Xây dựng phương pháp phân tích phát hiện nhanh thuốc giả bằng phổ raman

Với ưu điểm nổi bật là phân tích nhanh, không làm hỏng mẫu, kỹ thuật đơn giản, dễ sử dụng, phổ Raman đang được khai thác và đưa vào nhiều lĩnh vực nghiên cứu, một trong số đó là công tác

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THÙY LINH

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHÁT HIỆN NHANH THUỐC GIẢ BẰNG PHỔ RAMAN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2015

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THÙY LINH

1 Viện kiểm nghiệm thuốc TW

2 Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI - 2015

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến

PGS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu và ThS Đặng Thị Ngọc Lan đã trực tiếp

hướng dẫn, giúp đỡ, chỉ bảo tận tình để tôi hoàn thành khóa luận

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cán bộ ở Khoa kiểm nghiệm

nguyên liệu- Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương đã hướng dẫn tận tình

trong thời gian tôi làm thực nghiệm, hoàn chỉnh nghiên cứu này tốt nhất

Tôi xin cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Hóa phân tích và Độc chất

đã tạo điều kiện cung cấp cho tôi các tài liệu cần thiết để hoàn thành khóa luận này

Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, các phòng ban, các thầy cô giáo

và cán bộ nhân viên Trường đại học Dược Hà Nội - những người đã dạy bảo

và trang bị cho tôi những kiến thức khoa học nền tảng suốt thời gian học dưới mái trường

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn thân thương nhất đến gia đình đã luôn

