Xây dựng phương pháp phát hiện nhanh Clostridium Perfringens bằng kỹ thuật khuếch đại Recombinase polymerase amplification (RPA)

NTTU-NCKH-04 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỎNG KẾT ĐÈ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN Bộ - GIẢNG VIÊN 2020 Tên đe tài: Xây dựng phương pháp phát nhanh Clostridium perfringens bang kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt Recombinase polymerase amplification (RPA) Số hợp đồng: 2020.01.03 Chủ nhiệm đề tài: Trần Hồng Diềm Đơn vị công tác: Viện kỹ thuật công nghệ cao NTT Thời gian thực hiện: 3/2020 - 9/2020 MỤC LỤC MỤC LỤC ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẲT iv DANH MỤC BẢNG BIÉU, HÌNH ẢNH V TÓM TẤT KẾT QUẢ NGHIÊN cứu vi MỞ ĐẤU vii CHƯƠNG TÓNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giói thiệu chung c perfringens 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm sinh vật học c perfringens 1.1.2.1 Hình thái 1.1.2.2 Tính di động 1.1.2.3 Khả gây bệnh 1.2 Giói thiệu chung phương pháp RPA 1.2.1 Thành phần RPA 1.2.2 Cơ chế hoạt động cua phương pháp RPA CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 2.2 Đối tượng nghiên cứu 2.3 Vật liệu nghiên cứu 2.3.1 Các hóa chất sử dụng đề tài 2.3.2 Dụng cụ sử dụng đề tài 2.3.3 Các thiết bị sử dụng đề tài 10 2.3.4 Vật liệu sinh học sử dụng nghiên cứu 10 2.4 Phương pháp nghiên cứu 10 2.4.1 Phương pháp xác định trình tự thành phần phản ứng RPA 10 2.4.2 Phương pháp nuôi cấy tăng sinh chủng vi khuẩn c perfringens môi trường Tryptic Soy Broth (TSB) 11 2.4.3 Phương pháp tách chiết DNA tổng số vi khuẩn 11 2.4.4 Phương pháp PCR 12 ii 2.4.5 Phương pháp RPA vói DNA vi khuẩn tách chiết 13 2.4.6 Phương pháp đếm khuẩn lạc định lượng nồng độ tế bào vi khuẩn c perfringens 14 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 16 3.1 Kết kiểm tra hoạt động cua mồi 16 3.2 Kết khảo sát nhiệt độ phản ứng RPA 18 3.3 Kết khảo sát thời gian phản ứng RPA 19 3.4 Kết khảo sát giới hạn phát RPA DNA tách chiết 20 3.5 Kết khảo sát tính đặc hiệu mồi DNA tách chiết 22 3.6 Kết RPA tế bào vi khuẩn (không tách chiết) 23 3.7 Kết khảo sát giới hạn phát RPA tế bào vikhuẩn (không tách chiết) 24 3.8 Kết RPA với tế bào c perfringens diện mẫu thịt 24 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 26 4.1 Kết luận 26 4.2 Kiến nghị 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO 27 iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHŨ VIÉT TẤT pg: picogram pl: Microlitre nm: Nanometer bp: Base pair kb: Kilobase RPA: Recombinase Polymerase Amplification PCR: Polymerase Chain Reaction LAMP: Loop-mediated isothermal amplification DNA: Deoxyribonucleic acid RNA: Ribonucleic acid CTAB: Cetyl trimethylammonium bromide CFU: Colony-forming unit PCI: Phenol: Chloroform: Isoamylacohol Tm: Melting Temperature F: Forward R: Reverse OD: Mật độ quang iv DANH MỤC CÁC BẢNG BIÉU, sơ ĐỊ, HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hình dạng khuẩn lạc cùa vi khuẩn c.perfringens môi trường phân lập TSC Hình 1.2 Cơ chế hoạt hóa protein tái tổ hợp có phàn ứng Hình 1.3 Cơ chế hoạt động cùa RPA Hình 2.1 Dung dịch sau ly tâm tách thành lớp Hình 2.2 Chu trình nhiệt cùa phàn ứng PCR dùng nghiên cứu 12 Hình 2.3 Quy trinh thực phương pháp trãi đém khuẩn lạc 15 Hình 3.1 Kết quà PCR kiểm tra hoạt động cùa mồi DNA tách chiết 16 Hình 3.2 Ket kiểm tra thành phàn phản ứng RPA với DNA gen C perfringens tách chiết 17 Hình 3.3 Ket quà khảo sát nhiệt độ tối ưu cho phản ứng RPA 18 Hình 3.4 Ket quà khảo sát thời gian phàn ứng RPA 20 Hình 3.5 Khảo sát giới hạn phát RPA PCR sừ dụng mồi 21 Hình 3.6 Ket q kháo sát tính đặc hiệu moi RPA 22 Hình 3.7 Kết quà phản ứng RPA trực tiếp với tế bào vi khuẩn c perfringens 23 Hình 3.8 Ket quà khảo sát giới hạn phát RPA phát trực tiep DNA té bào vi khuẩn không tách chiết 24 Hình 3.9 Ket RPA với te bào vi khuẩn mẫu thịt 25 Bảng 2.1 Các hóa chất sừ dụng đề tài Bảng 2.2 Các dụng cụ sử dụng đe tài Bảng 2.3 Các thiết bị sữ dụng đe tài Bảng 2.4 Các chùng vi sinh vật sữ dụng nghiên cứu 10 Bảng 2.5 Trình tự mồi đặc trưng cho c perfringens 10 Bảng 2.6 Thành phần phàn ứng PCR 12 Bảng 2.7 Thành phần phàn ứng RPA 13 Bảng 3.1 Ket quâ khào sát nhiệt độ 18 Bảng 3.2 Ket khảo sát thời gian 19 Sơ đồ 2.1 Sơ đồ thực phản ứng RPA 14 V TÓM TẮT KÉT QUẢ NGHIÊN cứu STT Kết quà đạt Cơng việc thực Phát triến, tối ưu quy trình Xác định trình tự moi đặc trưng, khuếch đại đẳng nhiệt RPA để thành phan phàn ứng, tối ưu nhiệt độ, phát xác có mặt cùa thời gian phản ứng DNA đặc trưng cho c perfringens STT Thu mẫu, xữ lý mầu thịt đơng Quy trình RPA có khả phát lạnh khảo sát quy trình RPA te bào c perfringens mầu thịt mầu nhiễm Hoàn thiện báo cáo đề tài Báo cáo hoàn chinh Sản phẩm đăng ký Sản phẩm đạt Quy trinh hồn chình Quy trình phát c perfringens Báo đăng tạp chí NTT Bàn thảo báo Thời gian thực hiện: - 9/2020 Thời gian nộp báo cáo : 11/2020 vi MỞ ĐẦU Ngộ độc thực phẩm mối quan tâm hàng đầu Việt Nam nước giới Theo thống kê từ Cục An toàn thực phẩm (Bộ Y tế), mồi nãm Việt Nam có khoảng 250-500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000 - 10.000 nạn nhân 100-200 ca từ vong Trong năm 2017, nước xảy 139 vụ ngộ độc thực phẩm với 3.869 người bị ngộ độc, 24 trường hợp tứ vong Tại Việt Nam, ngộ độc thực phẩm vi sinh vật chiêm 33 - 49% nguyên nhân gây ngộ độc, chủ yếu chùng Salmonella, E coli, c perfringens Listeria Trong số vi khuẩn này, có đen 20 - 30 % vụ ngộ độc tập the độc tố từ vi khuẩn c perfringens từ thực phẩm đơng lạnh chế biến hâm nóng khơng cách Tháng 7/2016, 119 thực khách bị ngộ độc ăn phâi thức ăn bị nhiễm c perfringens chế biên từ thực phẩm đông lạnh nhà hàng Nha Trang, Khánh Hịa Thực tế, chì tiêu an toàn thực phẩm cũa sản phấm thịt thịt đơng lạnh ln có tiêu c perfrngens với yêu cầu 10 CFU/g c perfringens trực khuẩn yếm khí, gram dương có nhiều đất, cống rảnh, ruột động vật, khơng cần nhiều khơng khí để phát triển, nhiễm vào thịt bị, gà, vịt đặc biệt thực phẩm đông lạnh, sản sinh bon loại độc tố gây ngộ độc cho người với triệu chứng đau bụng, tiêu chảy đen 24 Việc xét nghiệm xác định vi sinh vật gây bệnh thực phẩm nước ta hầu hết dựa phương pháp truyền thống với quy trình phức tạp, cần có kỳ thuật viên có kinh nghiệm ve vi sinh vật đặc biệt tốn thời gian Bộ kít sừ dụng PCR truyền thong phát nhanh vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm vần cần thời gian từ 14 đến 24 phụ thuộc vào thiết bị phòng thí nghiệm, hạn chế việc sữ dụng thực địa Từ thực te trên, muốn phát triển phương pháp để phát nhanh, xác c perfringens mẫu thực phẩm đông lạnh ứng dụng kĩ thuật khuếch đại nhiệt RPA, kĩ thuật mà phân ứng nhân bàn DNA đích thực tai nhiệt độ ổn định, không cần phải dụng máy gia nhiệt đắt tiền, đong thời thời gian phản ứng ngan vần đạt độ nhạy độ đặc hiệu cao Đe tài thành cơng việc phát triển tối ưu quy trình phát xác trình tự đặc trưng c perfringens thời gian 25 phút nhiệt độ 39°c, nhạy 10 lần so với phàn ứng PCR thông thường Mặc khác, quy trình RPA phát triển nghiên cứu phát thành công c perfringens mầu dịch đong loại thịt đông lạnh, điều the vii khả ứng dụng cùa phương pháp phát nhanh, chồ mẫu thực phẩm nhiễm vi khuẩn gây ngộ độc viii CHƯƠNG TÓNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung c perfrũĩgens Là vi khuẩn Gram dương, hình que, kị khí khơng bắt buộc, sinh nội bào