Nghiên cứu thu nhận kháng thể đa dòng đặc hiệu phục vụ sản xuất bộ kit phát hiện nhanh độc tố vi tảo gây mất trí nhớ cho người (domoic acid)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG LÊ NGỌC VIỆN NGHIÊN CỨU THU NHẬN KHÁNG THỂ ĐA DÒNG ĐẶC HIỆU PHỤC VỤ SẢN XUẤT BỘ KIT PHÁT HIỆN NHANH ĐỘC TỐ VI TẢO GÂY MẤT TRÍ NHỚ CHO NGƯỜI (DOMOIC ACID) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HOÀ - 2018 vA DAo rAo TNUOUGDAI HQC I\HATRANG s0 crao DUC * NTU D t H9c r{HA TRA}IG r9t9 lf, Ncec vrEN NGHrtn ctru THU IvHAI\ xnAnc rHn B,q, oduc DAc nrpfpnUcv{rsa,nr xuir Be KIT puAr HrENI{HANH rbvl rAo cAvuAr rnilyHocHtrwctrot bqc (DOMOICACID) LUAN VAI\ THAC SI ^Y- tl Nghnh: Cdng ngh$ sinh hgc Mii 6042A201 s6: I/QD-DHNT ngiy 2l /612017 96/QD-DHNT nsiy 09 /3 12018 Quy6t illnh giao aA ta,i: Quy6t itinh thirnh I$p IID: 55 Nghy bfro vQ: fil4l20r8 Nguli hurirrrg Ofin kihoa hgc: r PGS.TS vO NGoc BoI TS oAo vlnr rIA Chu tich trqi OAng: PGS.TS IYGO UANC NCNIA Phdng Dho tpo sau il4i hgc: KHANH HOA - 2018 LOI CAM DOAN TOi xin cam doan c16y ld c6ng trinh nghiCn criu cria tdi dugc hodn sU thinh dudi tdi tro cria dA tii: "llghiin cru phdt ffiAn b0 KIT phat hi€n nhanh mQt sti d\c t(i vi tdo sdn phdm thrty sdn" TS Ddo ViQt Ha ldm chu nhiQm vd t6i le thdnh vi6n tham gia Cic sti ligu, k6t qui n0u lupn v[n ldr trung thyc vi cl6 dugc nhiQm eC tai cho ph6p c6ng b5 lufln v[n Kh6nh Hoi, ngAy 22 thing ndm 2018 Tac giit lupn v[n LG Nggc ViQn 111 chu Lor cAnn oN Pe hoen thAnh LuQn v6n niy Tru6c trtit tOi xin gui t6i Ban Gi6m hiQu Trucrng Dpi hqc Nha Trang, Ban Chil nhiQm Khoa C6ng nghe ThUc phAm vlr Khoa Sau dpi hgc sg kinh trQng, nidm tu hio dugc hqc t?p SU vi nghiOn cuu t4i Trudrng nhirng ndm qua bi6t crn sAu s[c nh6t t6i xin dugc gidnh cho thAy: PG.TS Vfr Ngqc BQi - Trucrng khoa C6ng nghe ThUc phAm vi TS Dio ViQt He - Ph6 Vien trucrng - Vien Hii ducrng hqc Nha Trang dd tpn tinh hucrng d6n vd dQng vi6n t6i sr5t qu6 trinh thyc hien lufln v6n Xin ch6n thdnh citmcrn TS Ddo ViCt HA - chu nhiQm dA tii c6p Nhd nudc "NghiAn c*u phdt ffiAn bQ KIT phdt hi€n nhanh mQt sd dpc t() vi tdo san phdm thfiy sdn" dA tei ffq kinh phi, cho ph6p t6i dugc tham gia de tdi vd su dpng sti tgr', nghiCn ciru b6o cito 1u0n vdn Xin gui ldi cim on sflu sic dtin Ban Gi6m d6c Trung t6m Phrip y Kh6nh Hoi, dd tao di6u kiQn vdr cho ph6p t6i dugc di hqc d€ ndng cao trinh dQ Xin c6m cm quy thAy c6 gi6o ViQn Cdng nghe Sinh hqc Mdi truong - Trucrng Dpi hgc Nha Trang, cic cin b0 - phdng Hoa sinh - Vien H6i ducrng hqc Nha Trang dd tpn tinh giirp dd vi tao diOu kiQn cho t6i s.r6t thoi gian thUc hien de tai thdi gian vtra qua Xin c6m crn c6c th6y cO phin biQn dd cho t6i nhfmg loi khuy6n quf b6u d€ c6ng trinh nghiCn ciru dugc hoin thenh c6 ch6t luqmg Dac biQt xin dugc ghi nhd tinh cdm, sg giirp dd cua gia dinh vd bpn bd lu6n ludn chia se kip thdi ctng t6i qu6 trinh nghiOn cuu Kh6nh Hoi, ngey 22 thdng ndm 2018 T6c gril luQn vdn L0 Nggc ViQn 1V MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN iv MỤC LỤC v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG ix DANH MỤC HÌNH x LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 ĐỘC TỚ GÂY MẤT TRÍ NHỚ TẠM THỜI (AMNESIC SHELLFISH POISONING - ASP) 1.1.1 Nhuyễn thể hai mảnh vỏ có chứa độc tố ASP 1.1.2 Độc tính DA 1.