Nghiên cứu này ứng dụng kĩ thuật RPA (recombinase polymerase amplification) khuếch đại acid nucleic đẳng nhiệt để phát hiện nhanh Clostridium perfringens. RPA có thời gian phản ứng nhân bản DNA đích ngắn, thực hiện chỉ tại một nhiệt độ, đạt được độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Mời các bạn cùng tham khảo!
Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 13 50 Phát hi n nhanh Clostridium perfringens b ng k thu t RPA (recombinase polymerase amplification) khu ch ng nhi t Tr n H ng Di m2*, Lâm Ng c Ngân Anh1 Tư i h c Quốc t Vi K t Công ngh * thdiem@ntt.edu.vn i h c Quốc gia Tp.HCM i h c Nguy n T t Thành Tóm t t Clostridium perfringens c xem m t tác nhân gây ng c th c ph m ph bi n nh t ch sau Salmonella C perfringens tr c khu n y m khí, G có nhi t, ru ng v t, có th nhi m vào lo i th t, c bi t th c ph m nh, gây ng i với tri u ch ng tiêu ch phát hi n vi khu n gây b nh này, p, ni c y, sinh hóa thơng ng thu P R c th c hi n theo quy trình ph c t p, tốn nhi u th i gian V c t viên có kinh nghi m, máy luân nhi t chuyên d t ti n Nghiên c u ng d t RPA (recombinase polymerase amplification) khu ng nhi phát hi n nhanh Clostridium perfringens RPA có th i gian ph n ng nhân b N ng n, th c hi n ch t i m t nhi c nh c hi u cao K t qu xác l c m t quy trình phát hi n xác a C perfringens th i gian 25 phút t i nhi 38 0C, nh n so với t PCR, t o ti cho vi c phát hi n tr c ti p C perfringens lo i m u th c ph m ® 2021 Journal of Science and Technology - NTTU T ng quan C perfringen vi khu n g khí khơng b t bu c, sinh n i bào t gây b nh thu c chi Clostridium [1] C perfringens c chia thành nhánh A, B, C, D E d a vào lo c tố ch y αβειtoxin [1] C perfringens có th ch c nhi kho ng t (12 60) C sinh sôi nhanh chóng t (43 47) 0C [1], th chúng có kh ố r ng rãi t c bi t, th ch t th i h tiêu hóa c ng v t [1] C ng pháp truy n thống phát hi n loài vi khu n th c ph m bao g m C perfringens d a nuôi c y vi sinh, phân l p t bào, sinh hóa, Đại học Nguyễn Tất Thành Nh n 18.12.2020 c t 25.03.2021 Cơng bố 09.04.2021 T khóa C perfringens, RPA, ng nhi t pháp ch , PCR vớ xác, tính c hi nh y cao Tuy nhiên, cịn có h n ch tiêu tốn th i gian, c n thi t b luân nhi t, t viên có kinh nghi m khó th c hi n t i th a [2, 3] C ng nhi t t RPA (recombinase polymerase amplification) khu i acid nucleic ng nhi t c phát tri n b i Niall Armes [4] kh c ph c h n ch c a truy n thống RPA thay th quy trình bi n nhi t c PCR, bao g m ba protein h p (recombinase) T4 UvsX làm tách m ch DNA s i u, protein liên k t DNA s T4 gp32 giúp Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 13 51 m i g n vào v ng DNA m c tiêu, sau N Sau ho c Bsu polymerase) ho t ng kéo dài m i t ng h p m ch khu it os n ph m tồn b q trình ph n ng có th x y ch t i m t nhi K thu t RPA m t công c phân t hi u qu nh tác nhân gây b nh m t cách xác, nhanh chóng - ph n ng x y kho ng th i gian (10 30) phút, ti t ki m chi phí chu n b m n, nhi th p (25 42) 0C, không c n máy u nhi t ti n l i có sẵn b m [5] Ngồi ra, có c k t qu RPA khác n di gel agarose, huỳ ng th i gian th c (Real-time quantitative fluorescence) que th lateral flow c k t qu RPA d a nguyên t c kháng nguyên kháng th n ph m RPA s u b ng m t kháng nguyên c hi u với kháng th có que th , nh n th hi n v ch que th có th quan sát tr c ti p b ng m ng [6] RP n ch ng vi sinh th c ph m ph bi S enterica [7], E coli [8], P aeruginosa [9], L Monocentogenes [10] vớ nh c hi u cao, có th c k t qu nhanh, RPA tr thành m t công c ti phát hi n lo i vi sinh v t nói chung t i vùng nhi m m m b nh ngồi phịng thí nghi m Nghiên c u xây d ng m t quy trình RPA