ở bên động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thiện khóa luận

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Nguyễn Thị Thùy Linh

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về thuốc giả 3

1.2 Tổng quan về Isoniazid và Ethambutol 5

1.2.2 Danh pháp 5

1.2.2 Các phương pháp định tính Isoniazid và Ethambutol 6

1.3 Tổng quan về phương pháp quang phổ Raman 7

1.3.1 Lịch sử phát triển 7

1.3.2 Nguyên lý cơ bản của quang phổ Raman 9

1.3.3 Nguyên tắc cấu tạo của thiết bị quang phổ Raman 12

1.3.4 Ưu nhược điểm của quang phổ Raman 13

1.3.5 Một số ứng dụng của quang phổ Raman trong thực tiễn 17

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 18

2.1.1 Nguyên vật liệu 18

2.1.2 Thiết bị 18

2.2 Nội dung nghiên cứu 19

2.3 Phương pháp nghiên cứu 19

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21

3.1 Công thức bào chế viên nén và viên nang của các hoạt chất dùng trong nghiên cứu 21

3.1.1 Công thức bào chế viên nén và viên nang của hoạt chất Isoniazid 21

3.1.2 Công thức bào chế viên nén và viên nang của hoạt chất Ethambutol 24

3.2 Kiểm tra chất lượng của các mẫu viên nghiên cứu 27

3.3 Kết quả và bàn luận 27

3.3.1 Bộ dịch chuyển Raman cơ bản của Isoniazid 27

3.3.2 Bộ dịch chuyển Raman cơ bản của Ethambutol 36

3.3.3 Bàn luận 45

3.4 Ứng dụng khảo sát các chế phẩm trên thị trường 47

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

Kết luận 49

Kiến nghị 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

CT Công thức

TT Thuốc thử

DANH MỤC CÁC BẢNG

1 Bảng 1.1 Tỉ lệ thuốc kém chất lượng qua các năm từ 2009 - 2013 3

2 Bảng 1.2 Tỉ lệ thuốc đông dược, dược liệu không đạt chất lượng từ

3 Bảng 1.3 Tỉ lệ thuốc giả qua các năm từ 2009-2013 4

4 Bảng 3.1 Công thức bào chế viên nén Isoniazid 21

5 Bảng 3.2 Công thức bào chế viên nang Isoniazid 23

6 Bảng 3.3 Công thức bào chế viên nén Ethambutol 24

7 Bảng 3.4 Công thức bào chế viên nang Ethambutol 26

8 Bảng 3.5 Tỉ lệ cường độ Raman ở các đỉnh đặc trưng của phổ chuẩn

9 Bảng 3.6 Các đỉnh đặc trưng của viên chứa hoạt chất Isoniazid thực

10 Bảng 3.7 Các đỉnh đặc trưng và tỉ lệ cường độ Raman ở các đỉnh

đặc trưng của phổ các viên thực chế tạo chứa Isoniazid 34

11 Bảng 3.8 Các đỉnh đặc trưng và tỉ lệ cường độ Raman ở các đỉnh

đặc trưng của phổ các thuốc chứa Isoniazid 34

15 Bảng 3.12 Các đỉnh đặc trưng và tỉ lệ cường độ Raman ở các đỉnh

đặc trưng của phổ các viên thực chế tạo chứa Ethambutol 43

chứa Isoniazid so với thư viện phổ đã thiết lập

18 Bảng 3.15 Bảng kết quả đo phổ Raman của chế phẩm khảo sát có

chứa Ethambutol so với thư viện phổ đã thiết lập 48

DANH MỤC CÁC HÌNH

1 Hình 1.1 Các thành phần thu được sau khi cho ánh sáng kích thích

2 Hình 1.2 Tán xạ Raman Stokes và đối Stokes m, n, r: các mức

3 Hình 1.3 Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ Raman 12

4 Hình 2.1 Máy quang phổ Raman để bàn được sản xuất bởi hãng

5 Hình 3.1 Phổ Raman chuẩn của Isoniazid 28

6 Hình 3.2 Phổ Raman của viên nang placebo Isoniazid CT4 28

7 Hình 3.3 Phổ Raman của viên nang placebo Isoniazid CT2 29

8 Hình 3.4 Phổ Raman của viên nén placebo Isoniazid CT1 29

9 Hình 3.5 Phổ Raman của viên nén placebo Isoniazid CT3 30

10 Hình 3.6 Phổ Raman của viên nang Isoniazid CT4 30

11 Hình 3.7 Phổ Raman của viên nang Isoniazid CT2 31

12 Hình 3.8 Phổ Raman của viên nén Isoniazid CT1 31

13 Hình 3.9 Phổ Raman của viên nén Isoniazid CT3 32

14 Hình 3.10 Phổ Raman của viên nang chứa 50% Isoniazid CT4 35

15 Hình 3.11 Phổ Raman của viên nén chứa 50% Isoniazid CT1 35

16 Hình 3.12 Phổ Raman chuẩn của Ethambutol 37

17 Hình 3.13 Phổ Raman của viên nén placebo Ethambutol CT1 37

18 Hình 3.14 Phổ Raman của viên nén placebo Ethambutol CT2 38

19 Hình 3.15 Phổ Raman của viên nang placebo Ethambutol CT3 38

20 Hình 3.16 Phổ Raman của viên nang placebo Ethambutol CT4 39

21 Hình 3.17 Phổ Raman của viên nén Ethambutol CT1 39

22 Hình 3.18 Phổ Raman của viên nén Ethambutol CT2 40

23 Hình 3.19 Phổ Raman của viên nang Ethambutol CT3 40

24 Hình 3.20 Phổ Raman của viên nang Ethambutol CT4 41

25 Hình 3.21 Phổ Raman của viên nang chứa 50% Ethambutol CT3 43

26 Hình 3.22 Phổ Raman của viên nén chứa 50% Ethambutol CT1 44

27 Hình 3.23 Hình ảnh chồng phổ của nguyên liệu Isoniazid với phổ

và những năm gần đây, thuốc giả còn đi vào cả bệnh viện thông qua đấu thầu Nhiều trường hợp, thuốc giả đã đến tay bệnh nhân hoặc thậm chí được bán hết rồi mới có quyết định thu hồi, đình chỉ

Việc ngăn ngừa và bài trừ thuốc giả đang là một vấn đề cấp bách với cơ quan chức năng Vì tình hình thuốc giả ngày càng diễn biến phức tạp, số lượng thuốc trên thị trường ngày càng lớn, các phương pháp phân tích truyền thống thì cho kết quả chính xác nhưng tốn rất nhiều thời gian Có một phương pháp phân tích quang phổ trong ngành Dược còn khá mới mẻ là phương pháp phổ Raman Quang phổ Raman được ra đời từ những năm 30 của thế kỷ trước nhưng do hạn chế về khoa học kỹ thuật nên nó còn phát triển khá chậm Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ về công nghệ laser, phổ Raman ngày càng phát triển và có rất nhiều ưu thế, đặc biệt được ứng dụng vào việc phát hiện nhanh thuốc giả trong ngành Dược Với ưu điểm nổi bật là phân tích nhanh, không làm hỏng mẫu, kỹ thuật đơn giản, dễ sử dụng, phổ Raman đang được khai thác và đưa vào nhiều lĩnh vực nghiên cứu, một trong

số đó là công tác phân tích, kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc với độ tin cậy, chính xác cao

Isoniazid và Ethambutol là các thuốc chống lao thiết yếu Chương trình chống lao Việt Nam luôn cung cấp đầy đủ, liên tục thuốc chống lao có chất lượng Tuy nhiên các thuốc này dễ bị làm giả vì tung ra thị trường dễ tiêu thụ

Mặt khác số lượng các thuốc này lớn nên dễ trà trộn vào thị trường mà cơ quan quản lý khó kiểm soát được hết Vì vậy rất cần các biện pháp phát hiện nhanh để kiểm soát chất lượng thuốc, góp phần nâng cao hiệu quả điều trị, nâng cao sức khỏe cộng đồng Nhằm nâng cao chất lượng thuốc chống lao,

nhóm nghiên cứu chúng tôi thực hiện đề tài: “Xây dựng phương pháp phân

tích phát hiện nhanh thuốc giả bằng phổ Raman” với 2 mục tiêu:

1 Xây dựng bộ dịch chuyển Raman cơ bản của 2 hoạt chất Isoniazid và Ethambutol

2 Xác định khoảng dao động về vị trí và cường độ của các giá trị dịch chuyển Raman dưới ảnh hưởng của một số tá dược thường dùng trong viên nén và viên nang để xây dựng quy trình định tính các viên nén có hoạt chất trên

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về thuốc giả

Tại điều 2 chương 1 của Luật Dược- năm 2005, quy định rõ: Thuốc kém chất lượng là thuốc không đạt tiêu chuẩn chất lượng đã đăng ký với cơ quan

có thẩm quyền Thuốc giả là sản phẩm được sản xuất dưới dạng thuốc với ý

đồ lừa đảo, thuộc một trong những trường hợp sau đây: a) Không có dược chất; b) Có dược chất nhưng không đúng hàm lượng đã đăng ký; c) Có dược chất khác với dược chất ghi trên nhãn; d) Mạo tên, kiểu dáng công nghiệp của

thuốc đã đăng ký bảo hộ sở hữu công nghiệp của cơ sở sản xuất khác.[6]