từ gây bệnh thuộc chi Clostridium [1] c Perfringens thường có tự nhiên có the tìm thấy thành phần phổ biến phân rã cùa thực vật, cặn biển, đường ruột cùa người động vật có xương sống, trùng đất Nhiễm tràng c perfringens cho biểu hoại từ mô, bệnh nhiễm trùng máu, viêm túi mật phong nôn hoại từ Các độc tố liên quan đến hoại từ khí gọi a-toxin, tác động vào màng tế bào, tạo khoáng trống phá vỡ chức te bào bình thường 1.1.1 VỊ trí phân loại Hình 1.1 Hình dạng khuẩn lạc cùa vi khuẩn C.perfringens mơi trường phân lập TSC • Giới: Bacteria • Ngành: Firmicutes • Lóp: Clostridia • Bộ: Clostridiales • Họ: Clostridiaceae • Chi: Clostridium • Lồi: c perfringens 1.1.2 Đặc điểm sinh vật học cùa c perfringens 1.1.2.1 Hình thái Clostridium perfringens có dạng hình chữ nhật, đầu có the trịn thẳng, chiều dài 3-8 pin 0,4-1,2 pm Khi quan sát kính hiển vi, thấy ba hình thái phân bố chính: riêng lẻ, theo chuỗi gói nhó [1] 1.1.2.2 Tính di động Mặc dù khơng có c.perfringens có the lướt bề mặt the cùa chúng lót bang sợi tơ (sợi filament) từ đầu đen cuối [2] Các biến the siêu di động (hypermotile) SM101, thường thấy phát sinh cạnh cùa khuấn lạc đĩa thạch Video kính hiến vi chuyển động trượt cùa chúng cho thấy rang chúng có cấu trúc thành sợi dài, mỏng cho phép chúng di chuyển nhanh vi khuẩn có Trình tự gen sử dụng đề xác định (các) nguyên nhân cùa kiểu hình siêu di động dần xuất trực tiếp cùa chúng So sánh chúng, chủng SM124 SM127, dần xuất cùa dòng SM101 SM102 tương ứng, chứa 10 nucleotide polymorphisms (SNPs) so với dòng mẹ [2] Các đột biến gen phân chia te bào đặc điếm chung cùa dòng siêu di động [2] 1.1.2.3 Khả gây bệnh Ngộ độc thực phẩm c perfringens thường nhiễm trùng nhẹ c perfringens phân bo rộng rãi phân, đất, khơng khí nước Thịt bị nhiễm gây nhiều đợt dịch bùng phát Bào từ c perfringens sống sót nấu chín; thịt bị nhiễm c perfringens đe nhiệt độ phịng chí đun nóng đen 60°C (140 °F, bàn hâm nóng) khoảng thời gian vi khuẩn vần có the nảy mầm nhân lên, tạo lượng lớn vi khuẩn Dịch bùng phát thường xảy sở thương mại nhà [3] Trong đường tiêu hoá, c perfringens sản sinh độc tố ruột hoạt động ruột non Chỉ có c perfringens type A xác định xác liên quan đen hội chứng ngộ độc thực phấm [3] Viêm da xác định xác liên quan đen hội chứng ngộ độc thực phẩm này.giêm da xác định xác liên quan riệu chứng phổ biến tiêu chảy phân nước đau thắt bụng Nôn mửa sot triệu chhứng không thường Bàn thảo báo - Trấn Hóng Diẻm Hộp thư đến X Tran Hong Diem tới tapchikhcn • Kinh gừì Ban b ẽn tập tạp chí Khoa hoc vã cõng nghệ Em Trán nóng ẻm nhản viên viên Kỳ tht cơng nghé C30 NTT Em gừI ban b ẽn tập báo phiếu đãng ký nộp cho tap chi (file đinh kèm), kính nhị ban b ẽn tap xem qua giúp em Trân trong, Trán Hồng Diễm tệp đính kẽm □ Tạp chi, KHCN tới ■» Ban Biên tãp tap chi Khoa hoc Công nghè dà nhận đưoc thông tin Trân trọng cám ơn BBT Phieu dang ki nop Phát nhanh Clostridium perfringens kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt Recombinase polymerase amplification (RPA) Lâm Ngọc Ngân Anh1, Trần Hồng Diềm2 'Trường Đại học Quốc tế, Đại học Quốc gia TP.HCM 2Viện Kĩ thuật công nghệ cao, Đại Học Nguyễn Tất Thành, phường 13, quận 4, TP Hồ Chí Minh E-mail: thdiemữ) ntt.edu, Tóm tắt Ngộ độc thực phấm mối quan tâm hàng đầu Việt Nam nước giới Clostridium perfringens xem tác nhân gây ngộ thực phẩm phố biến giới chi sau Salmonella, có thức ăn chưa chế biến kĩ lưỡng khơng hâm nóng cách thức ăn đóng hộp Trung tâm kiếm sốt phịng ngừa dịch bệnh Hoa Kì (CDC) ước tính mồi năm có đến triệu ca ngộ độc liên quan đen vi sinh vật Ớ Việt Nam, tháng 7/2016, 119 thực khách bị ngộ độc ăn phải thức ăn bị nhiễm c perfringens chế biến từ thực phẩm đông lạnh nhà hàng Nha Trang, Khánh Hòa c perfringens trực khuân yếm khí, gram dương có nhiều đất, cống rành, ruột động vật, nhiễm vảo loại thịt đặc biệt thực phấm đông lạnh, sàn sinh độc tổ (chủ yếu enterotoxin, CPE) gây ngộ độc cho người với triệu chứng đau bụng, tiêu chày đến 24 Việc xét nghiệm xác định vi sinh vật gây bệnh thực phẩm nước ta hầu hết dựa phương pháp truyền thống phân lập, ni cấy vi khuẩn hóa sinh PCR với quy trình phức tạp, cần cỏ kỹ thuật viên có kinh nghiệm, máy luân nhiệt chuyên dụng đặc biệt hao tốn thời gian Từ thực tế trên, muốn phát triến phương pháp đe phát nhanh, xác c perfringens mẫu thực phầm đông lạnh ứng dụng kĩ thuật khuếch đại nhiệt RPA, kĩ thuật mà phán ứng nhân bàn DNA đích thực chi tai nhiệt độ nhất, không cần phải dừ dụng máy gia nhiệt đắt tiền, đồng thời thời gian phàn ứng ngắn vần đạt độ nhạy độ đặc hiệu cao Đe tài thành cơng việc phát triến tối ưu quy trình phát xác trinh tự đặc trưng mẫu DNA tách chiết c perfringens thời gian 25 phút nhiệt độ 38°c, nhạy 10 lần so với phản ứng PCR thông thường (RPA cỏ phát Ipg DNA tách chiết vi khuẩn) Điều làm tiền đề cho việc phát trực tiếp c perfringens mẫu thịt thức ăn khác Abstract Food poisoning has becoming one of the most concerns in Viet Nam as well as all over the world Clostridium perfringens has been considered as one of pathogens contributing to foodborne illness coming from canned food or meat which is not processed, cooked or reheated properly, ranking only after Salmonella Centers for Disease Control and Prevention (CDC) estimates there are approximately one million cases caused by c perfringens- linked poisoning annually in the US Similarly, in Viet Nam, 119 customers were poisoned by c perfringenscontained frozen food at a restaurant in Nha Trang, Khanh Hoa in 7/2016 c perfringens is a Gram-positive, anaerobic bacterium, which can be abundantly found in the wide range of places such as soil, sewer tunnels, animal and human intestine, frozen meat c perfringens produces toxin, especially enterotoxin causing food poisoning in human with stomachache and diarrhea within to 24 hours In order to detect this pathogenic bacterium, several isolated, cultured, biochemical methods as well as the molecular diagnostic technique PCR, could be performed under complicated processes which is time-consuming This also requires experienced technicians and an expensive thermal cycler Therefore, in this research, Recombinase Polymerase Amplification (RPA), an isothermal PCR method, was developed and optimized to rapidly detect c perfringens with high specificity and sensitivity but it is time-saving and economical The experiment successfully diagnosed the presence of c perfringens in the DNA extracted samples at 38°c within 25 minutes, with high specificity and 10-time higher sensitivity compared with PCR (Limit of Detection of RPA on c perfringens is Ipg DNA extract) This establishes a foundation for rapid and direct detection on c perfringens food samples Tổng quan c Perfringens, vi khuấn Gram dương, hình que, kị khí khơng bắt buộc, sinh nội bào tử gây bệnh thuộc chi Clostridium1’1 Vi khuấn phân lập phát loài vi sinh vật mói vào năm 1891 bời William H.Welch'2' Bộ gen cùa c Perfringens có kích thước trung bình từ 3.0-4.1 Mb'3' c Perfringens chia thành loại A, B, c, D, E dựa vào loại độc tố chủ yếu mà chúng sinh a-toxin, p-toxin, £-toxin Itoxin'4’ Ngồi cịn có độc tố quan trọng khác enterotoxin (CPE), 02- toxin, 0-toxin NetB|3' Trừ vùng 16S rRNA xem gen báo ton có độ tương đồng cao (>99.1%), 87.4% khác biệt 56 chúng c Perfringens nhánh'5' Điều khiến c Perfringens trở thành