bảng 3.8 Khả sinh độc tố Aflatoxin môi trường CAM chủng A flavus thu thập từ nông sản thu từ chợ vùng Nghi Lộc phụ cận Chủng VAN 004 CAM Trắng UV Tím Chủng VAL 073 CAM Vàng nhạt UV Tím 50 VAL 004 Vàng sẫm Xanh VAL005 Vàng nhạt Xanh VAL 056 Vàng sẫm Xanh VAL 060 Trắng Tím VAL 061 Vàng nhạt Xanh VAL 064 Vàng sẫm Xanh VAL 065 Vàng sẫm Xanh VAL 066 Vàng sẫm Xanh VAL 068 Vàng sẫm Xanh VAL 070 Vàng nhạt Tím VAL 072 Trắng Tím Kết thu từ bảng 3.8 VAL 081 VAL 083 VAL 084 VAL 086 VAL 087 VAL 088 VAL 093 VAL 096 VAL 097 VAL 100 Vàng nhạt Vàng sẫm Vàng sẫm Vàng sẫm Trắng Vàng sẫm Vàng sẫm Vàng sẫm Vàng sẫm Vàng sẫm Tím Xanh Xanh Xanh Tím Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh cho thấy, có 23 chủng A flavus phân lập từ nông sản chợ vùng Nghi Lộc thành phố Vinh đánh giá khả sinh độc tố môi trường CAM huỳnh quang đèn UV, có 14 chủng A flavus có biểu màu vàng đậm môi trường CAM, chủng có sắc tố màu vàng nhạt chủng màu trắng (không làm môi trường đổi màu) Dưới ánh sáng đèn tia cực tím, chủng tiết sắc tố màu vàng nhạt môi trường CAM có chủng có xuất huỳnh quang màu xanh Như vậy, có 16 chủng tổng số 23 chủng A flavus sinh độc tố Aflatoxin, chủng lại chủng không độc 3.8 Khả sinh độc tố Aflatoxin môi trường CAM chủng A flavus thu thập từ nông sản thu từ kho bảo quản vùng Nghi Lộc phụ cận Nấm mốc sinh độc tố thường phát triển điều kiện tự nhiên quốc gia vùng nhiệt đới Điều kiện bảo không thích hợp (khi nhiệt độ môi trường 270C, độ ẩm môi trường lớn 62%, độ ẩm kho bảo quản lớn 14 % xâm nhập sâu bọ… nhân tố quan trọng để nấm mốc phát triển sinh độc tố Aflatoxin Sử dụng môi trường CAM để đánh giá tỷ lệ A flavus sinh độc tố Aflatoxin mẫu nấm thu thập từ kho bảo quản nhà dân, thu kết đánh sau: 51 Bảng 3.9 Khả sinh độc tố Aflatoxin môi trường CAM chủng A flavus thu thập từ nông sản thu từ kho bảo quản vùng Nghi Lộc phụ cận Chủng CAM UV Chủng VAL 001 VAN 001 VAN 005 VAL 007 VAN 008 VAL 009 VAN 009 VAL 010 VAN 013 VAL 015 VAN 016 VAL 017 VAN 021 VAL 022 VAL 023 VAN 024 VAL 027 VAN 027 VAL 028 VAN 028 VAL 029 VAN 029 VAN 029 VAL 030 VAL 032 VAN 032 Vàng nhạt Vàng sẫm Vàng nhạt Vàng sẫm Vàng sẫm Trắng Vàng sẫm Trắng Vàng sẫm Vàng nhạt Trắng Vàng sẫm Trắng Trắng Vàng sẫm Vàng sẫm Vàng nhạt Trắng Trắng Trắng Trắng Vàng sẫm Vàng sẫm Vàng sẫm Vàng sẫm Vàng sẫm Xanh nhạt Xanh đậm Xanh Xanh Xanh đậm Tím Xanh Tím Xanh Xanh nhạt Tím Xanh Tím Tím Xanh Xanh Xanh nhạt Tím Tím Tím Tím Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh VAN 050 VAN 052 VAN 053 VAN 054 VAN 057 VAN 074 VAN 078 VAN 080 VAN 092 VAN 094 VAN 095 VAN 097 VAN 098 VAN 099 VAN 100 VAL 101 VAL 101 VAL 102 VAL 104 VAL 106 VAL 110 VAL 112 VAL 113 VAN 115 VAL 116 VAN 117 CAM Vàng sẫm Vàng sẫm Vàng nhạt Vàng nhạt Trắng Trắng Vàng sẫm Vàng nhạt Trắng Vàng nhạt Vàng sẫm Vàng nhạt Trắng Trắng Trắng Vàng nhạt Vàng sẫm Vàng sẫm Vàng sẫm Vàng