Ở Việt Nam, tỉ lệ thuốc kém chất lượng chiếm khoảng 2,5% - 3,3% Năm 2013, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương tiến hành lấy 39853 mẫu lấy và phát hiện 1004 mẫu lấy không đạt chất lượng (chiếm 2,52%, thấp hơn năm 2012 là 0,57%), trong đó có 186 thuốc nhập khẩu và 762 thuốc sản xuất trong nước

Bảng 1.1: Tỉ lệ thuốc kém chất lượng qua các năm từ 2009 - 2013

Đặc biệt gần đây, thuốc đông y vốn là lĩnh vực được coi là an toàn cũng

đã có dấu hiệu bị làm giả Việc trộn các thuốc tân dược vào đông dược để tăng tác dụng tức thì của thuốc đông dược Nếu thuốc đông dược thành phần

có trộn hoạt chất hoá dược (tân dược) nhưng không công bố trên nhãn hoặc tân dược mà ghi nhãn là thuốc đông dược, thực chất là thuốc tân dược thì được coi là thuốc giả Đây không chỉ là vấn đề riêng của nước ta mà các nước trên thế giới cũng rất quan tâm Trong những năm gần đây, ở nước ta, cùng với sự phối hợp của các cơ quan công an, thanh tra dược, hệ thống kiểm nghiệm từ Trung ương đến địa phương đã phát hiện nhiều loại thuốc này Trong số đó, bao gồm cả thuốc có hoặc không có nguồn gốc, thuốc sản xuất trong nước hay nhập từ nước ngoài nhưng nhiều nhất là chưa được cấp số đăng ký

Các thuốc này ngày càng được làm giả một cách khéo léo và tinh vi: ví

dụ trộn tân dược vào vỏ nang, lượng trộn được tính theo liều dùng của thuốc,…

Điển hình, năm 2010, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương phát hiện chế phẩm đông dược “Viên Bổ Thận Hà Thành”, là thực phẩm chức năng,

dung để bổ thận tráng dương, tăng cường sinh lý, có trộn trái phép Isoniazid (một chất ức chế men PDE-5, có tác dụng cương dương) có hàm lượng lên tới 98mg/viên Năm 2011, phát hiện thấy trộn trái phép Sibutramin trong một số thực phẩm chức năng hỗ trợ giảm béo như Lishou, Juji hay phát hiện Dexamethason trong bài thuốc gia truyền bổ tỳ chữa chứng biếng ăn, còi xương cho trẻ em

Tháng 3 năm 2011, Viện Kiểm nghiệm thuốc TW phối hợp với Quản lý thị trường đã phát hiện thuốc Zinnat giả và gần đây nhất tháng 4 năm 2012, Trung tâm Kiểm nghiệm Dược phẩm - Mỹ phẩm - Thực phẩm Hưng Yên đã phát hiện thuốc tiêm Voltarén® 75mg giả

1.2 Tổng quan về Isoniazid và Ethambutol

1.2.1 Danh pháp [3]

Isoniazid

Tên khoa học: pyridine-4-carbohydrazide

Công thức: C6H7N3O

Khối lượng phân tử: 137,1

Tính chất: Bột kết tinh màu trắng hay tinh thể không màu, không mùi Dễ tan trong nước, hơi tan trong ethanol 96%, khó tan trong chloroform, rất khó tan trong ether

Ethambutol hydroclorid

Tên khoa học: (2S,2’S)-2,2’- (ethylenediimino)dibutan -1-ol dihydrochloride Công thức: C10H26Cl2N2O2

Khối lượng phân tử: 277,2

Tính chất: Bột kết tinh màu trắng, dễ tan trong nước, tan trong ethanol 96% Nhiệt độ nóng chảy khoảng 2020C

B Hòa tan 0,1g chế phẩm trong 2 ml nước, thêm dung dịch nóng của 0,1g vanilin (TT) trong 10 ml nước, để yên và cọ thành ống nghiệm bằng một đũa thủy tinh, sẽ có tủa vàng, tủa này sau khi kết tinh lại bằng 5 ml ethanol 70% và sấy khô ở 100 – 105oC, có điểm chảy từ 226 – 231oC

A Phổ hồng ngoại (Phụ lục 4.2) của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại của Ethambutol hydroclorid chuẩn hoặc phổ hồng ngoại đối chiếu của Ethambutol hydroclorid chuẩn

B Phương pháp sắc ký lớp mỏng: Vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải phù hợp với vết chính của dung dịch đối chiếu về vị trí, màu sắc và kích thước

C Hòa tan 0,1g chế phẩm trong 10ml nước, thêm 0,2ml dung dịch đồng (II) sulfat 12,5 % (TT) Thêm 0,5 ml dung dịch natri hydroxyd 2M (TT), dung dịch có màu xanh da trời