vi khuẩn Gram dương đa dạng chủng loại nhất'5' c Perfringens chịu nhiệt độ khoảng từ 12°C-60°C sinh sôi nhanh chóng từ 43°C-47°C'6' c Perfringens phân bố rộng rãi tự nhiên đặc biệt đất, thức ăn, chất thài hệ tiêu hóa người động vật'2' Trong số loài loại độc tố, nhiều nghiên cứu chi c Perfringens type A sinh enterotoxin (CPE) chứng minh tác nhân gây nên ngộ độc thực phẩm người (70%) '3'''8'' 'ọ'.Thức ăn điển loại thịt khơng sơ chế che biến kĩ lưỡng, bảo quản hâm nóng khơng cách, khơng đảm bảo nhiệt độ thời gian cần thiết nguyên nhân chỉnh gây nên ngộ độc c Perfringens Ngoài ra, vi vi sinh vật kị khí, thực phẩm đóng chai, đóng hộp khơng đạt tiêu chuẩn an tồn thực phấm nơi c Perfringens sinh sôi tạo nội bào tử độc tố gây ngộ độc Những ca ngộ độc thực phầm vi khuẩn báo cáo lần đầu Mỹ Anh vào thập niên 194O[I0' Mỹ, số liệu thống kê cho thấy có đến triệu ca ngộ độc thực phẩm liên quan đến c Perfringens type A năm, đứng thứ hai sau ngộ độc thực phẩm Siz/znoweZ/d'11''12' Gen mã hóa cho enterotoxin tim thấy cà nhiễm sắc thề lẫn plasmid Tuy nhiên, CPE plasmid gây nên viêm dày ruột thay ngộ độc thực phẩm bời gen nhiễm sắc thể'12' Ngồi CPE, c Perfringens type A cịn sinh lượng lớn a-toxin Độc tố dẫn đen hoại tử tế bào biếu qua tượng hoại thư sinh khí'13' Một điều quan trọng CPE tạo qua trình sàn sinh nội bảo từ, từ 15%-30% CPE tồng protein tạo thành'14' Việc có liên quan đến tiêu chảy bị ngộ độc thực phẩm'15' Ngộ độc thực phấm c Perfringens thường nhẹ biểu hiện, thường bị người bệnh xem nhẹ bó qua Triệu chứng thường gặp co thắt ruột tiêu chày không gây sốt nôn mửa Chúng thường kéo dài từ 12 đến 24 tiếng'16' Theo khuyến cáo cùa Centers for Disease Control and Prevention (CDC), thực phấm loại thịt cần bào quàn lạnh 4°c hâm nóng 74°c để có thề loại bị tế bào c Perfringens độc tố mà chúng sinh Ngồi ra, đế bất hoạt nội bào tử cùa vi khuẩn này, thức ăn cần chế biến hâm nóng nhiệt độ cao thời gian dài'17' Wang et al cho thấy 90% nội bào tứ bị bất hoạt đun nóng từ 90°C-100°C vịng 10 phút đến 30 phút'18' Việc ăn chín uống sơi, ăn thức ăn có nguồn gốc xuất xử rõ ràng phần giảm thiều ngăn chặn ngộ độc thực phẩm Ớ Việt Nam, phần lớn việc phát loài vi khuẩn dựa phương pháp truyến thống nuôi cấy vi sinh, phân lập tế bào, sinh hóa'3' Ngày nay, với phát triển cùa phương pháp chuẩn đoán phân tử, PCR áp dụng với độ chinh xác, tính đặc hiệu độ nhạy cao Tuy nhiên phương pháp kế mặt hạn chế tiêu tốn thời gian, đòi hòi thiết bị kĩ thuật viên có kinh nghiệm liên quan bị hạn che phịng thí nghiệm, khơng sứ dụng thực địa Việc vận chuyền mẫu đen phòng thiết bị chứa đựng nhiều rủi ro thời gian cơng tác báo qn mầu Chính the, phương pháp đơn giản, nhanh độ nhạy, đặc hiệu độ xác đàm bào yêu cầu cấp thiết đế tiết kiệm thời gian, công sức nhanh chóng giảm thiều thiệt hại sức khóe tính mạng ngộ độc thực phẩm gây Kỹ thuật khuếch đại đăng nhiệt Recombinase polymerase amplification (RPA) phát triển Niall Armes vào năm 20061'91 So với phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt khác khuếch đại đắng nhiệt trung gian vòng lặp (LAMP), khuếch đại dựa trinh tự axit nucleic (NASBA), khuếch đại phụ thuộc helicase (HDA) khuếch đại vòng tròn (RCA), RPA phương pháp mới, chi chiếm 7.08% thị trường năm 2016 số lượng báo ngày tăng năm120' Kỹ thuật RPA trở thành công cụ phân tử hiệu quã, RPA xác định tác nhân gây bệnh cách xác, độ đặc hiệu nhạy cao, nhanh chóng từ 10 đến 30 phút tiết kiệm chi phí nhờ vào ưu điếm như: bước chuẩn bị mẫu đơn giàn, nhiệt độ hoạt động thấp bao gồm khoảng nhiệt độ môi trường (25-42°C), không yêu cầu máy biến nhiệt, tiện lợi có sẵn kít thương mại đơng khơ120' Có nhiều phương pháp đọc