phát hi n nhanh C Perfringens, thêm m t l a ch n bên c nh t truy n thống V t li u 2.1 M u vi khu n Nghiên c u s d ng ch ng vi sinh v C perfringens T ữ Vi K t Công ngh cao NTT; m u phân l p c a S enterica, S aureus, P.aeruginosa, L monocytogenes, B cereus P y tách chi t DNA C perfringens c nuôi c ng TSB nhi 37 C T bào vi khu c thu nh n b ng li tâm 10.000 rpm phút; DNA b gen vi khu n c tách chi t tinh s ch b pháp CTAB [11] DNA tách chi c b o qu n dung d ch TE 1X t i nhi -20 0C dùng làm m ch khuôn cho thí nghi m [11] 2.3 Thi t k m i Trong nghiên c u gen plc c l a ch n làm gen m c tiêu phát hi n C perfringens tính b o t n cao c a trình t ng th i gen plc hi n di n c E c a C perfringens [12] Trình t m RP C perfringens c thi t k b ng ph n m m Primer3 (https//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) Sau ki m tra thông số m i kh n c a m i b ng PCR in silico NCBI Blast, c p m i CF, CR với trình t th hi n t i B c l a ch n gen m c khu i b i c p m i có kích ước 230 bp Trình t m c t ng h p b i IDT Singapore s d ng làm m i cho t t c thí nghi m nghiên c u B ng Trình t m C Perfringens Tên Trình tự ’ – ’ CF CGCGCTAGCAACTAGCCTATGGGCTGGAGC CR GTTCTACTTATCCAGATTATGATAAGAATG 2.4 P P R Thành ph n ph n ng PCR bao g m 0,4 µM m i CF, 0,4 µM m i CR, µL 5X Mytaq reaction buffer, 0,4 µL enzyme µL DNA m ước sinh h c phân t Ph n c th c hi n với 30 chu kì nhi t 94 0C 30 s , 61,6 0C 30 s 72 0C 20 s S n ph P R nh b y n di gel agarose P RP Ph n RP c th c hi n với b kit TwistAmp® Basic (TwistDX), ph n ng RPA bao g μL i F μM μL R μM μL d m hồn ngun TwistAmp® rehydration ff μL N ước sinh h c phân t Ph n c th c hi n nhi (35 40) 0C th i gian (15 40) phút K t qu c phân tích b n di gel agarose K t qu 3.1 K t qu ki m tra ho ng c a m i B m RP c thi t k C perfringens c ki m tra kh ng b ng ph n P R ng ph n ng RPA với DNA b c tách K t qu c th hi n t i Hình cho th y s n ph m PCR t o thành có kích ước lớ ới thang chu ng vớ ước s n ph c thi t k ng th i Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 13 52 ch ng âm khơng có s n ph m t o thành th hi n n di K t qu cho th y b m c thi t k có kh N c tiêu có th s d ng cho kh o sát ti p theo nghiên c u K t qu n di cho th y, v ch k t qu c a ph n ng RPA v ước s n ph m mong muố ng th ước s n ph m RP ng vớ ước s n ph m c a ph n P R ướ V ,c pm d ng hoàn toàn phù h p cho c RP P R khu i DNA vi khu n C perfringens K thu t RPA s d ng DNA tách chi t, m c thi t k phát hi n gen m c tiêu c a C perfringens 3.2 K t qu kh o sát nhi ph n ng RPA Hình K t qu PCR ki m tra ho ng c a m i DNA tách chi T + n ng ch a DNA tinh s ch c a C.perfrigens; (-) ch ước sinh h c phân t thay cho DNA m c tiêu N c dùng làm m th c hi n ph n ng RPA Twist Amp® Basic kit với protocol RPA Tinh s ch s n ph m RPA b ng dung d ch PhenolChlorofromIsoarmyl Alcohol K t qu s n ph m RPA song song với s n ph m PCR K t qu n di s n ph m RPA so với s n ph m PCR c th hi n t i Hình Hình K t qu ki m tra thành ph n ph n ng RPA với DNA b gen C perfringens c tách chi T RP s n ph m khu i b ng RPA; PCR s n ph m khu i b P R; Ladder thang DNA 100 bp Đại học Nguyễn Tất Thành Hình K t qu kh o sát nhi tố n ng RPA Trong nghiên c u ph n RP c kh o sát mốc nhi (35, 37, 38, 39 40) 0C Kh o sát c l p l i l n K t qu n di kh o sát s n ph m c a ph n ng RPA t i nhi khác cho th y xu t hi n v t sáng vớ khác t i nhi ph n ng khác S n ph m t o t i nhi ph n ng 38 0C th hi n v ch sáng rõ nét, khơng có s khác bi t v sáng s n ph m nhi t V , nhi 38 0C nhi tố cho ph n ng RPA, nhi c s d ng cho thí nghi m ti p theo 3.3 K t qu kh o sát th i gian ph n ng RPA Th i gian kéo dài c a ph n