D Chế phẩm cho phản ứng định tính (A) của ion clorid (phụ lục 8.1) Các phương pháp định tính Isoniazid và Ethambutol hydroclorid ở trên

là các phương pháp dùng các phản ứng hóa học và phương pháp sắc ký lớp mỏng phải sử dụng nhiều dung môi, thuốc thử vừa tốn nhiều thời gian, vừa độc hại Ngoài ra phương pháp thường được sử dụng rộng rãi để định tính

là phương pháp phổ hồng ngoại Phương pháp phổ hồng ngoại rất nhạy với các chất hút ẩm và các hợp chất nhạy trong không khí vì thế không thể đo phổ hồng ngoại trong dung dịch nước Mặt khác, khi đo phổ hồng ngoại của một hoạt chất trong viên thì phải chuẩn bị mẫu rất phức tạp như hòa tan, lọc, chiết, tách, bốc hơi đến khô, chứ không thể đo trực tiếp phổ hồng ngoại trên nền tá dược Phương pháp phổ Raman là một phương pháp phân tích hiện đại và mới bắt đầu được triển khai để ứng dụng trong Dược và phương pháp này đã khắc phục được hạn chế của các phương pháp trên và

có nhiều ưu điểm vượt trội.[5]

1.3 Tổng quan về phương pháp quang phổ Raman

1.3.1 Lịch sử phát triển [11], [18]

Năm 1928, chỉ với các thiết bị đo đạc thô sơ, sử dụng ánh sáng mặt trời làm nguồn kích thích, kính hiển vi làm bộ phận hội tụ ánh sáng tán xạ,

“detector” bằng mắt thường, Chandrasekhra Venkata Raman đã phát hiện ra một hiệu ứng tán xạ ánh sáng yếu, hiệu ứng này sau đó được đặt theo tên ông, hiệu ứng Raman Với điều kiện thiếu thốn như thế, sự phát hiện ra một hiện tượng yếu như tán xạ Raman là một thành quả rất đáng khâm phục và nó đã giúp ông đạt được giải Nobel vật lý năm 1930 [11]

Theo thời gian, những bước cải tiến trong các bộ phận của thiết bị đo đạc tán xạ Raman đã diễn ra Những nghiên cứu đầu tiên được tập trung vào sự phát triển nguồn ánh sáng kích thích Các loại đèn từ các nguyên tố khác nhau

đã được phát triển (như heli, chì, kẽm) nhưng không đạt yêu cầu bởi vì cường

độ ánh sáng tán xạ thu được vẫn rất yếu Nhiều năm sau đó, người ta nghiên cứu áp dụng và phát triển nguồn kích thích bằng đèn thủy ngân, nhưng nó vẫn không mang lại hiệu quả như mong muốn Cho tới tận năm 1962, đã có bước ngoặt lớn trong công nghệ Raman, đó là người ta đã đưa laser vào làm nguồn kích thích cho tán xạ Raman Các loại nguồn Laser sử dụng phổ biến thời đó chủ yếu là laser thuộc vùng UV-VIS như Laser Ar+ (351,1-514,5nm), Kr+

(337,4-674,4nm) và cho đến gần đây các nguồn laser IR và NIR được đưa vào

sử dụng làm hạn chế rất nhiều hiện tượng huỳnh quang (một hiện tượng tác động mạnh đến việc thu phổ Raman).[18]

Nhưng vẫn có nhiều hạn chế khiến cho quang phổ Raman phát triển tương đối chậm Đầu tiên là khó khăn trong việc điều khiển hệ thống quang học Thứ hai là huỳnh quang trong chất mẫu ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự phát hiện Raman Thứ ba, tán xạ Raman là tán xạ yếu, không hội tụ, muốn ghi được chính xác phổ của nó thì cần phải chiếu xạ laser kích thích trong một thời gian dài, điều này dẫn đến sự phân hủy và biến tính của mẫu Vậy nên, mặc dù bản chất là một phương pháp phân tích không phá hủy mẫu, nhưng một vài trường hợp, phổ Raman lại được nhận định là một phương pháp phá hủy mẫu chất.[18]

Những năm 1900, đã có một cuộc cách mạng mới trong quang phổ Raman Nhờ sự phát triển của một loạt các bộ phận như nguồn laser, sự tiến

bộ về công nghệ của detector, sự phát triển vượt bậc của các bộ lọc quang, sự cải tiến đáng kể về công nghệ phần mềm và ứng dụng của nó trong các phương pháp phân tích dữ liệu … mà quang phổ Raman được ứng dụng rộng rãi hơn Đặc biệt, với sự phát triển công nghệ nano, ngoài máy quang phổ Raman để bàn với hiệu lực phân tích rất cao, máy quang phổ Raman cầm tay

đã ra đời và rất thuận tiện cho việc phân tích nhanh, đánh giá sơ bộ, khảo sát tại thực địa các mẫu cần phân tích.[18]

1.3.2 Nguyên lý cơ bản của quang phổ Raman [11], [18]

Trong khi quang phổ hồng ngoại dựa trên sự hấp thụ, phản xạ và phát xạ ánh sáng, quang phổ Raman dựa trên hiện tượng tán xạ Tán xạ này xảy ra do

va chạm giữa các photon và các phân tử Ánh sáng tới với tần số 0 trên một phân tử nhất định mang một lượng các photon với năng lượng E=h 0 Ví dụ nguồn laser có bước sóng 500nm và công suất 1W chứa khoảng 2.5x1018

photon trong một giây Các photon này gồm cả các photon tương tác cũng như những photon truyền qua mà không tương tác với các phân tử

Hầu hết các photon trong số này va chạm đàn hồi với phân tử và không thay đổi năng lượng sau khi va chạm, các bức xạ phát ra sau đó được gọi là tán xạ Rayleigh Vì vậy, tán xạ Rayleigh gồm những photon có cùng tần số với ánh sáng tới