kết sản phẩm RPA điện di gel agarose (Agarose Gel Electrophoresis), huỳnh quang định lượng thời gian thực (Real-time quantitative fluorescence) lateral flow strips1211 Vì thế, RPA có tiềm áp dụng vùng nhiễm mầm bệnh ngồi phịng thí nghiệm RPA bao gom ba protein đế thay the quy trình biến tính nhiệt PCR thơng thường: protein tái tồ hợp recombinase (protein T4 UvsX), protein liên kết DNA sợi đơn (T4 gp32) DNA polymerase (Sau Bsu polymerase) hoạt động kéo dài mồi tổng hợp mạch khuếch đại1201 Với hỗ trợ cùa protein đồng yếu tố khác yếu tố tải (protein T4 UvsY), nâng lượng ATP Creatine kinase sử dụng Phosphocreatine cung cấp Polyethylene glycol (Carbowax 20M) đại diện cho môi trường đại phân tử thực thế, recombinase kết hợp với hai mồi tạo thành phức hợp nucleoprotein Sự có mặt yếu tố tải (protein T4 UvsY) giúp ngăn chặn protein liên kết DNA sợi đơn (T4 gp32) gắn vào mồi thay vỉ gắn vào mạch đơn DNA120' Sau đó, phức hợp qt sợi kép DNA tìm vị trí tương đồng1211 Một vị trí tương đồng tìm thấy, sợi nucleoprotein với moi oligonucleotide đơn xâm nhập gan vào sợi đôi DNA tương đồng, tạo cấu trúc D-loop: sau protein liên kết DNA sợi đơn (T4 gp32) gan vào tạo nên ồn định cho cấu trúc sợi đơn, ngăn chặn việc chập lại cùa sợi DNA vừa bị tách1221 [23] Nhờ vào trình thủy phân ATP, recombinase tách khỏi phức hợp nucleoprotein, nhường chỗ cho DNA polymerase gắn vào mồi thực trình kéo dài từ đầu 3’1”1'[23! Cứ the trình lặp lại tiêu hao het ATP, mồi, protein khác Vât liêu phương pháp nghiên cứu Mau vi khuấn Nghiên cứu sừ dụng chủng vi sinh vật c perfringens có nguồn gốc từ ATCC 10543 lưu trữ Viện Kỹ thuật Công nghệ cao NTT; mẫu phân lập Samonella enterica, Staphylococus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes, Bacillus cereus Thief ke moi Dựa theo nghiên cứu trước đó, gen plc lựa chọn làm gen mục tiêu phát c perfringens tính ôn định độ báo tồn cao trình tự gen Trinh tự moi RPA đặc trưng cho c perfringens thiết kế phần mềm Primer3 (https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) Ket quâ cặp moi CF, CR với trình tự Bàng lựa chọn sau kiếm tra thông số mồi phát mồi PCR insilico NCBI Blast Các trình tự mồi tổng hợp 1DT Singarpore sử dụng làm mồi cho tất cã thí nghiệm nghiên cứu Bảng Trinh tự mồi đặc trưng cho c perfringens Tên Trình tự 5’ - 3’ CF CGCGCTAGCAACTAGCCTATGGGCTGGAGC CR GTTCTACTTATCCAGATTATGATAAGAATG Phương pháp nuôi cấv tăng sinh chúng vi khuẩn c perfringens môi trường Tryptic Sov Broth (TSB) Thành phần môi trường TSB dạng tống hợp bao gồm cao thủy phân casein, cao thúy phân đậu nành, muối NaCl, dextrose, muối dibasic potassium phosphate, pH ( Ở 25°C) 7.3±0.2 Pha 30 g môi trường 200 ml nước, hap nhiệt độ 121°c 20 phút Sau làm mát môi trường, khuấy sử dụng Môi trường pha bào quản tù mát Sau đó, cho pl dịch vi khuẩn cho vào ml môi trường TSB, phũ lớp dầu khống bề mặt mơi trường, vortex đem ủ 37°c tăng sinh qua đêm Phương pháp tách chiết DNA tông số cùa vi khuân DNA tống số vi khuẩn tách chiết bang phương pháp CTAB với ba cơng đoạn phá màng tế bào, giãi phóng acid nucleic; loại bỏ protein kết tủa, hịa tan DNA Đầu tiên, ml dịch tăng sinh hút sau mang ly tâm làm lang tế bào vi khuấn (2 lần) Sau ly tâm thu tủa bỏ dịch, cho 800 pl CTAB vào, thêm 0.5 pl P-mercaptoethanoỊ vortex mạnh Mang ủ bế điều nhiệt 60°C Tiếp đến, thêm 600 pl PCI (25:24:1) vào, trộn lạnh phút, ly tâm lạnh 14000 rpm/10 phút 4°c (có thê lặp lại lần) Tách chiết DNA vi khuẩn, ta sừ dụng dung dịch PCI ti lệ 25:24:1 pH = (pH dung dịch có tinh acid dùng đế tách chiết RNA, pH dung dịch thuộc vùng bazo đế tách DNA) Đen công đoạn cuối cùng, DNA tủa bang Ethanol 99% ti lệ 1:2,5 ủ -80°C qua đêm