nhạt Trắng Trắng Vàng sẫm Vàng nhạt Trắng Vàng nhạt UV Xanh Xanh Xanh nhạt Xanh nhạt Tím Tím Xanh Xanh nhạt Tím Xanh nhạt Xanh Xanh nhạt Tím Tím Tím Xanh nhạt Xanh Xanh Xanh Xanh nhạt Tím Tím Xanh Xanh nhạt Tím Xanh nhạt 52 VAL 033 VAL 034 VAN 035 VAN 036 VAL 037 VAL 038 VAL 039 VAL 040 VAN 041 VAL 042 VAN 042 VAL 043 VAL 044 VAN 044 VAL 045 VAN 046 VAL 047 VAN 047 VAN 048 VAL 049 VAN 049 Vàng sẫm Vàng sẫm Vàng nhạt Vàng nhạt Trắng Trắng Vàng nhạt Vàng nhạt Vàng nhạt Vàng nhạt Vàng nhạt Vàng nhạt Trắng Trắng Vàng nhạt Vàng nhạt Vàng sẫm Vàng sẫm Vàng sẫm Vàng sẫm Trắng Xanh Xanh Xanh Xanh Tím Tím Xanh Xanh Xanh Xanh nhạt Xanh nhạt Xanh nhạt Tím Tím Xanh nhạt Xanh nhạt Xanh Xanh Xanh Xanh Tím VAL 118 VAN 118 VAL 120 VAN 120 VAL 121 VAL 122 VAN 123 VAL 125 VAN 125 VAL 126 VAN 126 VAL 127 VAL 129 VAN 130 VAL 131 VAL 133 VAL 134 VAL 138 VAL 140 VAL 146 VAL 149 VAL 150 Vàng sẫm Vàng sẫm Trắng Vàng nhạt Trắng Vàng sẫm Vàng sẫm Vàng sẫm Vàng sẫm Vàng sẫm Vàng nhạt Vàng nhạt Vàng sẫm Vàng nhạt Vàng sẫm Vàng nhạt Trắng Trắng Trắng Vàng nhạt Vàng sẫm Vàng sẫm Xanh Xanh Tím Xanh nhạt Tím Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh Xanh nhạt Xanh nhạt Xanh Xanh nhạt Xanh Xanh nhạt Tím Tím Tím Xanh nhạt Xanh Xanh Qua bảng 3.9 ta thấy 95 chủng A flavus phân lập từ mẫu nông sản bảo quản quy mô nông hộ, nuôi cấy môi trường CAM, sau – ngày có: 39 chủng làm môi trường chuyển sang sắc tố vàng sẫm, 29 chủng vàng nhạt 27 chủng màu trắng Quan sát đĩa môi trường CAM ánh sáng tia cực tím thấy: Có 27 chủng cho màu tím, 45 chủng xuất huỳnh quang màu xanh 23 chủng có huỳnh quang màu xanh nhạt Huỳnh quang màu xanh nhạt, xanh, hay xanh đậm biểu có mặt độc tố Aflatoxin môi trường Nếu lượng Aflatoxin sinh môi trường huỳnh quang có màu xanh nhạt, huỳnh quanh xanh xanh đậm chứng tỏ lượng Aflatoxin tiết vào môi trường nhiều Như vậy, có 68 chủng A flavus tổng số 95 chủng sinh độc tố Aflatoxin, 27 chủng lại chủng A flavus không sinh độc tố có 29 chủng A flavus làm môi trường biến đổi màu vàng 53 nhạt chủng sinh độc tố Aflatoxin sau kiểm tra ánh sáng tia cực tím 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Thành phần nấm hại hạt giống ngô vụ xuân 2011 huyện Nghệ An (Nghi Lộc, Hưng Nguyên, Nam Đàn, Diễn Châu, Yên Thành Anh Sơn) có loài Hầu hết loài nấm xuất phổ biến hạt ngô, đặc biệt hai loài A flavus A niger có mức độ nhiễm cao hạt, sau loài F moniliforme Penicillium sp Trên hạt giống lạc xác định loài nấm, nấm gây hại phổ biến thường xuất hạt giống lạc loài A niger, A.flavus loài Penicillium spp F oxysporum loài nấm khác phổ biến Thành phần nấm bệnh đất trồng lạc, ngô huyện Nghệ An, Thanh Hóa Hà Tĩnh vụ xuân năm 2011 gồm 13 loài thuộc khác Trong loài nấm phổ biến loài Aspergilluss flavus gây bệnh mốc vàng, loài Aspergillus niger gây bệnh mốc đen, Penicillium sp gây mốc xanh lạc, ngô Các loài nấm