Một số lượng rất nhỏ của photon va chạm không đàn hồi với các phân tử

và trao đổi năng lượng sau va chạm Nếu phân tử nhận năng lượng h từ photon tới thì năng lượng của photon tán xạ sẽ giảm còn h( 0 – ) , và tần số của photon tán xạ khi đó là 0 – Ngược lại, khi photon tới nhận năng lượng

h từ phân tử, các năng lượng của các photon tán xạ tăng lên thành h( 0 + )

và tần số của photon tán xạ là 0 + Tán xạ mà có sự trao đổi năng lượng

của photon với một phân tử như trên được gọi là tán xạ Raman Và các tán xạ

có tần số 0 – và có tần số 0 + được gọi tương ứng là “ tán xạ Stokes ” và

“ tán xạ đối Stokes ” [18], [11]

Hình 1.1 Các thành phần thu được sau khi cho ánh sáng kích thích đến mẫu

Khi chiếu bức xạ điện từ h vào một phân tử, năng lượng có thể bị hấp thu hoặc phát xạ

 Tán xạ Rayleigh xuất hiện là do tương tác của ánh sáng tới với nguyên

tử

 Tán xạ Raman xuất hiện là do tương tác của ánh sáng tới với liên kết trong phân tử

Cũng như các phép đo quang phổ khác, khi đo tán xạ Raman ta khảo sát

sự thay đổi các mức năng lượng trong phân tử Quá trình trao đổi năng lượng

có thể xảy ra giữa các mức năng lượng của điện tử, các mức năng lượng của dao động hoặc quay, nhưng khi khảo sát quang phổ Raman chúng ta chỉ khảo sát năng lượng dao động phân tử, cụ thể hơn đó là dao động dọc theo trục của các liên kết

Hình 1.2 minh họa tán xạ Stokes và đối Stokes Tán xạ Stokes xảy ra khi một photon tương tác với một phân tử ở trạng thái năng lượng cơ bản, còn tán

xạ đối Stokes xảy ra khi photon tương tác với một phân tử ở trạng thái năng lượng kích thích Ở điều kiện thường, hầu hết các phân tử đều ở trạng thái năng lượng cơ bản, nên tán xạ Stokes dễ xảy ra hơn và chiếm đa số Vì vậy, trong các phép đo phổ Raman, người ta thường đo tán xạ Stokes

Hình 1.2 Tán xạ Raman Stokes và đối Stokes.m, n, r: các mức năng lượng

Một đại lượng quan trọng trong quang phổ Raman đặc trưng cho sự thay đổi tần số trong hiệu ứng Raman được gọi là “Raman shift” Đối với một chất, cường độ của các bức xạ tương ứng trên Raman shift là khác nhau, chúng tạo nên phổ Raman đặc trưng và duy nhất cho chất đó, đồng thời mỗi nhóm chức thì cho đỉnh phổ ở các số sóng đặc trưng khác nhau Vì vậy, phân tích phổ Raman, chúng ta có thể xác định được chính xác một chất và nghiên cứu cấu trúc của chất ấy.[18]

1.3.3 Nguyên tắc cấu tạo của thiết bị quang phổ Raman

1.3.3.2 Nguyên tắc cấu tạo cơ bản [17]

Máy quang phổ Raman được phát triển bởi nhiều công ty, nhiều hãng sản xuất khác nhau Nhưng về cơ bản nó bao gồm năm bộ phận sau: Nguồn laser,

bộ phận đựng mẫu, quang phổ kế, detector, hệ quang Hình 1.3 mô tả các bộ phận cơ bản của máy quang phổ Raman

Hình 1.3: Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ Raman

1.3.4 Ưu nhược điểm của phương pháp Quang phổ Raman

1.3.4.1 Ưu điểm

 Các phương pháp phân tích thông thường thường hay đi đôi với việc chuẩn bị mẫu như nghiền, hòa tan, lắc siêu âm, lọc, chiết, tách… đôi khi rất mất công mà lại còn làm ảnh hưởng đến bản chất của chất phân tích Ví dụ như việc nghiền mẫu dẫn đến làm thay đổi một số trạng thái rắn như trạng thái ngậm nước, dạng đa hình, và các liên kết hydro Phương pháp phân tích quang phổ Raman hầu như không yêu cầu việc chuẩn bị mẫu, vì vậy mà tiết kiệm về thời gian, không cần sử dụng thêm các dụng cụ bổ trợ khác, tiết kiệm công sức và tiết kiệm chi phí [5],[11]

 Có thể đo phổ Raman trực tiếp xuyên qua các bao bì đựng, các chai lọ thủy tinh, các vỏ bao film… mà không cần phải xâm lấn vào các cấu tạo bên trong mẫu, không làm hỏng cấu tạo của thành phẩm, ảnh hưởng đến mẫu đo và vì vậy mà không làm gián đoạn hoặc gây hao phí trong quá trình sản xuất Điều này rất thuận tiện trong việc theo dõi và kiểm soát chất lượng sản phẩm trong các khâu của quá trình sản xuất dược phẩm.[17]

 Phương pháp quang phổ Raman có thể phân tích được chỉ với một lượng mẫu nhỏ Điều này rất quan trọng trong việc đánh giá sự đồng nhất của mẫu đo, phân tích để phát hiện các chất chỉ với một lượng mẫu nhỏ Ngoài ra, nó còn có ý nghĩa trong quá trình theo dõi các phản ứng hóa học, bởi vì ở giai đoạn đầu của phản ứng thì sản phẩm tạo ra là rất

còn trong sản xuất dược phẩm thì việc cho kết quả sớm giúp chúng có những điều chỉnh kịp thời nhằm được những sản phẩm như ý muốn.[18]