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐỘC TỐ VI TẢO 1.2.1 Thử nghiệm sinh học động vật 1.2.2 Phương pháp hoá học 1.2.3 Phương pháp thử nghiệm sinh học cấp độ tế bào 10 1.2.4 Tình hình nghiên cứu nước 13 1.3 HƯỚNG NGHIÊN CỨU VỀ MIỄN DỊCH HỌC ĐỘC TỐ DOMOIC ACID 14 1.3.1 Điều chế phức hợp kháng nguyên từ domoic acid 14 1.3.2 Quy trình gây miễn dịch 20 1.3.3 Thu nhận kháng thể từ liệu pháp miễn dịch động vật 23 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 30 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.2.1 Tạo kháng thể đối tượng sinh vật thử nghiệm 30 2.2.2 Thu nhận tinh kháng thể kháng DA từ huyết thỏ trắng 38 v 2.2.3 Thử nghiệm phân tích độc tố ASP sản phẩm thuỷ sản phương pháp ELISA 41 2.3 HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ SỬ DỤNG 43 2.3.1 Hoá chất 43 2.3.2 Thiết bị 44 2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 44 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 3.1 TẠO KHÁNG THỂ TRÊN ĐỐI TƯỢNG SINH VẬT THỬ NGHIỆM 45 3.1.1 Điều chế phức hợp kháng ngun DA-DSS-BSA từ kháng ngun khơng hồn chỉnh domoic acid 45 3.1.2 Hoạt tính kháng thể kháng độc tố domoic acid huyết thỏ trắng theo thời gian 51 3.2 THU NHẬN VÀ TINH SẠCH KHÁNG THỂ KHÁNG DA TỪ HUYẾT THANH THỎ TRẮNG 53 3.2.1 Thu nhận kháng thể kháng DA huyết thỏ trắng 53 3.2.2 Tinh kháng thể kháng DA huyết thỏ trắng 53 3.2.3 Hiệu giá kháng thể 57 3.2.4 Tính đặc hiệu kháng thể thu nhận từ liệu pháp miễn dịch 58 3.3 THỬ NGHIỆM PHÂN TÍCH ĐỘC TỚ ASP TRONG SẢN PHẨM THUỶ SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ELISA 59 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT -NH2 : Nhóm amin sơ cấp -NO3 : Nhóm nitrate =NH : Nhóm amin thứ cấp AOAC : Association Of Analytical Communities (Hiệp hội nhà hoá học phân tích thức) ASP : Amnesic Shellfish Poisoning (Độc tố gây trí nhớ tạm thời) BSA : Bovine Serum Albumin (Albumin huyết bò) CBB : Coomassie Brilliant Blue CE : Capillary Electrophoresis (Điện di mao quản) COOH : Nhóm cacboxyl đ.v.c : đơn vị Cacbon DA : Domoic acid DANIDA : Danish International Development Agency (Cơ quan Phát triển Quốc tế Đan Mạch) DMF : N,N- dimethylformamide DMSO : Dimethyl Sulfoxide DSP : Diarrhetic Shellfish Poisoning (Độc tố gây tiêu chảy) DSS : Disuccinimidyl Suberate EDC : N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride ELISA : Enzyme Linked Immunosorbant Assay (Phương pháp miễn dịch học liên kết enzym) FCA : Freund’s Complete Adjuvant (Tá chất Freund hoàn chỉnh) FIA : Freund’s Incomplete Adjuvant (Tá chất Freund khơng hồn chỉnh) HPLC : High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) HPLC-UV : High Performance Liquid Chromatography with Ultra Violet detection (Sắc ký lỏng hiệu cao kết hợp với phát tia cực tím) IAC : Immunoaffinity Chromatography (Sắc ký lực miễn dịch) ID : Intradermal (trong da) IM : Intramuscular (trong cơ) vii IOC : Intergovernmental Oceanographic Committee (Uỷ ban Hải dương học Liên phủ) IP : Intraperitoneal (trong màng bụng) IV : Intravenous (trong tĩnh mạch) JSPS : Japan Society for the Promotion of Science (Cơ quan Phát triển Khoa học Nhật Bản) LC : Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng) LOD : Limit of Detection (Giới hạn phát hiện) LOQ : Limit of Quantification (Giới hạn định lượng) MBA : Mouse Bioassay (Thử nghiệm sinh học chuột) mg/mL : milligam/ milli Lít NAFIQAD : National Agro-Forestry-Fisheries Quality Assurance Department (Cục Quản lý Chất lượng Nông Lâm sản Thuỷ sản) NHS : N-Hydroxysuccinimide NMDA : N-methyl-D-aspartate NSP : Neurotoxic Shellfish Poisoning (Độc tố thần kinh) OD : Optical Density (Mật độ quang) OPD : Ortho-phenylenediamine P : Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê PBS : Phosphate Buffer Saline Plys : Polylysin PSP : Paralytic Shellfish Poisoning (Độc tố gây liệt cơ) PVDF : Polyvinylidine Fluoride RIA : Radio Immuno Assays (Kỹ thuật miễn dịch phóng xạ) SC : Subcutaneous (dưới da) SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Điện di Polyacrylamide với SDS) STX : Saxitoxin TLC : Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng) UV : Ultra Violet (Cực tím) µg/g : microgam/ gam µg/mL : microgam/ milli Lít viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thể tích tiêm tối đa hỗn hợp kháng nguyên/tá dược vị trí tiêm loài động vật khác 22 Bảng 2.1 Sơ đồ mơ tả phép phân tích ASP-ELISA nhựa 96 giếng 42 Bảng 3.1 Kết đánh giá hàm lượng DA (mg) phức hợp DA-DSS hiệu suất phản ứng 45 Bảng 3.2 Hàm lượng BSA (mg) phức hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA hiệu suất phản ứng 48 Bảng 3.3 Kết phân tích độc tố DA mẫu Hàu Hương kit ASP-ELISA (do đề tài Nhà nước thử nghiệm chế tạo) 60 ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hố học domoic acid, glutamic acid kainic acid Hình 1.2 Sơ đồ điều chế phức hợp kháng nguyên từ DA cách sử dụng DSS làm cầu nối nhóm imino DA nhóm cacboxyl protein tải 17 Hình 1.3 Sơ đồ phản ứng tạo phức hợp Domoic acid - Disuccinimidyl suberate (DADSS) 18 Hình 1.4 Sơ đồ phản ứng tạo phức hợp DA-DSS với Bovine serum albumin (BSA) 19 Hình 2.1 Sơ đồ nguyên tắc điều chế phức hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA từ kháng ngun khơng hồn chỉnh DA 31 Hình 2.2 Sơ đồ điều chế phức hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA từ kháng ngun khơng hồn chỉnh DA 34 Hình 2.3 Sơ đồ gây miễn dịch thỏ trắng New Zealand với phức hợp 36 Hình 2.4 Sơ đồ nguyên tắc thí nghiệm kiểm tra hoạt tính kháng thể kháng độc tố DA huyết thỏ phản ứng ELISA 37 Hình 2.5 Sơ đồ tinh kháng thể kháng DA huyết thỏ sắc ký lực Sepharose EAH 4B với pha rắn DA 39 Hình 3.1 Phổ tử ngoại (UV) phức hợp kháng ngun DA-DSS-BSA 48 Hình 3.2 Hoạt tính kháng thể kháng độc tố DA huyết thỏ trắng New Zealand từ sau tháng thứ đến sau tháng thứ 12 liệu pháp miễn dịch với liều 500 µg phức hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA 51 Hình 3.3 Sắc ký đồ 135 mL huyết thỏ trắng New Zealand sau qua cột sắc ký lực miễn dịch (pha rắn DA-DSS) với tốc độ dòng mL/ phút, phân đoạn mL 54 Hình 3.4 Sắc ký đồ kháng thể chuẩn kháng DA mg/mL sau qua cột sắc ký lực miễn dịch với tốc độ dòng mL/ phút, phân đoạn mL (Đào Việt Hà Phạm Xuân Kỳ, 2017) 55 Hình 3.5 Hình ảnh gel SDS-PAGE (sau nhuộm CBB) màng PVDF sau Western Blot: 1) kháng thể kháng DA chuẩn, 2) chế phẩm kháng thể thu nhận từ huyết thỏ sau tinh chế qua cột IAC 56 Hình 3.6 Hiệu giá kháng thể kháng DA huyết thỏ trắng New Zealand thu nhận liệu pháp miễn dịch 57 x phải tạo sự đặc hiệu mặt lực cột kháng thể Do đó, cần gắn phân tử DA lên cột giá thể rắn Tuy nhiên, DA lại khơng có nhóm amin sơ cấp (-NH2), nên khơng thể kết hợp với nhóm carbodiimide hạt EAH nên không thể sử dụng trực tiếp DA làm giá bắt kháng thể cột sắc ký lực miễn dịch Disuccinimidyl Suberate (DSS) có 02 gốc phản ứng với nhóm amin N-hydroxysuccinimide (NHS) ester vị trí phân tử carbon số 02 đầu (Hermanson, 2013) Gốc có lực hố học mạnh gốc (-NH2) chuỗi cạnh phân tử lysine K nguyên tử N điểm cuối chuỗi polypeptide protein bao gồm kháng thể Luận văn thực gắn DA với DSS phức hợp gắn với EAH nhóm N-hydroxysuccinimide (NHS) ester DSS nhóm N-hydroxysuccinimide (NHS) ester sẽ gắn với nhóm -NH2 kháng thể cần tinh chế Ở đây, chỉ có 01 nhóm amin thứ cấp (=NH) nhất, nên cột EAH 4B với giá thể rắn DA (thông qua cầu nối DSS) sẽ chỉ bắt với kháng thể kháng DA có mặt huyết qua cột Đây phương pháp tinh sạch bước sắc ký lực - Về mặt nguyên tắc, có thể sử dụng loại cột sắc ký gắn protein A để tinh sạch kháng thể Tuy nhiên, phương pháp sẽ không đặc hiệu với kháng thể kháng DA sẽ bắt giữ nhiều kháng thể có mặt huyết thỏ, nên sản phẩm sau qua cột sẽ hỗn hợp kháng thể cần phải có bước để tách kháng thể kháng DA từ hỗn hợp Do đó, phương pháp sẽ phức tạp hiệu suất không cao (do qua nhiều công đoạn) so với phương pháp sắc ký lực cột Sepharose EAH 4B gắn DA Câu 4: Mức độ tinh khiết huyết tinh chế %? (TS Nguyễn Thị Lan Phương - Phản biện 1) Trả lời: Luận văn khơng thực thí nghiệm kiểm tra độ tinh khiết huyết tinh chế Tuy nhiên, phần nội dung đề tài cấp Nhà nước TS Đào Việt Hà Câu 5: Tác giả giải thích phương pháp hiệu pH Na2CO3 tổng hợp phức hợp DA-DSS (ở phần kết quả, trang 43, dòng 13) (TS Nguyễn Bảo - Phản biện 2) Trả lời: Na2CO3 hợp chất có tính kiềm nhẹ phản ứng phân lý Na2CO3 → Na+ + CO32- , sau CO32- + H2O ⇌ HCO3- + OH- Do vậy, Na2CO3 dùng để điều chỉnh pH dung dịch đòi hỏi có sự xác pH gây tượng chuyển dịch pH sang vùng kiềm giống dùng chất có độ kiềm cao Câu Tác giả giải thích kết hình 3.1 (Phổ UV phức hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA), trang 45 luận án (TS Nguyễn Bảo - Phản biện 2) Trả lời: Hình 3.1 Phổ tử ngoại (UV) phức hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA sau điều chế Bovine Serum Albumin (BSA) protein có huyết bò, có bước sóng hấp thụ cực đại 280 nm; Domoic acid (DA) chromophore có bước sóng hấp thụ cực đại 242 nm Kết phân tích hình 3.1 cho thấy phổ tử ngoại phức hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA sau điều chế thể đỉnh với cường độ hấp thu tại bước sóng 242 nm (đặc trưng cho phân tử DA) 1,82 tại 280 nm (đặc trưng cho phân tử BSA) 0,38; chứng tỏ sản phẩm chứa DA BSA; dung dịch BSA chưa cộng hợp sẽ chỉ có đỉnh bước sóng 280 nm Câu Tác giả giải thích kết hệ số gắn kết DA protein tải BSA (trang 47) (TS Nguyễn Bảo - Phản biện 2) Trả lời: Dựa vào chỉ số OD bước sóng 242 nm phức hợp cộng hợp (DA-DSS-BSA), so sánh với chỉ số dung dịch chỉ chứa DA chuẩn (1 mg/mL), sẽ tính hàm lượng DA có mặt phức hợp cộng hợp Tương tự hàm lượng BSA Số phân tử DA BSA có mặt phức hợp chuyển đổi từ hàm lượng cách chia cho khối lượng phân tử tương ứng (DA: 312; BSA: 65.000 đvc) Từ đó, hệ số gắn kết (coupling ratio) giữa phân tử DA BSA tính theo cơng thức DA/BSA= Cmolar(DA)/Cmolar(BSA) Câu Mục tiêu việc thu nhận kháng thể kháng DA đề tài gì? Tại thử nghiệm nội dung không sử dụng kháng thể đề tài mà lại sử dụng kit Đào Việt Hà? (TS Phạm Thu Thuỷ - Uỷ viên Hội đồng) Trả lời: - Mục tiêu thu nhận kháng thể kháng DA: sử dụng làm vật liệu cho sản xuất kit ELISA dùng phát độc tố DA nhuyễn thể mảnh vỏ - Thực tế, nội dung 4, luận văn sử dụng kháng thể đề tài tinh sạch làm kháng thể thứ kit ELISA tác giả Đào Việt Hà phát triển Câu Dự đốn, giải thích phân đoạn A thu từ sắc ký IAC kết Western blot không xuất băng đặc hiệu (TS Phạm Thu Thuỷ - Uỷ viên Hội đồng) Trả lời: Với phân đoạn A (37-39 ) thu từ sắc ký lực (cũng biểu đỉnh hấp thụ bước sóng 280 nm), phép thử Western Blot sử dụng chỉ thị đặc hiệu với DA the 2nd antibody IRDye 680RD Goat (polyclonal) Anti-Rabbit IgG (H+L)) lại không biểu vạch màng PVDF Hay nói cách khác, chất thu phân đoạn A không phản ứng với kháng thể đặc hiệu the 2nd antibody IRDye 680RD Goat (polyclonal) AntiRabbit IgG (H+L) Như vậy, có thể nói phân đoạn A khơng chứa kháng thể kháng DA Có thể, protein huyết thỏ có nhóm chức hóa học có thể phản ứng với gốc -NHS phân tử DSS nên giữ lại cột Bổ sung cho giả thuyết này, Đào Việt Hà (2014)(*) xác nhận sự đồng thời tồn tại chất định với DA Hàu Hương Tuy nhiên, hướng nghiên cứu chất hóa học chất tiến hành nhằm góp phần làm sáng tỏ giả thuyết sản phẩm trung gian trình trao đổi chất thể sinh vật tiến hành (*) Đào Việt Hà 2014, A presence of a substance binding with the specific antibody against domoic acid in the thorny oyster Spondylus versicolor, Journal of Marine Science