Xây dựng phương pháp định lượng xylometazolin HPLC trong thuốc nhỏ mũi nostravin của công ty cổ phần dược phẩm traphaco bằng HPLC

Khái niệm về sắc ký Sắc ký là một nhóm các phương pháp hoá lý dùng để tách các thành phần của một hỗn hợp.. Sự tách sắc ký được dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất giữa hai pha

BÀNG HPLC

(K H O Á LUẬN T Ố T N G H IỆP D ư ợ c SỸ K H O Á 2001-2006)

Người hướng dãn; PGS.TS Trần Đức Hậu

Nơi thực hiện: Bộ m ôn H oá DượcThời gian thực hiện: tháng 06 - 12/2005

Hà nội, tháng 05 - 2006

Lời cảm ơn

N hân dịp hoàn thành khoá luận tốt nghiệp, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn

và cám ơn chân thành lới:

P Q § T S T r ầ n Đ ứ c l ị ậ u

Người thầy kính m ến đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi hoàn thành khoá luận

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến:

- Các thầy cô, các cán bộ trong bộ m ôn Hoá Dược đã tạo điều kiện

về cơ sở vật chất, đồng thời đã giúp đỡ, động viên tôi

- Phòng KTCL - CTCPDP Traphaco đã có sự hợp tác và cung cấp nguyên liệu cho đề tài

- Bộ m ôn Hoá vô cơ và bộ môn Bào chế

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bè bạn đã động viên, giúp đỡ tôi trong thời gian qua

H à n ộ i, th á n g 05 - 2 0 0 6

S inh v iên

N g ô A n h N g ọ c

MỤC LỤC

CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT

ĐẬT VẤN Đ Ể I

PHẦN I: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về thuốc nhỏ mũi Nostravin 3

1.1.1 H ình ảnh sản p h ẩ m 3

1.1.2 Công thức bào c h ế 3

1.1.3 Tác d ụ n g 4

1.1.4 Chỉ đ ịn h 5

1.1.5 Tác dụng không m ong m u ố n 5

1.1.6 Thận trọ n g 5

1.1.7 Tương tác th u ố c 5

1.1.8 M ột số thuốc nhỏ m ũi chứa X ylom etazolin.H C l 5

1.2 Tổng quan về HPLC 6

1.2.1 K hái niệm về sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng c a o 6

1.2.2 Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống H PL C 6

1.2.3 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký và các yếu tố ảnh hư ởng 10

1.2.4 Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc k ý 15

1.2.5 Đ ịnh lượng bằng phương pháp H PLC 18

PHẦN II: ĐỐI TƯỢNG, THIẾT BỊ, HOÁ CHẤT, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứ u 20

2.1 Đới tượng 20

2.2 T h iết bị, dụng cụ, hoá ch ấ t 20

2.2.1 T hiết bị, dụng c ụ 20

2.2.2 H oá c h ấ t 20

2.3 Nội d ung và phương pháp nghiên cứ u 21

2.3.1 N ghiên cứu, xây dựng phương pháp định lượng X ylom etazolin.HCl bằng H PLC (sắc ký pha đ ả o ) 21

2.3.2 Đ ánh giá phương pháp vừa xây dựng về các mặt: tính chính xác, tính tuyến tính, tính đặc hiệu và tính đ ú n g 2 2 2.3.3 Áp dụng phương pháp để xác định hàm lượng X ylom etazolin.HCl cho một lô sản phẩm N o strav in 23

2.3.4 M ột số công thức toán thống kê được sử dụng để đánh giá kết q u ả 23

PHẦN III: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT Q U Ả 24

3.1 X ây dựng phương pháp định lượng X yiom etazolin H C l tron g thuốc nhỏ m ũi N ostravin bằng H P L C 24

3.1.1 N guyên tắc lựa chọn điều kiện sắc k ý 24

3.1.2 Tiến hành khảo sát và lựa chọn các điều kiện sắc ký cho phương pháp định lư ợ n g 24

3.1.3 Thử tính thích hợp của hệ th ố n g 27

3.2 Đ ánh giá phương p h á p 29

3.2.1 Tính chính x á c 29

3.2.2 Tính tuyến tín h 29

3.2.3 T ính đặc h iệ u .31

3.2.4 Tính đ ú n g 34

3.3 Áp dụng phưong pháp đê xác định hàm lượng X ylom etazolin H C l trong m ột lô sản phẩm N o stra v in 36