ng RPA quy nh tới số ng DNA s n ph c hình thành ph n ng Trong nghiên c u này, th i gian ph n c kh o sát kho ng th i gian (15 40) phút với mốc ph n ng cách phút Các ph n ng RPA c th c hi n 38 0C với m t n DNA khuôn Kh c l p l i l n K t qu kh o sát ph n ng RPA t i mốc th i gian khác cho th y xu t hi n v ch s n ph m khác t i mốc th i gian khác Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 13 Hình K t qu kh o sát th i gian ph n ng RPA Trong ch sáng th hi n s n ph RP c th c hi n t i mốc th i gian (15 40) phút Ladder thang DNA 100 bp Th i gian tối thi hi n v ph n ng RPA x y có th n di 25 phút (Hình 4), 53 ng th ng s n ph m t o khơng có s i lớn t phút 25 c a ph n ng K t qu có s ng nh t l n kh o sát Vì th th i gian 25 phút c l a ch th c hi n ph n ng RPA ti p theo nghiên c u 3.4 K t qu kh o sát giới h n phát hi n c RP ối với DNA tách chi t Giới h n phát hi n c a ph n c kh o sát với DNA tách chi t có n c pha loãng b c 10 v n (100 10-2) pg th c hi n ph n ng RPA vớ u ki n ph n c tố ưu ướ kh o sát giới h n phát hi n c a ph n ng K t qu kh o sát Hình 5B cho th y, ph n ng RPA có th x y vớ ng DNA th p nh t pg có ph n ng th i, k t qu qu có th y RPA nh y n P R H ng 10 l n th hi ph n ng nhanh nh y c a RPA nghiên c u (Hình 5) A B Hình Kh o sát giới h n phát hi n c RP P R T A giới h n phát hi n ph n ng PCR B giới h n phát hi n ph n ng RPA 3.5 K t qu kh c hi u c a m ối với DNA tách chi t T c hi u c a b m i dành cho ph n ng RPA ng vi c th c hi n ph n ng RPA với ch ng vi khu n g m vi khu n S enterica, S aureus, P aeruginosa, L monocytogenes B cereus, ch ng vi khu n ày lo i ph bi n gây ng c th c ph ng th i th hi n tri u ch i với nhi ng C perfringens K t qu kh o sát cho th y phư RP c tố u có th phân bi t trình t gen m c tiêu c a C perfringens so với vi khu n g RP khu i DNA m c tiêu C perfringens có ph n ng (Hình 6) K t qu cho th y, b m i l a ch n th c hi RP c tố chuyên bi t cao cho C Perfringens K t qu kh o sát cho th RP c tố u có th phân bi t trình t gen m c tiêu c a C perfringens so với vi khu n g RP khu i DNA m c tiêu C perfringens có ph n ng, Hình K t qu cho th y, b m i l a ch n th c hi RP c tố t cao cho C perfringens Đại học Nguyễn Tất Thành Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 13 54 K t lu n Hình K t qu kh o sát t c hi u c a b m i RPA T C perfringens; S enterica; S aureus; P aeruginosa; L monocytogenes B cereus Đại học Nguyễn Tất Thành Vi sinh th c ph m mố u c v sinh an toàn th c ph m hi n nay, C.perfringens m t vi sinh v t ph bi u, gây nên nhi u v ng c th c ph m t i Vi t Nam Th c t cho th y vi c ki m soát vi khu n gây b nh th c ph ỏi phát tri t mớ n có th th c hi n t i chỗ u ki n h n ch v thi t b Nghiên c u s d RP phát hi n nhanh C perfringens D a nguyên lí khu ch i c a PCR với vi c s d ng hai m i, RPA k t h p lo i protein tái t h p DNA th c hi n khu n gen m c tiêu t i m t nhi cố nh Nghiên c công vi c phát hi n C perfringens b ng ph n ng RPA th i gian ph n ng 25 phút t i nhi t 38 0C Ph n ng có kh n pg DNA tinh s ch c a C perfringens, nh n so với PCR s d ng m t b m i Các k t qu th hi n kh ng d ng cao c pháp RPA vi sinh th c ph ng th i t o ti phát tri n b kit phát hi n nhanh nghiên c u ti p theo Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ Số 13 55 Tài li u tham kh o Navarro M.A., McClane B.A., and Uzal F.A (2018) Mechanisms of Action and Cell Death Associated with Clostridium perfringens Toxins Toxins (Basel), 10(5) Zhao, X., Lin, C.