khác có tỷ lệ xuất thấp Tỷ lệ số mẫu nông sản nhiễm nấm A flavus chợ khảo sát Nghi Lộc Nghệ An cao từ 33,3 – 66,7% Các chợ khu vực Nghi Lộc có tỷ lệ số mẫu nhiễm A flavus cao chợ, từ 53,3 – 66,7 % Các chợ khu vực thành phố Vinh có tỷ lệ nhiễm mẫu nhiễm nấm A flavus thấp 33,5 – 50 % Trong kho bảo quản nhà dân mẫu nông sản thu vùng có tỷ lệ nhiễm A flavus cao: Nghi Phong - Nghi Lộc 72%, Nghi Trung 68% Nghi Ân 40,9% Nghi Long 41,2% Các xã Hưng Thông – Hưng Nguyên, Kim Liên – Nam Đàn Diễn An – Diễn Châu: 50 – 57,1 % Thấp Đỉnh Sơn – Anh Sơn với 17,1 % số mẫu thu bị nhiễm nấm A flavus Trên vùng đất trồng luân canh lạc – lúa có tỷ lệ nhiễm A flavus thấp từ – 20% Giai đoạn phát triển lạc ảnh hưởng lớn đến tỷ lệ nhiễm A flavus Lạc giai đoạn phân cành Diễn Châu, Nam Đàn tỷ lệ nhiễm dao động từ 3,07 – 4,45%; Lạc giai đoạn đâm tia – hình thành củ Hưng Nguyên, Nghi Lộc, Quỳnh Lưu tỷ lệ nhiễm cao dao động từ 10 – 20,6% Thử nghiệm môi trường CAM đèn UV cho thấy Hà Tĩnh có 10 tổng số 14 chủng, Nghệ An có 48 tổng số 58 chủng Thanh Hóa có 55 tổng số 16 chủng A flavus phân lập từ đất có khả sinh độc tố Aflatoxin , chiếm 71,4 % tổng số chủng nghiên cứu Có 23 chủng A flavus phân lập từ nông sản chợ vùng Nghi Lộc thành phố Vinh đánh giá khả sinh độc tố Aflatoxin môi trường CAM huỳnh quang đèn UV có 16 chủng sinh độc tố Aflatoxin , chủng lại chủng không độc Có 68 chủng A flavus sinh độc tố Aflatoxin tổng số 95 chủng phân lập từ mẫu nông sản bảo quản quy mô nông hộ, 27 chủng lại không sinh độc tố có 29 chủng A flavus làm môi trường biến đổi màu vàng nhạt chủng sinh độc tố Aflatoxin sau kiểm tra ánh sáng tia cực tím 10 Sử dụng môi trường thạch nước cốt dừa để chẩn đoán chủng A flavus sinh độc tố Aflatoxin có ưu điểm: (i) dễ chuẩn bị môi trường; (ii) xác định diện độc tố Aflatoxin nhanh chóng rõ ràng huỳnh quang đèn cực tím; (iii) có mặt Aflatoxin làm môi trường bị biến màu vàng cam_là sở để định tính nhanh chóng Aflatoxin mà không cần sử dụng đèn tia cực tím Màu vàng xuất môi trường CAM giúp xác định 94% chủng không sinh độc 71-74% chủng sinh độc tố Aflatoxin Huỳnh quang màu xanh tia cực tím giúp xác định xác 80% chủng không sinh độc tố Aflatoxin , 87% chủng sinh độc tố mức thấp 98% chủng sinh độc tố mức cao Kiến nghị Tiếp tục thu thập thêm mẫu đất, nông sản để đánh giá mức độ ô nhiễm nấm A flavus khu vực Nghi Lộc phụ cận Sử dụng biện pháp đại để đánh giá xác khả sinh độc tố chủng nấm A flavus xác định hàm lượng Aflatoxin nông sản, thực phẩm để đưa khuyến cáo sử dụng TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 [1] Bùi Xuân Đồng, Hà Huy Kế (2004), Nấm mốc phương pháp phòng chống, NXB khoa học kỹ thuật [2] Đậu Ngọc Hào, Lê Thị Ngọc Diệp, ( 2003 ), Nấm mốc độc tố Aflatoxin thức ăn chăn nuôi, NXB nông nghiệp, Hà Nôi [3] Lê Anh Phụng, Nguyễn Thị Kim Loan, Trần Bắc Vi ( 2006 ), Phân lập Aspergillus