 Việc đo quang phổ Raman khá là dễ dàng, vì vậy mà việc đào tạo để sử dụng được một thiết bị quang phổ Raman sẽ rất đơn giản, áp dụng được cho nhiều loại đối tượng phổ thông khác nhau mà không nhất thiết phải

có kiến thức chuyên sâu Việc sử dụng dễ dàng như vậy giúp cho máy quang phổ Raman ngày càng được phổ cập hơn, phương pháp phân tích phổ Raman được ứng dụng trong nhiều ngành nghề khác nhau hơn, nhất là trong công tác Hải quan và Pháp y, những ngành cần phải cho kết quả sàng lọc nhanh, độ tin cậy cao

 Sự ra đời của thiết bị FT-Raman với độ lặp lại cao tạo điều kiện cho sự phát triển các đầu thu có khẩu độ lớn, cho phép tia laser tập trung được vào một lượng mẫu lớn hơn, tín hiệu Raman thu được nhiều hơn, và chúng ta phân tích được một lượng mẫu lớn hơn khi cần thiết.[17]

 Nước hấp thu tán xạ Raman kém, vì vậy rất thuận tiện cho việc đo phổ của các chất ở dạng dung dịch trong nước

 Đầu dò sợi quang sử dụng công nghệ của cáp quang giúp kích thích và thu tín hiệu Raman ở một khoảng cách xa, ở trong những điều kiện độc hại, đo mẫu trong lòng của bao bì đựng lớn, điều kiện môi trường có nhiệt độ cao…

Khi nói đến phổ dao động phân tử, quang phổ Raman và IR luôn có quan

hệ mật thiết với nhau, có tính chất bổ sung cho nhau trong trong các phép phân tích xác định cấu trúc phân tử So với phương pháp quang phổ IR thì phương pháp phân tích phổ Raman có một số lợi thế hơn như sau:

 Đối với các hợp chất hút ẩm và các hợp chất nhạy trong không khí, cho vào ống thủy tinh nút kín rồi thu phổ Raman, trong phổ IR thì ống thủy tinh cường độ bức xạ IR.[11]

 Đo phổ trong dung dịch nước thì Raman dễ hơn IR, vì nước có tán xạ Raman rất yếu, trong khi nước cho phổ hồng ngoại mạnh

 Các máy quang phổ Raman bộ phận kích thích thường trang bị cùng kính hiển vi, giúp phân tích tập trung hơn nên chỉ cần một mẫu diện tích nhỏ là

có thể thu nhận được phổ, quang phổ hồng ngoại không có tính chất này

 Nhờ bước sóng laser kích thích ngắn hơn là bước sóng trong vùng hồng ngoại nên tia laser có khả năng đâm xuyên cao hơn, thu được tín hiệu từ sâu bên trong mẫu hơn, bên cạnh đó, cũng do nước và thủy tinh không hấp thu tán xạ Raman mà phương pháp quang phổ Raman có thể dùng để định lượng chất rắn trong viên, chất lỏng trong dung dịch nước Phổ IR không

có được điều này và nó chủ yếu là dùng để định tính.[18]

1.3.4.2 Nhược điểm và các yếu tố ảnh hưởng trong quá trình đo phổ

Tuy đã được phát triển từ rất lâu, có rất nhiều ưu điểm như vậy, nhưng chi phí cho các thiết bị quang phổ Raman còn rất cao, nên nó rất khó để được sử dụng rộng rãi như một phép phân tích thông thường Những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến phép đo phổ Raman đó là hiện tượng huỳnh quang, sự nóng lên của mẫu đo, sự hấp thu tán xạ Raman bởi nền mẫu hoặc mẫu và ảnh hưởng của độ phân cực

Nếu nền mẫu đo cho huỳnh quang, tín hiệu của phép đo sẽ có những thành phần huỳnh quang trong đó

Tín hiệu huỳnh quang xuất hiện khi bước sóng laser kích thích trùng lặp với một dải cường độ của mẫu đo Huỳnh quang thường phủ lên tín hiệu Raman, nó như là một nền dốc khá phẳng, có thể gây ra một đường nền ảo với

độ nhiễu thấp và làm giảm tỉ lệ S/N của các tín hiệu Raman Dải bước sóng và

cường độ huỳnh quang phụ thuộc vào thành phần hóa học của vật liệu phát huỳnh quang Bởi vì tín hiệu huỳnh quang thường mạnh hơn tín hiệu Raman nên chúng thường bao phủ và làm suy giảm đáng kể tín hiệu Raman Muốn triệt tiêu hoặc hạn chế huỳnh quang chúng ta thường sử dụng các detector vùng NIR Tuy nhiên việc làm giảm tín hiệu huỳnh quang bằng cách sử dụng nguồn laser kích thích có bước sóng dài một phần nào đó cũng làm giảm cường độ của tín hiệu Raman Chính vì vậy để tỉ lệ S/N của tín hiệu lớn nhất, chúng ta phải tính toán để cân bằng giữa các yếu tố: loại bỏ huỳnh quang, cường độ phát hiện và sự đáp ứng của detector Huỳnh quang chất rắn đôi khi được giảm thiểu bằng cách chiếu bức xạ laser vào mẫu đo một khoảng thời gian trước khi đo Quá trình này được gọi là photobleaching, nó là quá trình làm giảm các loạicường độ cao Photobleaching kém hiệu quả hơn trong chất lỏng, nơi có các mẫu di động.[17]