and Technology, Vol 14, No 2, 2014: 149-154 Câu 10 Giải thích cách tính hiệu suất phản ứng bước? (TS Phạm Thu Thuỷ - Uỷ viên Hội đồng) Câu 12 Hiệu suất quy trình điều chế 18,42% tác giả tính nào? (TS Phạm Thị Minh Hải - Thư ký Hội đồng) Hiệu suất chung bước tính tốn hiệu suất trung bình lần thí nghiệm (n=3), với hiệu suất lần thí nghiệm tạo phức DA-DSS-BSA tích số hiệu suất thí nghiệm tạo phức DA-DSS thí nghiệm tạo phức DA-DSS-BSA Thí nghiệm Hiệu suất phản ứng tạo phức Hiệu suất phản ứng tạo phức Hiệu suất phản ứng chung (%) DA-DSS (%) DA-DSS-BSA (%) 85 22,0 18,70 88 20,5 18,04 85 21,76 18,50 Trung bình 18,42 ± 0,3 Câu 11 Trong phần 3.2.3, tác giả có thể giải thích rõ sở dùng để lựa chọn độ pha loãng 1/12800? (TS Phạm Thị Minh Hải - Thư ký Hội đồng) Trả lời: Hiệu giá kháng thể phản ánh nồng độ kháng thể huyết Hiệu giá kháng thể độ pha loãng huyết lớn mà phản ứng dương tính Luận văn chỉ sử dụng huyết từ cá thể thỏ (số 7) biểu hoạt tính kháng thể cao (ở sau tháng thứ 6) để xác định hiệu giá kháng thể với dung dịch DA chuẩn μg/mL (trong đệm PBS, pH 7,4) nồng độ huyết pha loãng lần lượt 50, 100, 200, 400, 800, 1.600, 3.200, 6.400, 12.800, 25.600, 51.200 102.400 lần dung dịch đệm PBS pH 7,4 Ở độ pha loãng 1/12800, tín hiệu thấp, khơng ảnh hưởng đến kết x6t nghiQm vi co sW hiQu gi6 kh6ng th0 kh6c biQt rO rdng gifra phin ring ducrng vd 6m Do d6 lu?n vdn chqn ld Xin chdn thdnh 1112800 cbm crn quy thAy cO HQi cl6ng il6nh gi6 lu4n vdn th?c Khdnh Hda, ngdy sT! l8 thdng ndm 2018 Hgc vi0n L0 Nggc ViQn Chri tich Hgi tl6ng PGS.TS Ngd DIng Nghia Nguoi hufng din PGS.TS Vfi Ngqc BQi TS Dho Vi0t Hn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc BẢN GIẢI TRÌNH CHỈNH SỬA LUẬN VĂN Theo yêu cầu Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ Họ tên: LÊ NGỌC VIỆN Mã HV: 57CH077 Tên đề tài: “Nghiên cứu thu nhận kháng thể đa dòng đặc hiệu phục vụ sản xuất kit phát nhanh độc tố vi tảo gây trí nhớ cho người (Domoic acid)” Người hướng dẫn: PGS TS Vũ Ngọc Bội TS Đào Việt Hà Ngành: Công nghệ sinh học Ngày bảo vệ: 11/4/2018 Căn theo yêu cầu Hội đồng đánh giá Luận văn thạc sĩ họp ngày 11/4/2018, học viên tiếp thu sửa chữa, hoàn thiện luận văn xin giải trình việc sửa chữa luận văn theo góp ý Hội đồng đánh giá Luận văn thạc sĩ sau: 1) Về yêu cầu bổ sung thêm chế phản ứng tạo phức hợp DA-DSS-BSA phần tổng quan luận văn Học viên tiếp thu xin bổ sung thêm vào mục 1.3.1 phần tổng quan nội dung sau: + Dựa vào cấu trúc phân tử độc tố DA (có chứa 03 nhóm -COOH, 01 nhóm -NH2), người ta có 03 cách để tạo phức DA protein tải sau: - Cách thứ nhất: tạo phức DA protein tải cách tạo liên kết nối nhóm -NH2 protein tải nhóm -COOH DA có mặt sodium bis (2-ethylhexyl) sulfosuccinate (Branaa cộng sự, 1999) - Cách thứ hai: tạo phức DA protein tải cách tạo liên kết gốc -NH2 DA với nhóm -COOH protein tải có mặt EDC (1-Ethyl-3-(3dimethylaminopropyl) carbodiimide) NHS (N-hydroxysuccinimide) (ký hiệu C-DADSS-protein) (Yu cộng sự, 2004) - Cách thứ ba: tạo phức DA protein tải cách trước tiên tạo liên kết nhóm =NH DA nhóm -NO3 DSS (Disuccinimidyl Suberate) Sau đó, tiến hành cho phức hợp kết hợp với protein tải thông qua liên kết nhóm -COOH DA với nhóm -NH2 phân tử protein tạo thành phức hợp kháng nguyên DA-DSS-protein (ký hiệu N-DA-DSS-protein) + Cơ chế phản ứng tạo phức hợp DA-DSS Domoic acid C15H21NO6 Domoic acid-DSS Disuccinimidyl suberate, (DSS) C16H20N2O8 N-Hydroxysuccinimide C4H5NO3 Hình Sơ đồ phản ứng tạo phức hợp Domoic acid - Disuccinimidyl suberate (DA-DSS) + Cơ chế phản ứng tạo phức hợp DA-DSS với BSA Domoic acid-DSS-BSA Domoic acid-DSS Bovine serum albumin (BSA) N-Hydroxysuccinimide C4H5NO3 Hình Sơ đồ phản ứng tạo phức hợp DA-DSS với Bovine serum albumin (BSA) 2) Về yêu cầu phần phương pháp nghiên cứu cần viết rõ cách tính toán cách xây dựng đường chuẩn để xác định nồng độ chất - Học viên tiếp thu bổ sung cơng thức tính hiệu suất tồn phần phần trình bày phương pháp nghiên cứu Cụ thể nội dung bổ sung vào mục 2.2.1.1 sau: H= ∑n i Ai Bi n ± SD (2.1) Trong đó: Ai: Hiệu suất phản ứng DA-DSS Bi: Hiệu suất phản ứng DA-DSS với BSA i: Lần thí nghiệm n: Tổng số lần thí nghiệm SD (Standard Deviation): Độ lệch chuẩn từ i lần thí nghiệm - Học viên tiếp thu bổ sung phương pháp tính hệ số gắn kết DA protein tải BSA Cụ thể, nội dung bổ sung vào mục 2.2.1.1 sau: 𝐇ệ 𝐬ố 𝐠ắ𝐧 𝐤ế𝐭 𝐃𝐀/𝐁𝐒𝐀 ≈ 𝐚 𝟑𝟏𝟐 𝐛 𝟔𝟓𝟎𝟎𝟎 ≈ 𝐚 𝟑𝟏𝟐 × 𝟔𝟓𝟎𝟎𝟎 𝐛 ≈ 𝟐𝟎𝟖 × 𝐚 𝐛 (2.2) Trong đó: a (g): hàm lượng DA phức hợp cộng hợp DA-DSS-BSA b (g): hàm lượng BSA phức hợp cộng hợp DA-DSS-BSA Khối lượng mol DA: 312 g/mol Khối lượng mol BSA: 65.000 g/mol 3) Về yêu cầu bổ sung công trình nghiên cứu liên quan đến chủ đề nghiên cứu tiếng Việt mà số thành viên tham gia thực đề tài nghiên cứu khoa học cấp Nhà nước công bố Học viên tiếp thu bổ sung thêm tài liệu tham khảo số 1, 2, phần tài liệu tham khảo, bao gồm tài liệu sau: - Đào Việt Hà 2016, Thăm dò khả sản sinh kháng thể kháng độc tố vi tảo domoic acid thỏ trắng New Zealand, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Biển, 16, 176-182 - Đào Việt Hà, Phạm Xuân Kỳ 2015, Điều chế phức hợp kháng nguyên từ bán kháng nguyên domoic acid, Tạp chí Nghề cá Sơng Cửu Long, Số 6, 126-132 - Đào Việt Hà, Phạm Xuân Kỳ 2017, Ứng dụng sắc ký lực miễn dịch để tinh chế kháng thể kháng độc tố domoic acid huyết thỏ trắng New Zealand, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Biển, Tập 17, Số 1, 103-109 4) Về yêu cầu bổ sung thông tin cập nhật sản phẩm tương tự thương mại (như Domotest Zeulab; MaxSignal Okadaic Acid (DSP) ELISA Test kit Bio Scientific…) phương pháp tổng hợp hóa học - Học viên bổ sung thêm thông tin cập nhật liên quan đến chủ đề nghiên cứu sản phẩm tương tự thương mại vào mục 1.3 phần tổng quan sau: Hiện nay, hãng ZeuLab (Tây Ban Nha) thương mại hoá kit ELISA (Domotest) phát nhanh độc tố DA từ loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ hàu, sò điệp, trai… với giới hạn định lượng 2-80 mg/kg, thực 41 mẫu khoảng thời gian MaxSignal® Domoic Acid (ASP) ELISA Test Kit hãng Bioo Scientific (Mỹ) phân tích định lượng DA mẫu nhuyễn thể, vi tảo mẫu nước dựa phương pháp ELISA cạnh tranh, kháng thể thứ hai đặc hiệu với kháng thể thứ kháng DA (the second antibody against Anti-Domoic Acid Antibody) phủ giếng, mẫu cho vào giếng với cộng hợp DA-HRP kháng thể thứ kháng DA Nếu DA tồn mẫu, cạnh tranh với cộng hợp DA-HRP để gắn kết với kháng thể thứ kháng DA Tiếp theo, kháng thể thứ kháng DA gắn với kháng thể thứ hai đặc hiệu phủ giếng Sau bước rửa giải thành phần không gắn kết, chất TMB cho vào giếng tạo sản phẩm có màu phản ứng với HRP Cường độ màu đo tỷ lệ nghịch với nồng độ DA có mẫu MaxSignal® Domoic Acid (ASP) ELISA Test Kit phân tích 42 mẫu 1,5 giờ; độ nhạy 0,125 ppb; giới hạn phát 30 ppb nhuyễn thể ppb mẫu nước; nhiên giá thành kit cao (khoảng 600 euro/kit) Ngồi có Domoic Acid Test Kit hãng Mercury Science Inc với phương pháp phân tích hãng MaxSignal®, có giá thành khoảng 250 USD/kit 5) Về yêu cầu bổ sung mũi tên đỉnh cường độ hấp thu phổ tử ngoại DA (1,82) BSA (0,38) Biểu đồ 3.1 Học viên tiếp thu bổ sung yêu cầu hội đồng biểu đồ 3.1 sau: 2.5 OD242 (DA): 1,82 OD Absorbance 2.0 BSA BSA-DSS-DA 1.5 BSA-DSS-DA BSA 1.0 OD280 (BSA): 0,38 0.5 0.0 220 200 260 300 250 340 380 300 Wevelength(nm) nm 420 460 350 Hình 3.1 Phổ tử ngoại (UV) phức hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA sau điều chế 6) Về yêu cầu bổ sung công thức pha dung dịch đệm đưa vào phần phụ lục Học viên tiếp thu bổ sung nội dung kiến thức phần phụ lục phụ lục theo yêu cầu Hội đồng Cụ thể, học viên bổ sung nội dung sau: - Trong phụ lục Dung dịch, hoá chất bước tiến hành phản ứng ELISA, học viên bổ sung nội dung sau: * Bộ dung dịch, hoá chất cần cho phản ứng ELISA Lọ số 1: 20 mL dung dịch đệm PBS (pH 7,4): Hoà tan 80 g NaCl, 29 g Na2HPO4.12H2O, g KCl, g KH2PO4 nước cất, định mức đến thể tích 1000 mL Pha 2,0 mL dung dịch 18 mL nước cất để có dung dịch PBS làm việc Lọ số 2: 200 µL dung dịch DA nồng độ 160 nM: Lấy 50 µL dung dịch DA chuẩn nồng độ 3,2 µM pha 950 µL nước cất Lọ số 3: Kháng thể kháng độc tố DA 320 nM: Pha 400 µL dung dịch kháng thể có nồng độ 9,6 µM 5,6 mL đệm PBS Lọ số 4: Kháng thể đặc hiệu HRP-labeled anti-goat (the 2nd antibody): Pha µL kháng thể chuẩn 12 mL dung dịch đệm PBS Lọ số 5: Dung dịch rửa nhựa PBST 1%: Pha 0,25 mL Tween 24,75 mL dung dịch đệm PBS Lọ số 6: Dung dịch ngừng phản ứng tạo màu 2N H 2SO4: Pha 132 µL H2SO4 11,87 mL nước cất 01 hoá chất tạo phức màu OPD (01 Sigma silver, 01 Sigma gold) * Các bước tiến hành phản ứng ELISA: + Cung cấp kháng nguyên tự (độc tố DA) cạnh tranh với kháng nguyên pha rắn tích hợp: Bơm 50 µL DA chuẩn nồng độ 0,1; 1; 10; 100 nM giếng, nồng độ thực 03 lần lặp, tương ứng với 03 giếng nhựa + Phản ứng kháng nguyên-kháng thể: Bơm 100 µL kháng thể kháng DA thu nhận từ liệu pháp miễn dịch thỏ trắng vào giếng, ủ 37 0C + Phản ứng phức kháng nguyên-kháng thể với kháng thể đặc hiệu thương mại số 2: Bơm 100 µL HRP-anti rabbit IgG (DAKO, P0399) vào giếng, ủ 37 0C + Phản ứng tạo màu cho định lượng: Bơm vào giếng 100 µL dung dịch Orthophenylenediamine, ủ 37 0C 10 -15 phút + Phản ứng ngừng phát triển màu: Bơm vào giếng 50 µL dung dịch H2SO4 2N - Trong phụ lục Dung dịch, hoá chất cho SDS-PAGE Western Blot, học viên bổ sung nội dung sau: * SDS-PAGE + dH2O: Nước cất xử lý autoclave + Acrylamide CH2:CHCONH2 71.08: Wako 011-08015 (500 g); Lot CDQ 4719 + Bis: N,N’-Methylene-bis (acrylamid) (CH2:CHCONH)2CH2, 154.15: Wako 13006031 (100g); Lot.: EWQ 0010 + Dung dịch làm việc SDS-PAGE: 30% arcylamide, 0.8% Bis, giữ lạnh + Tris: 2-Amino-2-2hydroxymethyl-1,3-propanediol: C4H11NO3 (MW: 121.14): Wako 207-06275; Lot WEQ0051 + Tris HCl: 2-Amino-2-2hydroxymethyl-1,3-propanediol Hydrochloride: H2NC(CH2OH)3HCl (MW: 157.60); WAKO 012-17455; Lot PEF13725? + Glycine (Aminoacetic Acid): H2NCH2COOH (MW: 75.07): WAKO 077-00735; Lot WEN 2251 + SDS: Sodium dodecyl sulphate: CH3(CH2)11OSO3Na (MW: 288.38): WAKO 19107145; Lot STH8701 (giữ nhiệt độ phòng) + APS: Ammonium Peroxodisulfate (Ammonium Persulfate): (NH 4)2S2O8 (MW: 228.2): WAKO 012-08023, Lot STQ 4576 (Khi pha dung dịch SDS, sử dụng dH 2O, giữ lạnh) + TEMED: N,N,N’,N’-Tetramethyl-ethylenediamin: (CH3)2NCH2CH2N(CH3)2: WAKO 205-06313 Lot LAE 7786 + SDS-Glycerol Buffer (trộn với mẫu, đun sôi trước chạy EP gel): • 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8): 2.5 mL (0.125M) • 2-Mecarptoethanol HSCH2CH2OH 78.3 (WAKO 131-14572, 25mL): mL (10% v/v) • 10% SDS: mL (4% v/v) • Sucrose: g (10% w/v) • Bromophenol Blue (BPB) C19H10Br4O5S 669.97 (WAKO 029-02912, 25 g): mg • Trộn SDW thành 1000 mL + Dung dịch nhuộm băng protein (nhuộm gel EP): 1000 mL of CBB solution: • Coomassie Brilliant Blue C47H50N5O7S2: 0.5 g • AcOH: 100 mL • MeOH: 500 mL • SDW: 400 mL + Blue Star Prestained Protein Marker: Cat MWP03 (500 uL), Nippon Genetics Europe + Glycine: H2NCH2COOH 75.07 (WAKO 072-00735; 500 g) * WESTERN BLOTTING + Màng PVDF: Immobilon-P Transfer Memmbrane (cat Nc IPVH304F0 Pre