flavus có khả sinh Aflatoxin cao từ bánh dầu phộng bị mốc, Tạp chí KHKT nông lâm nghiệp, số 1/ 2006, tr 76 – 78 [4] Ngô Bích Hảo (2007), Bài giảng môn bệnh hại hạt giống, NXB trường đại học nông nghiệp I [5] Nguyễn Minh Châu, Nguyễn Thị Hòa Bình, Nguyễn Minh Tâm (1995 ), Mức nhiễm aflatoxin ngô số tỉnh Việt Nam, Tạp chí nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm, 9: 396 – 397 [6] Nguyễn Thị Cẩm Vi (2010), hiểm họa từ nông sản nhiễm nấm mốc, tạp chí khoa học ứng dụng, số 12/2010, tr: 14 – 12 [7] Nguyễn Thùy Châu, Nguyễn Hòa Bình, Nguyễn Minh Tâm ( 1997 ), mức độ nhiễm nấm mốc ngô miền bắc Việt Nam thu hoạch năm 1995 – 1996, tạp chí nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm, 139 – 141, 3/1997 [8] Ralt G Dietzgen, Loại trừ nhiễm Aflatoxin lạc, Trung tâm nghiên cứu nông nghiệp quốc tế Ôxtraylia canberra 1999, tr 31 – 32 [9] Trần Tuấn Tú, Đàm Quang Hiếu, Hoàng Thị Ngát, Lê Huy Hàm Phạm Xuân Hội,( 2008 ), nghiên cứu xác định nấm Aspergillus sinh độc tố aflatoxin lạc phản PCA đặc hiệu, Tạp chí khoa học công nghệ nông nghiệp Việt Nam số 5, tr: 60 – 68 [10] Challen, C, J.Lunec, W Warren( 1992 ), Analysis of the 53 tumor – suuppressor geen in hepatocellular carcinomas from Britain, Hepatology 16: 1362- 1366 [11] Charles Thom and Kenneth B Kaper, (1945), A manual of the Aspergillus, MBLWHOl Library [12] Cleveland, T E., and D Bhatnagar (1990),Evidence for de novo synthesis of an aflatoxin pathway methyltransferase near the cessation of active growth and the onset of aflatoxin biosynthesis in A 57 paraciticus mycelia, Can J Microbio 32: 1.5 [13] F Degola, E Berni, C Dall’Asta, E Spotti, R Marchelli, I Ferrero and F M Restivo (2007), Original article: A multiplex RT-PCR approach to detect aflatoxigenic strains of aspergillus flavus, Journal of Applied Microbiology ISSN, No 103: p.409-17 [14] H K Abbas, R.M Zablotowicz, and M.A Locke, (2004), Spatial variability of Aspergillus flavus soil populations under different crops and corn grain colonization and aflatoxin, Can J Bot 82 (12): 1768 – 1775 [15] Hamed K Abbas, W T shier: B.W.Horn and M A weaver, (2004) Cultural Methods for Aflatoxin Detection: 295-315 [16] Keller, N P., H C Dischinger, Jr., D Bhatnagar, T E., Cleveland, and A H J Ullah, (1993), Purification of a 40 kilodalton methyltransferase active in the aflatoxin biosynthetic pathway, Appl Environ Microbiol 59: 479 – 484 [17] Kurtzman C P., et al (1987), Aspergillus flavus and Aspergillus tamari, Antonie Leeuwenhoek 53:147-157 [18] Lin, M T., and J C Dianese 1976 A coconut-agar medium for rapid detection of aflatoxin production by Aspergillus spp Phytopathology 66:1466-1469 [19] P Rodrigues, C Soares, Z Kozakiewicz, R R.M.Paterson, N Lima and A.Venancio (2007), Identification and characterization of Aspergillus flavus and aflatoxins, Communicating current