Quá trình chiếu laser kích thích, có thể làm nóng mẫu và gây ra một loạt các ảnh hưởng như làm thay đổi trạng thái vật lý của mẫu (nóng chảy), chuyển đổi dạng thù hình, đốt cháy hoặc làm phân hủy mẫu Nguy cơ làm nóng mẫu tăng khi công suất nguồn laser lớn hoặc kích thước của nguồn laser càng nhỏ (độ tụ cao) trong trường hợp sử dụng thấu kính hội tụ Vấn đề này thường xảy ra với các chất màu, chấtcường độ ánh sáng tốt hoặc các hạt nhỏ

có khả năng truyền nhiệt kém Những ảnh hưởng của việc làm nóng mẫu lên quá trình thu phổ Raman có thể nhận ra khi quan sát trực tiếp mẫu đo hoặc qua quan sát phổ đồ Một số cách đơn giản làm giảm sự nóng lên của mẫu đó

là giảm thông lượng tia laser, di chuyển mẫu hoặc chùm laser trong quá trình

đo, tăng tính truyền nhiệt của mẫu bằng cách cho tiếp xúc với các vật dẫn nhiệt tốt.[11], [17]

Sự tán xạ Raman bởi nền mẫu hoặc mẫu đo cũng có thể xảy ra Tuy việc

sử dụng laser NIR để kích thích cùng với hệ thống FT-Raman làm giảm hiện

tượng huỳnh quang, nhưng chính việc sử dụng laser NIR lại ảnh hưởng lớn đến sự thu tín hiệu Raman Các ảnh hưởng này nhiều hay ít phụ thuộc vào hệ quang của máy quang phổ Raman và phụ thuộc vào bản chất của mẫu đo Tuy nhiên sự ảnh hưởng này không quá nặng nề như trong việc đo phổ hấp thụ NIR bởi vì với bước sóng dài thì độ xâm nhập và bên trong mẫu đo của chùm laser là ít, tín hiệu Raman thu được chủ yếu là từ lớp mỏng ngoài cùng và vì lớp này mỏng nên cường độ tín hiệu Raman là không đáng kể

Cuối cùng, chúng ta cần phải nhớ rằng bức xạ laser là phân cực, vì vậy phổ Raman của mẫu tinh thể cũng như các mẫu có cấu trúc định hướng có thể khác nhau phụ thuộc vào cách mà chúng được tạo thành

1.3.5 Một số ứng dụng của quang phổ Raman trong thực tiễn

Với sự phát triển mạnh mẽ như vậy, ngày nay quang phổ Raman không chỉ còn là phương pháp phân tích cơ bản sử dụng trong phòng thí nghiệm mà còn được ứng dụng trong nhiều ngành khoa học khác nhau Trong khoa học vật liệu, quang phổ Raman giúp xác định cấu trúc vật liệu, xác định thành phần cấu tạo trong hỗn hợp rắn.[11], [17]

Trong pháp y, người ta sử dụng quang phổ Raman như một công cụ hiệu quả

để tìm ra các chất độc hại, gây tử vong hoặc dùng phương pháp phổ Raman

để bổ sung khẳng định kết luận pháp y.[13]

Trong khảo cổ học, người ta dùng phổ Raman để tìm ra các kim loại, đá quý, xác định nguồn gốc các cổ vật Trong hải quan, phổ Raman dùng để kiểm tra nhanh phát hiện các chất cấm như ma túy, chất gây nghiện, hướng thần, chất kích thích…Và đặc biệt trong ngành Dược có rất nhiều ứng dụng quan trọng trong việc định tính và định lượng thuốc trong quá trình giám sát và kiểm tra chất lượng thuốc.[7], [8], [9], [10], [15], [16], [22], [23]

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu

- Chất chuẩn: Isoniazid, Ethambutol (Chuẩn viện kiểm nghiệm

thuốc trung ương)

- 5 công thức viên nén và 5 công thức viên nang tự tạo: (Viên thuốc thực) có chứa các dược chất Isoniazid, Ethambutol và viên Placebo: Không có dược chất, chỉ bao gồm các tá dược

- Một số chế phẩm thuốc tân dược có chứa dược chất: Isoniazid, Ethambutol

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Xây dựng công thức viên nén, viên nang dựa trên hàm lượng thực tế trên thị trường và các nền tá dược cơ bản Mỗi loại viên được chế tạo trên 5 nền tá dược khác nhau và tương ứng với 5 nền viên placebo

- Kiểm tra chất lượng viên bằng các phương pháp phân tích thông thường

- Đo phổ Raman của chất chuẩn sau đó xây dựng bộ dịch chuyển Raman cơ bản của 2 hoạt chất trên

- Đo phổ của các mẫu viên placebo so với phổ chất chuẩn, xác định sự ảnh hưởng của các tá dược

- Đo phổ của các mẫu viên chứa dược chất so với thư viện phổ của chất chuẩn Xác định khoảng dao động về vị trí và cường độ của các giá trị dịch chuyển Raman