Mầu ly tâm 14000rpm/15 phút 4°c, bò dịch thu tủa (tủa màu trắng đục DNA dạng ran), phơi cho Ethanol bay hết Sau Ethanol bay hơi, hịa tan tủa DNA khống 50 pl nước Sinh học phân tử DNA tách chiết kiểm tra phương pháp đo OD máy Genova Plus Tray Cell bảo quản -20°C Phương pháp PCR Một phản ứng PCR có tống thể tích 20p đựng tube PCR, cho vào 0.4pM moi F, 0.4 pM moi R, 4pl 5X Mytaq reaction buffer, 0.4pl enzym DNA polymerase, 2pl DNA template nước cất lần Trộn nhẹ nhàng thành phần tube bang micropipette, spin máy ly tâm đế dồn thành phần phàn ứng xuống đáy tube Cho tube vào máy luân nhiệt chọn chạy chương trinh theo chi số sau 94°C đề biến tính DNA, 61.6°C đế gắn mồi 72°c đế thực q trình kéo dài Đọc kích thước sán phẩm bang phương pháp chạy điện di gel agarose Phương pháp RPA với DNA vi khuân tách chiêt Phản ứng RPA sử dụng kit thương mại TwistAmp® Basic công ty TwistDX Đầu tiên, 47.5pl stock dung dịch hoàn nguyên chuẩn bị eppendorf 1,5 ml theo thành phần sau 2.4 (d moi F (10 pM), 2.4 (11 moi R (10 (1M), 29.5 (11 dung dịch đệm hồn ngun TwistAmp® rehydration buffer, 2(11 DNA template lại nước cất lần Vortex trộn spin máy ly tâm dồn thành phần phàn ứng đính thành xuống đáy eppendorf Chuyến 47.5 (11 dung dịch hoàn nguyên vào ống pellet TwistAmp® Basic đơng khơ Dùng micropipette trộn đến bột đơng khơ tan hồn tồn, hạn chế bọt khí xuất trộn Thêm 2.5 (11 magnesium acetat 280 mM vào ong pellet, trộn bang micropipette Sau thêm magnesium acetat phàn ứng xảy Đặt ống pellet vào bế điều nhiệt (nhiệt độ từ 37 đến 42°C) ủ phút Sau phút, lấy mẫu trộn nhẹ nhàng dung dịch bang micropipette tránh tạo bọt khí bó lại vào bế điều nhiệt ú thêm 30 phút Kết thào luận Kết quã Kết kiếm tra hoạt động mồi Bộ moi RPA thiết ke đặc trưng cho c perfringens kiếm tra khả hoạt động phản ứng PCR thông thường phàn ứng RPA với DNA gen tách chiết bang phương pháp CTAB Ket quà điện di sân pham PCR Hình Ket điện di kiếm tra hoạt động cùa mồi kỹ thuật PCR cho thay sàn phẩm PCR tạo thành có kích thước lớn 200 bp so vói thang chuấn, với kích thước sản phấm 230 bp thiết kế, đồng thời chứng âm khơng có sản phấm tạo thành thể gel điện di Ket quà cho thấy DNA tách chiết dùng làm mạch khn cho phản ứng đồng thời mồi thiết ke có khả khuếch đại DNA mục tiêu Sừ dụng sản phấm tách chiết DNA đế thực phàn ứng RPA Twist Amp® Basic kít với protocol RPA Tinh sản phẩm RPA cách trộn tỉ lệ 1:1 với dung dịch PCI (25:24:1), đem ly tâm !4000rpm/10 phút/4°c Sau ly tâm dung dịch tách thành lớp, sản phấm khuếch đại tinh lớp cùng, suốt Ket quã sản phẩm RPA song song với sản pham PCR (sử dụng chung cặp mồi) thang DNA chuấn kích thước 100 bp Ket điện di sản pham RPA so với sàn phấin PCR Hình Ket điện di cho thấy, vạch kết quã phản ứng RPA vị trí thang 200 bp, đủng với kích thước sàn phấm mong muốn, đồng thời, kích thước sản pham RPA tương đồng với kích thước sàn phấm phán ứng PCR trước Cặp mồi sứ dụng hồn tồn phù hợp cho cà phương pháp RPA PCR đề khuếch đại DNA vi khuẩn c perfringens Kỹ thuật RPA sử dụng DNA tách chiết, mồi thiết kế phát thành cơng trình tự gene mục tiêu c perfringens đồng thời thành phần phàn ứng hoạt động tốt Kết quà khảo sát nhiêt đô phản ứng RPA Trong nghiên cứu phân ứng RPA kháo sát mốc nhiệt độ 35°c, 37°c, 38°c, 39°c, 40 °C Khảo sát lặp lại lần Ket điện di kháo sát phàn ứng RPA nhiệt độ khác cho thấy xuất vệt sáng với cường độ khác nhiệt độ phản ứng khác Phàn ứng không xảy chứng âm, vệt sáng tương ứng với nhiệt độ: 35°c, 37°c, có cường độ sáng thấp chứng tị phàn ứng RPA khơng hoạt động tốt nhiệt độ (Hình 3), đồng thời sản phẩm tạo nhiệt độ phàn ứng 38°c vạch sáng rõ nét, khơng có khác biệt độ sáng sản phẩm nhiệt