research and educational topics and trends in Applied Microbiology [20] Payne, G A., G J Nystorm, D Bhatnagar, T E Cleveland, and C P Woloshuk, (1993), Cloning of the afl-2 gene involved in aflatoxin biosynthesis from Aspergillus flavus, Appl Environ Microbiol, 59: 156 – 162 [21] Perng-Kuang Chang, Jeffery W Cary and Gary A Payne (1993), Cloning of the Aspergillus parasiticus apa-2 gene associated with the regulation of aflatoxin biosynthesis, Applied and Environmental Microbiology Vol 59, No.10:p.3273-3279 58 [22] Roni Shapira et al (1996), Detection of aflatoxigenic molds in grains by PCR, Applied and Environmental Microbiology Vol 62, No.9:p.3270-73 [23] S N Arseculeratne, L M de Silva, S Wijesundera, and C H S R bandunatha, (1969), Coconut as a Medium for the Experimental production of aflatoxin, Applied Microbiology, Vo.18, No.1: p.88-94 [24] Shapira R., N Paster, M Menasherov, O Eyal, A Mett, T Meiron, E Kuttin, and R Salomon (1997), Development of Polyclonal Antibodies for Detection of Aflatoxigenic Molds Involving Culture Filtrate and Chimeric Proteins Expressed in Escherichia coli, Applied and Environmental Microbiology, Mar 1997, p 990-995 [25] Stroka J., Van Otterdijk R and Anklam E., (2000), Immunoaffinity column clean-up prior to thin-layer chromatography for the determination of aflatoxins in various food matrices, J Chromatogr A Dec 29; 904 (2): 251-6 [26] T Mihoko et al (2006), Molecular analysis of an inactive aflatoxin biosynthesis gene cluster in Aspergillus oryzae RIB strains+, Applied and Environmental Microbiology Vol 72, No.1: p.484-490 [27] Wang – Ching Ho and Wen – Hsiung Ko, (1997), A simple method for obtaining single – spore isolates of fungi, Bot, Bull, Acard, Sin (1997) 38: 41 – 44 [28] Wolfgang Henke, Kerstin Herdel, Klaus Jung, Dietmar Schnorr and Stefan A.Loening (1997), Betaine improves the PCR amplification of GC rich DNA sequences Nucleic acids research, Vol.25, No.19, p 3957-58 [29] Yabe, K., Y Ando, and T Hamasaki, (1991), Desaturase activity in the branching step between aflatoxinB1 and G1 and aflatoxin B2 and G2, Agric Biol Chem 55: 1907 – 1911 [30] Yu J., Cleveland T E., Nierman W C and Bennett J W (2005), Aspergillus flavus genomics: gateway to human and animal health, food safety, and crop resistance to diseases, Rev Iberoam Miccl 2005; 22: 194-202 59 [31] Yu, J., J W Cary, D Bhatnagar, T E Cleveland, N P Keller, and F S Chu, (1991), Cloning and characterization of a cDNA from Aspergillus paraciticus encoding an O-methyltransferase involved in aflatoxin biosynthesis, Appl Environ Microbiol., inpress [32] Yu J et al (2004), Minnireview:Clustered pathway genes in aflatoxin biosynthesis, Applied and Environmental Microbiology Vol 70, No.3: p 1253-62 [33] Zheng-You Yang, Won-Bo Shim, Ji-Hun Kim, Seon-Ja Park, Sung-Jo Kang, Baik-Sang Nam and