size 0.45 uM) + Chromatography paper + Skim Milk Powder: WAKO 198-10605 (500g) Lot ELQ2873 + Chemi-Lumi One (Nakarai): Sol A 250 mL, Sol B 250 mL: Nacalai tesque, inc Kyoto, Japan: Code 05027-20, Lot L1A6462 + Immunostaining membrane * CÁC DUNG DỊCH ĐỆM + 10 x Tris Buffer Saline (10xTBS): 121 g Tris + 400 g NaCl pha nước cất đến L + 10x SDS-PAGE Electrophoresis Buffer: 151.5 g Tris + 720 g Glycine + 50 g SDS pha nước cất đến L + SDS-PAGE destaining solution: 25% MeOH + 7% AcOH + 10 x Blotting Buffer: 250 nM Tris-HCl (pH 8.3) + 1.92 M Glycine + 0.2% SDS + 1x Blotting Buffer: (10x Blotting Buffer): MeOH : 7dH2O + Tris-HCl 1.5 M (pH 8.8) + Tris-HCl 0.5 (pH 6.8) 7) Về yêu cầu bổ sung mô tả chi tiết phương pháp thu huyết thỏ, phương pháp phối trộn kháng nguyên tá chất Học viên tiếp thu bổ sung thêm phần “mô tả chi tiết phương pháp thu huyết thỏ, phương pháp phối trộn kháng nguyên tá chất” mục 2.2.1.2 Cụ thể học viên bổ sung nội dung sau: * Phương pháp phối trộn kháng nguyên tá chất Dung dịch cộng hợp DA-DSS-BSA sau điều chế bảo quản dung dịch đệm PBS 0,1 M - 100C Freund’s adjuvant dung dịch nhũ hóa dầu nên khó hồ tan hồn tồn với dung dịch cộng hợp DA-DSS-BSA Nếu hai chất khơng hòa trộn hoàn toàn với nhau, tiêm cho động vật thí nghiệm phức hợp kháng ngun DA-DSS-BSA nhanh chóng bị phân tán đào thải, không tồn đủ lâu để gây đáp ứng miễn dịch Vì cần trộn phức hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA với tá chất Freund’s adjuvant kỹ thuật vortex * Phương pháp lấy máu thu huyết miễn dịch + Lần thứ (M0) hay gọi máu lấy trước tiêm miễn dịch từ đến ngày + Lần thứ hai (M1) vào tháng thứ (cách tuần sau liều tiêm miễn dịch thứ 6) + Lần thứ ba (M2) cách tuần sau liều tiêm miễn dịch thứ + Tương tự đến lần thứ 19 (M19) cách tuần sau liều tiêm miễn dịch thứ 24 Thể tích lần lấy máu mL Phương pháp lấy máu: + Dùng Syrine mL thu máu từ động mạch vành tai (artery vent) thỏ + Chống đông máu heparine + Ly tâm máu 3000 vòng/phút phút để thu nhận huyết (dịch trong) + Bảo quản huyết điều kiện nhiệt độ -200C sử dụng 8) Về yêu cầu: mục 2.2.2.3 cần rõ phương pháp sử dụng xác định kháng thể thỏ phương pháp định lượng hay bán định lượng? Học viên tiếp thu bổ sung mục 2.2.2.3 sau: Huyết thỏ có hoạt tính kháng thể cao sử dụng cho xác định hiệu giá kháng thể với dung dịch DA chuẩn μg/mL (trong đệm PBS, pH 7,4) nồng độ huyết thanhpha lo6ng lAn lugt la 50, 100, 200,400, 800, 1600, 3200,6400,12800, 25600,51200 vd l024OO lAn dung dich dEm PBS pH7,4, sri dpng phuong ph6p ELISA clinh lugng hai budc gi6n ti6p (Indirect - steps - ELISA) Nhu vay, hgc viOn da tiOp thu vd sria chfra lufln v6n theo dring cfrc gop y ctaHQi il6ng ch6m lufln vdn thpc si Hpc vi€n xin chdn thdnh cttm on c6c thAy cO HQi cl6ng ch6m lufln v6n thpc si dd c6 nhirng ki6n gop y h6t suc quy bdu, sdu sac d0 bhnbilo c6o lufln vdn cria hgc vi0n th6m hodn thien Khdnh Hda, ngdy lB thdng ndm 2018 Hgc viOn LG Ngqc ViQn Chri tich HOi tl6ng PGS.TS NgO Dlng Nghia Ngucri hu0ng dfin PGS.TS Vti Ngqc BQi TS Diro ViQt Hn 10 ... Nghiên cứu thu nhận kháng thể đa dòng đặc hiệu phục vụ sản xuất kit phát nhanh độc tố vi tảo gây trí nhớ cho người (domoic acid) Mục tiêu đề tài Mục tiêu chung Thu nhận kháng thể đa dòng đặc. .. 58 xi TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Nghiên cứu thu nhận kháng thể đa dòng đặc hiệu phục vụ sản xuất kit phát nhanh độc tố vi tảo gây trí nhớ cho người (domoic acid) Giới thiệu đề tài mục tiêu nghiên cứu Các... phức hợp kháng nguyên từ DA, sản xuất kháng thể đa dòng kháng độc tố DA kế thừa kết nghiên cứu Takata (2006), nhằm phục vụ phát triển kit ELISA phát nhanh độc tố vi tảo DA sản phẩm thu sản, tiến