độ cao Vi thế, nhiệt độ 38°c nhiệt độ tối ưu cho phàn ứng RPA, nhiệt độ sứ dụng cho thí nghiệm Kết quà khảo sát thời gian phán ứng RPA Thời gian kéo dài cùa phán ứng RPA định tói số lượng DNA sàn phấm hình thành phân ứng Trong nghiên cứu này, thời gian phàn ứng khảo sát khoáng thời gian 15 - 40 phút với mốc phán ứng cách phút Các phán ứng RPA thực 38°c với nong độ DNA khuôn Khảo sát lặp lại lần Kết quà khảo sát phản ứng RPA mốc thời gian khác cho thấy xuất vạch sản phẩm khác mốc thời gian khác Thời gian tối thiều đế phản ứng RPA xảy vạch sáng gel điện di 25 phút (Hình 4), đồng thời lượng sản phẩm tạo khơng có thay đối lớn từ phút 25 phàn ứng Ket đồng lần khảo sát Vì thời gian 25 phút lựa chọn đế thực phàn ứng RPA nghiên cứu Kết khảo sát giới han phát hiên cùa RPA DNA tách chiết Giới hạn phát phàn ứng khảo sát với DNA tách chiết có nồng độ ng pha lỗng bậc 10 nồng độ 100 pg - 10'2 pg thực phản ứng RPA với điều kiện phàn ứng tối ưu trước để khảo sát giới hạn phát phàn ứng Ket khảo sát Hình cho thấy, phản ứng RPA xảy với lượng DNA thấp pg có phàn ứng, phản ứng khơng xảy lượng DNA mục tiêu thấp pg (Hình 5B) Đong thời, kết q có thấy RPA nhạy phàn ứng PCR thông thường 10 lần ưu phản ứng nhanh nhạy RPA nghiên cứu (Hình 5) Kết khảo sát tính đặc hiệu mồi đoi với DNA tách chiết Tính đặc hiệu cùa mồi dành cho phàn ứng RPA đánh giá bang việc thực phản ứng RPA với chúng vi khuẩn gần gũi bao gom vi khuấn s enterica, s aureus, p aeruginosa, L monocytogenes B cereus, chúng vi khuẩn loại phố biến gây ngộ độc thực phấm đồng thời triệu chứng gây độc người với nhiều điếm tương dong c perfringens Ket quà khảo sát cho thấy phương pháp RPA đà tối ưu nghiên cứu có thề phân biệt trinh tự gen mục tiêu c perfringens so với vi khuẩn gần gùi, RPA chi khuếch đại DNA mục tiêu c perfringens có phản ứng (Hình 6) Ket q cho thấy, mồi lựa chọn thực phương pháp RPA tối ưu có tính chun biệt cao cho c perfringens Thảo luận c perfringens tác nhân phố biến gây nên ngộ độc thực phẩm Với thiệt hại hậu nghiêm trọng ngộ độc gây ra, việc áp dụng phương pháp khuếch đại đăng nhiệt RPA vào việc nghiên cứu phát vi khuẩn tiến khoa học nước nhà Bởi lẽ, RPA kế thừa ưu điếm phương pháp PCR độ xác, đặc hiệu nhạy cao Hơn nữa, RPA khắc phục điểm hạn chế kĩ thuật luân nhiệt tiết kiệm thời gian, chi phí, có the thực trường gây ngộ độc cấp bách So với phương pháp PCR đắng nhiệt khác, RPA có ưu điếm định chi cỏ hai mồi (Kỹ thuật LAMP có đến 4-6 mồi), cách thiết kế mồi đơn giản tương tự phương pháp PCR Bên cạnh đó, RPA tạo sản phấm khuếch đại dễ dàng so sánh đánh giá độ tin cậy xác so với phương pháp PCR tiêu chuẩn Thực tế, việc phát triền tối ưu phương pháp phát nhanh tác nhân gây bệnh chưa trọng Chi COVID-19 xuất với lân lan nhanh chóng nguy hiềm dịch bệnh, kit realtime PCR hay phát nhanh SARS-CoV-2 nghiên cứu phát triến Việt Nam Vì thế, việc nghiên cứu phát triến kit thương mại phát nhanh mầm bệnh RPA việc cần thiết đế đề phòng cho dịch bệnh nguy tới mà lồi người khơng lường trước Nghiên cứu phát triền thành công phương pháp phát nhanh c perfringens bang RPA nhiệt độ tối ưu 38°c chi 25 phút với giới hạn phát pg DNA tách chiết, nhạy gấp 10 lần so với PCR truyền thống, nhiệt độ 38°c gần với nhiệt độ thế, phàn ứng RPA cỏ giữ lòng bàn tay đe xảy điều kiện khơng có máy ù nhiệt Theo kết quà có được, phương pháp cịn có tính đặc hiệu cao, có khả phân biệt c perfringens với vi khuấn gây ngộ độc thực phấm gần gũi diện phàn ứng Tính đặc hiệu phản ứng ban đầu tối ưu bời việc thiết kế mồi đặc hiệu Bên cạnh tính đặc hiệu ưu tiên, độ dài hai mồi đàm bảo yêu cầu đê hoạt động tốt độ dài khoảng từ 2035 nucleotide, %GC nẳm khoảng 30-70°/