Duck-Hwa Chung (2004), Detection of aflatoxin-producing molds in Korean fermented foods and grains by mutiplex PCR, Journal of food protection, Vol.67, No.11,p 2622-26 [34] Zsuzsanna Mayer, Paul Farber and Rolf Geisen (2003), Monitoring the production of aflatoxin B1 in Wheat by measuring the concentration of Nor-1 mRNA, Applied and Environmental Microbiology Vol 69, No.2:p.1154-58 [35] http://www.biodiversity library.org [36] http://www.aspergillus flavus.org [37] http://www.moitruong.com.vn [38] http://www.nutifood.com.vn/Default.aspx [39] http://www.vnn.vn [40] http://ybacsi.com/y-hoc-pho-thong 60 MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG QUÁ TRÌNH LÀM ĐỂ TÀI Thu mẫu nông sản Thu mẫu đất Đặt hạt nông sản PDA 61 Đặt hạt nông sản giấy thấm Làm slide định loại thành phần loài nấm đất nông sản Mẫu nấm Aspergillus flavus cấy 62 Màu sắc Aspergillus flavus đèn UV Mầu sắc A flavus môi trường CAM [...]... các loài A flavus sinh độc tố Aflatoxin, góp phần làm giảm thiểu tác hại của nấm trong sản xuất nông nghiệp và tăng giá trị nông sản chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: "Nghiên cứu phương pháp chẩn đoán nấm bệnh Aspergillus flavus sinh độc tố Aflatoxin bằng môi trường thạch nước cốt dừa (Coconut agar medium)" 1.2 Mục đích và yêu cầu nghiên cứu 1.2.1 Mục đích nghiên cứu Xác định thành phần bệnh hại... cực tím Huỳnh quang xuất hiện do Aflatoxin được sinh ra nhiều sau 32 giờ chuyển sang môi trường thạch nước cốt dừa Màu vàng cam trên môi trường thạch nước cốt dừa là một cơ sở để kết hợp với màu của huỳnh quang để đánh giá khả năng sinh độc tố Aflatoxin của Aspergillus spp Sự biến đổi màu sắc trên môi trường 20 thạch nước cốt dừa không thể sử dụng để định tính Aflatoxin sinh ra mà không cần kết hợp với... đường độc chuẩn Standard Curve Phương pháp này trải qua nhiều bước và cần một kháng thể thứ cấp nên sai số cao và chiếm nhiều thời gian [2] 1.4.4 Phương pháp PCR dùng chẩn đoán nấm sinh độc tố Aflatoxin Để tiện lợi hoá việc phát hiện nấm Aspergillus spp sinh độc tố Aflatoxin , gần đây phương pháp dựa vào kỹ thuật PCR đang được nghiên cứu áp dụng rộng rãi [24] Ngoài tính tiện lợi và dễ sử dụng, phương pháp. .. Đánh giá sự thay đổi màu sắc môi trường Đánh gía huỳnh quang dưới đèn UV bước sóng 365 nm Chuyển khuẩn lạc nấm mốc từ môi trường Màu vàng trên môi trường giúp xác định được 94% chủng không sinh độc và 71-74% chủng sinh độc tố Aflatoxin Huỳnh quang màu xanh giúp xác định được chính xác 80% chủng không sinh độc tố Aflatoxin, 87% chủng sinh độc tố ở mức thấp và 98% chủng sinh độc tố ở mức cao Cho khuẩn lạc... tích để xác định các độc tố nấm mốc trong thực phẩm đã được phát triển và hoàn thiện từ những năm 1960 Độc tố nấm mốc là những hợp chất có cấu trúc hóa học và tính chất lý hóa khác nhau nên cần những phương pháp kiểm tra đặc trưng riêng Chính