-W., Wang, J & Oh, D H Advances in rapid detection methods for foodborne pathogens J Microbiol Biotechnol 24, pp 297–312 (2014) Li, J et al Recombinase Polymerase Amplification (RPA) Combined with Lateral Flow Immunoassay for Rapid Detection of Salmonella in Food Foods 9, (2019) Piepenburg, O., Williams, C H., Stemple, D L., & Armes, N A (2006) DNA detection using recombination proteins PLoS biology, 4(7), e204 Li, J., Macdonald, J., & von Stetten, F (2018) Review a comprehensive summary of a decade development of the recombinase polymerase amplification The Analyst, 144(1), pp 31–67 Lob I M & O’S K R f advances Trends Anal Chem 98, pp 19–35 (2018) Wu, H et al A Recombinase Polymerase Amplification and Lateral Flow Strip Combined Method That Detects Salmonella enterica Serotype Typhimurium With No Worry of Primer-Dependent Artifacts Front Microbiol 11, (2020) Hu, J et al Rapid analysis of Escherichia coli O157H7 using isothermal recombinase polymerase amplification combined with triple-labeled nucleotide probes Mol Cell Probes 50, 101501 (2020) Jin, X J et al Application of recombinase polymerase amplification in the detection of Pseudomonas aeruginosa Zhonghua Shao Shang Za Zhi Zhonghua Shaoshang Zazhi Chin J Burns 34, pp 233–239 (2018) 10 Du, X.-J., Zang, Y.-X., Liu, H.-B., Li, P & Wang, S Recombinase Polymerase Amplification Combined with Lateral Flow Strip for Listeria monocytogenes Detection in Food J Food Sci 83, pp 1041–1047 (2018) 11 William S and Helene Feil, A Copeland JGI-Bacterial-DNA-isolation-CTAB-Protocol-2012 12 Petit, L., Gibert, M & Popoff, M R Clostridium perfringens toxinotype and genotype Trends Microbiol 7, pp 104–110 (1999) Rapid detection Clostridium perfringens by recombinase polymerase ampification (RPA) Diem Hong Tran2*, Lam Ngoc Ngan Anh1 International University, Vietnam National University Ho Chi Minh City NTT Hi Tech Institute * thdiem@ntt.edu.vn Abstract Clostridium perfringens has been considered as one of pathogens contributing to foodborne illness ranking only after Salmonella C perfringens is a Gram-positive, anaerobic bacterium, which can be abundantly found in the wide range of places such as soil, animal intestine and frozen meat C perfringens causes food poisoning in human with stomachache and diarrhea In order to detect this pathogenic bacterium, several isolated, cultured, biochemical methods as well as PCR technique could be performed under complicated processes which is time-consuming This also requires experienced technicians and an expensive thermal cycler This study applies RPA (recombinase polymerase amplification) isothermal nucleic acid amplification technique to rapidly detect Clostridium perfringens RPA has a short reaction time for target DNA replication, is performed at only one temperature, and achieves high sensitivity and specificity The results have established an accurate detection procedure characteristic of C perfringens in 25 minutes at 38 0C, 10 times more sensitive than PCR techniques, creating a premise for direct detection C perfringens on food samples Keywords C perfringens, RPA, isothermal Đại học Nguyễn Tất Thành ... thermal cycler This study applies RPA (recombinase polymerase amplification) isothermal nucleic acid amplification technique to rapidly detect Clostridium perfringens RPA has a short reaction time... c k t qu nhanh, RPA tr thành m t công c ti phát hi n lo i vi sinh v t nói chung t i vùng nhi m m m b nh ngồi phịng thí nghi m Nghiên c u xây d ng m t quy trình RPA phát hi n nhanh C Perfringens, ... Popoff, M R Clostridium perfringens toxinotype and genotype Trends Microbiol 7, pp 104–110 (1999) Rapid detection Clostridium perfringens by recombinase polymerase ampification (RPA) Diem Hong