3.4 K ết quả và bàn lu ậ n 37

PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XưẤT 40

4.1 K ết lu ậ n 40

4.2 Đ ề x u ấ t 40

TÀI LIÊU THAM KHẢO

PHU LUC

CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT

ĐẬT VÂN ĐỂ

Cảm lạnh là một bệnh thường gặp ở nhiều quốc gia trên thế giới, trong

đó có Việt Nam Bệnh do nhiều loại virus khác nhau gây ra, bao gồm; rhinovirus, Coronavirus, RSV, parainfluenza virus, adenovirus, enterovirus, influenza A virus, và influenza B virus Triệu chứng thường gặp của bệnh; nghẹt mũi, tắc mũi đau họng, hắt hơi, đau đầu khó chịu, chảy nước mắt, ho, khản giọng, Tác nhân là virus nên chưa có liệu pháp điều trị đặc hiệu, chủ yếu là điều trị triệu chứng [12]

Thuốc nhỏ mũi chứa Xylom etazolin.H C l là một trong những thuốc điều

trị có hiệu quả đối với bệnh trên; làm giảm xung huyết mũi và dùng dưới dạng nhỏ mũi nên tác dụng nhanh, ít tác dụng phụ (chủ yếu là tác dụng khư trú) Sản phẩm thuốc nhỏ mũi chứa hoạt chất này được nhiều công ty trong nước và ngoài nước sản xuất; Otrivin (Novartis - Mỹ), Nostravin (Traphaco - Việt

N am ), Có một số phương pháp được dùng để định lượng Xylometazolin.HCl trong thuốc nhỏ mũi như sau:

<♦ Trong các Dược điển:

- Trong Dược điển Anh BP2003 và Dược điển M ỹ USP28 ¡phụ lục I ỉ:

Nguyên tắc: Dùng phương pháp đo quang trong vùng khả kiến với quátrình tạo màu sau nhiều giai đoạn chiết tách với dung môi hữu cơ

Đặc điểm: Phương pháp này có quá nhiều công đoạn, mất nhiều thời gian để thực hiện Đặc biệt là phải qua giai đoạn chiết tách, đây là giai đoạn

dễ làm hao hụt lượng Xylometazolin.HCl

- Còn trong Dược điển Việt Nam ỉlỉ và Dược điên quốc fế (third

edition): chưa có chuyên luận về Xylometazolin.HCl và thuốc nhỏ mũi chứa

Xylometazolin.HCl

<♦ Tại CTCPDP Traphaco đã áp dụng hai phương pháp định lượng Xylometazolin.HCl trong thuốc nhỏ mũi Nostravin:

- Phương pháp đo quang:

Nguyên tắc: thực hiện tương tự phương pháp định lượng có trong BP2003 nhưng bỏ qua giai đoạn chiết tách để rút ngắn thời gian định lượng

Đây là sự vận dụng của phòng KTCL - CTCPDP Traphaco để đáp ứng nhu cầu kiểm nghiệm nhanh sản phẩm sau khi sản xuất ra

- Phương pháp HPLC [phụ lục 21: phương pháp này được sử dụng gần

đây tại phòng KTCL - CTCPDP Traphaco để kiểm tra hàm lượng Xylometazolin.HCl cho sản phẩm Nostravin

Nguyên tắc: sử dụng sắc ký pha thuận với cột Si 60

Cả hai phương pháp định lượng trên đều có chung hạn chế: độ ổn định của phương pháp không cao

Trước thực tế đó, các cán bộ phòng KTCL - CTCPDP Traphaco mong muốn xây dựng một phương pháp định lượng cho kết quả ổn định hơn Theo

đề nghị của phòng KTCL - CTCPDP Traphaco, chúng tôi đã tiến hành nghiên

cứu đề tài “X«J dựng phương pháp định lượng X ylom etazolin.H C l trong

thuốc nhỏ mũi Nostravin'" với những muc tiêu:

7 Xầy dựng phương pháp định lượng Xyỉometaiolin.HCÌ trong thuốc nhỏ mũi Nostravin do CTCPDP Traphaco sản xuất hằng HPLC đáp ứng đầy đủ các chỉ tiêu của một phương pháp cíịnli lượng.

2 Áp dụng phương pháp trên đê' xác định hàm lượng Xylometazolin.HCỉ cho m ột lô sản phẩm Nostravin.