vì vậy đã xuất hiện nhiều phương pháp xác định như: Phương pháp truyền thống, phương pháp vật lý hóa học, phương pháp hóa sinh học, các phương pháp dựa trên cơ sở... đèn cực tím Môi trường thạch nước cốt dừa rất dễ dàng để chuẩn bị và định tính được độc tố Aflatoxin nhanh chóng, đơn giản với trang thiết bị rất đơn giản [18] 1.4.2 Phương pháp vật lý hóa học Hiện nay, các phòng thí nghiệm đang sử dụng các phương pháp sắc ký để phát hiện nấm Aspergillus spp sinh độc tố Aflatoxin như: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lớp mỏng cao áp (HPLC) Ưu điểm của phương pháp này là... đất trồng ngô, lạc nhiễm A flavus Nghiên cứu phương pháp chẩn đoán nấm bệnh A flavus sinh độc tố Aflatoxin bằng môi trường thạch nước cốt dừa (CAM) làm cơ sở đánh giá tình hình nhiễm Aflatoxin trên nông sản và trên đất trồng lạc, ngô 1.2.2 Yêu cầu Xác định thành phần nấm hại nông sản (lạc, ngô) trên mẫu nông sản thu được tại một số xã, huyện vùng Nghệ An Xác định thành phần nấm hại trên mẫu đất thu được... pháp này còn có ưu điểm là phát hiện nhanh, nhạy, chính xác nấm Aspergillus spp sinh độc tố Phương pháp chẩn đoán sử dụng kỹ thuật PCR được dựa trên kết quả nghiên cứu hệ gen nấm Aspergillus ssp sinh độc tố Aflatoxin và con đường sinh tổng hợp Aflatoxin [12, 16] Các nghiên cứu cho thấy, ít nhất có 20 gen tham gia vào con đường sinh tổng hợp Aflatoxin , trong đó có 4 gen quan trọng là ver-1, omt-1, nor-1... et al (1987) kết luận rằng việc sản xuất sắc tố màu vàng không phải là một yếu tố dự báo đáng tin cậy của số lượng Aflatoxin trong tất cả các loại môi trường nuôi cấy Theo Lin và Dianese (1976), môi trường thạch chứa nước cốt dừa với pH được điều chỉnh ở mức 6.9 được phát triển để xác định độc tố Aflatoxin sinh ra bởi Aspergillus spp Trên môi trường này, nếu Aflatoxin được tạo ra, môi trường sẽ có huỳnh... xuất khuẩn lạc, phân tích bằng ELISA, sắc ký lỏng cao áp hiệu suất cao (HPLC) hoặc các phương pháp phân tích khác TLC giúp đánh giá chính xác 92% chủng không sinh độc và 100% chủng sinh độc tố Aflatoxin ởmức cao Hình 1.3 Kết hợp các phương pháp để đánh giá chủng sinh độc tố Aflatoxin của các loài Aspergillus spp (Nguồn Hamed K Abbas và cộng sự, 2004) 1.4.1 Phương pháp sử dung môi trường CAM (Coconut Agar ... sản xuất nông nghiệp tăng giá trị nông sản tiến hành nghiên cứu đề tài: "Nghiên cứu phương pháp chẩn đoán nấm bệnh Aspergillus flavus sinh độc tố Aflatoxin môi trường thạch nước cốt dừa (Coconut... dụng, phương pháp có ưu điểm phát nhanh, nhạy, xác nấm Aspergillus spp sinh độc tố Phương pháp chẩn đoán sử dụng kỹ thuật PCR dựa kết nghiên cứu hệ gen nấm Aspergillus ssp sinh độc tố Aflatoxin. .. nấm khó phát qua phương pháp giấy thấm Phương pháp dùng lượng hạt mẫu 400 hạt 2.3.3 Phương pháp nấu môi trường 2.3.3.1 Môi trường thạch nước cốt dừa (Coconut agar medium) Môi trường CAM môi trường