- Tạo viên có chứa hàm lượng dược chất 50% so với hàm lượng dược chất của các mẫu viên thực chế tạo, đo phổ Raman của viên, sau đó so sánh với phổ của của chất chuẩn và mẫu viên thực chế tạo tương ứng

- Đo phổ của một số viên thực tế trên thị trường, so sánh với thư viện phổ của chất chuẩn thiết lập được

2.3 Phương pháp nghiên cứu

- Thu thập tài liệu trong và ngoài nước liên quan đến đề tài Tham khảo các phương pháp và kỹ thuật phân tích của các nước tiên tiến trên thế giới về phổ Raman, cũng như ứng dụng của chúng trong phân tích dược phẩm

- Nghiên cứu cách sử dụng, khai thác phần mềm trên thiết bị: Hiệu chỉnh thiết

bị, cách xác định các đỉnh phổ, thiết lập công thức so sánh (chồng phổ, xác định hệ số match), cài đặt trong thiết bị… Cách thiết lập phổ chuẩn, tạo thư viện phổ chuẩn

- Các số liệu của đề tài được thu thập từ thực nghiệm và khả năng ứng dụng phương pháp đo phổ Raman

- Chế tạo các viên nghiên cứu đảm bảo chất lượng

- Đo phổ Raman của các chất chuẩn, xây dựng bộ dịch chuyển Raman cơ bản

- Đo phổ Raman của các mẫu viên nghiên cứu

- Đo phổ Raman của viên placebo, xác định sự ảnh hưởng của tá dược, nền mẫu lên phổ viên

- Ứng dụng để kiểm tra sự có mặt của 2 hoạt chất trên trong một số chế phẩm đang lưu hành trên thị trường

Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Công thức bào chế viên nén và viên nang của các hoạt chất dùng trong nghiên cứu

3.1.1 Công thức bào chế viên nén và viên nang của hoạt chất Isoniazid

Chế phẩm lưu hành phổ biến trên thị trường: Viên Isoniazid 150 mg (viên nén

CT2

Isoniazid 150,0 30,0 g

Lactose 50,0 10,0 g Lactose 50,0 10,0 g Avicel 120,0 24,0 g Avicel 120,0 24,0 g Natri starch

CT3

Lactose 60,0 12,0 g Lactose 60,0 12,0 g Tinh bột sắn 120,0 24,0 g Tinh bột sắn 120,0 24,0 g PVP-K30 15,0 3,0 g PVP-K30 15,0 3,0 g Magnesi stearat 3,0 0,6 g Magnesi stearat 3,0 0,6 g Aerosil 2,0 0,4 g Aerosil 2,0 0,4 g Nước tinh khiết - 25,0 ml Nước tinh khiết - 25,0 ml

CT5

Isoniazid 150,0 30,0 g

Tabletose 70,0 14,0 g Tabletose 70,0 14,0 g Avicel 110,0 22,0 g Avicel 110,0 22,0 g Natri starch

Viên nang Isoniazid 150 mg (nang cứng chứa 150 mg Isoniazid)

Bảng 3.2: Công thức bào chế viên nang Isoniazid

CT2

Isoniazid 150,0 30,0 g

Tinh bột mỳ 65,0 13,0 g Tinh bột mỳ 65,0 13,0 g Lactose 130,0 26,0 g Lactose 130,0 26,0 g Aerosil 4,0 0,8 g Aerosil 4,0 0,8 g

CT3

Isoniazid 150,0 30,0 g

Lactose 120,0 24,0 g Lactose 120,0 24,0 g Avicel 70,0 14,0 g Avicel 70,0 14,0 g Magnesi stearat 5,0 1,0 g Magnesi stearat 5,0 1,0 g

CT4

Isoniazid 150,0 30,0 g

Tinh bột mỳ 100,0 20,0 g Tinh bột mỳ 100,0 20,0 g Avicel 90,0 18,0 g Avicel 90,0 18,0 g Natri lauryl

sulfat

10,0 2,0 g Natri lauryl

sulfat

10,0 2,0 g Aerosil 4,0 0,8 g Aerosil 4,0 0,8 g

CT5

Isoniazid 150,0 30,0 g

Lactose 175,0 35,0 g Lactose 175,0 35,0 g PVP-K30 20,0 4,0 g PVP-K30 20,0 4,0 g Magnesi stearat 3,0 0,6 g Magnesi stearat 3,0 0,6 g Aerosil 1,0 0,2 g Aerosil 1,0 0,2 g

3.1.2 Công thức bào chế viên nén và viên nang của hoạt chất Ethambutol

Chế phẩm lưu hành phổ biến trên thị trường: Viên Ethambutol 400 mg (viên nén chứa 400 mg ethambutol hydroclorid)

Bảng 3.3: Công thức bào chế viên nén Ethambutol

glycolat

20,0 4,0 g Natri starch

glycolat

20,0 4,0 g PVP-K30 10,0 2,0 g PVP-K30 10,0 2,0 g

Magnesi stearat 3,0 0,6 g Magnesi stearat 3,0 0,6 g Talc 6,0 1,2 g Talc 6,0 1,2 g Ethanol 96% - 38,0 ml Ethanol 96% - 38,0 ml

Viên nang Ethambutol 100 mg (nang cứng chứa 100 mg ethambutol hydroclorid)

Bảng 3.4: Công thức bào chế viên nang Ethambutol

stearat

1,5 0,3 g Magnesi

stearat

1,5 0,3 g Aerosil 1,0 0,2 g Aerosil 1,0 0,2 g