*x* Xylometazolin.HCl:

- Công thức;

• HCI

Công thức phân tử: C,f,H24N2.HCl

Phân tử lượng; 280.84

TKH: 2-(4-tert-butyl-2,6-dimethylbenzyl)-2-imidazoline hydrochloride

- Tính chất vật lý:

Bột tinh thể màu trắng hoặc gần như trắng

Tan nhiều trong nước, tới 3 %; cũng tan trong methanol, ethanol; thực

tế không tan trong ether, benzene

+ Bột tinh thê màu trắng hoặc gần như trắng

+ Dễ tan trong nước, tan trong cồn, không tan trong methylen clorid

1.1.4 Chỉ định

Điều trị xung huyết do các bệnh: dị ứng, sốt phát ban, kích ứng mũi và đặc biệt trong bệnh cảm lạnh

1.1.5 Tác dụng không mong muôn

- Hiếm gặp: dị ứng (khó thở, đau họng, sưng môi, lưỡi hay mặt); động kinh, ảo giác; nhịp tim nhanh hoặc không bình thường

- Hay gập: hắt hơi, nóng mũi, đau mũi, khô mũi, kích ứng mũi

1.1.6 Thận trọng

- Phụ nữ có thai hoặc phụ nữ cho con bú

- Bệnh nhân mắc một số bệnh: tâng huyết áp, tim mạch, tuyến giáp,đái tháo đường, tâng nhãn áp, gan, thận, phì đại tuyến tiền liệt hoặc đi tiểu khó

Ngoài Otrivin, còn có một số thuốc nhỏ mũi khác chứa Xylometazoline.HCl với các tên biệt dược: Neo-Rinoleina; Novorin; Olynth; Otriven; Xymelin.

1.2 TỔNG QUAN VỂ HPLC [4], [5], [6], [14], [15], [19], [20]

1.2.1 Khái niệm về sác ký và sác ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

a Khái niệm về sắc ký

Sắc ký là một nhóm các phương pháp hoá lý dùng để tách các thành phần của một hỗn hợp Sự tách sắc ký được dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất giữa hai pha luôn tiếp xúc và không hoà lẫn vào nhau: một pha tĩnh và một pha động

b Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Phương pháp HPLC là phương pháp sắc ký được xác định dựa trên sự phân tách của các chất giữa hai pha: pha động và pha tĩnh

HPLC sử dụng pha động là chất lỏng để tách các chất trong hỗn hợp Những chất này đầu tiên được hoà tan trong một dung môi, sau đó được chảy qua cột dưới áp suất cao Trong cột, hỗn hợp được rửa giải thành nhiều thành phần Mức độ rửa giải là quan trọng, và nó phụ thuộc vào mức độ tương tác giữa các thành phần chất tan với pha tĩnh và pha động Sự tương tác của chất tan vói pha tĩnh và pha động có thể thay đổi thông qua sự lựa chọn hai pha này Kết quả, HPLC tạo ra một sự phân tách cao mà không tìm thấy trong các

hệ thống sắc ký khác và nó có khả năng phân tách dễ dàng một hỗn hợp gồm nhiều chất hoá học

1.2.2 Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC

dùng một bơm cao áp để đẩy pha động chảy qua cột Quá trình sắc ký bắt đầu khi tiêm chất tan lên một đầu của cột Khi chất tan và pha động được đẩy xuyên qua cột thì sự phân tách các chất xảy ra Mỗi chất tan được rửa giải từ cột được detector ghi lại dưới dạng một pic.

2 Hệ thống b(ửn:

Bcím cao áp dùng để đẩy pha động đi qua cột

Các tiểu phân pha tĩnh càng nhỏ thì yêu cầu áp suất càng cao ưu điểm của dùng bơm cao áp: phân tích nhanh, hệ số rửa giải cao, và tăng khả năng nạp mẫu

Bơm hiện đại thường có các thông số:

- Chiều dài 10, 15, hoặc 25 cm và

thích hợp với những tiểu phân pha

đi qua tế bào (cell), được chuyển thành sự thay đổi điện thế Sự thay đổi điện thế được ghi lại trong thiết bị ghi kiểu đổ thị và thường xuyên được chuyên vào máy tích phân hay máy vi tính đế cung cấp thời gian luxi và diện tích hay chiều cao pic

Detector hay dùng nhất là detector hấp thụ tử ngoại.

có thể được tiêm ngay sau khi đã

lọc loại tạp qua màng lọc 0,43

|im, còn mẫu rắn cần hoà tan

trong một dung môi thích hợp

Dung môi không nhất thiết phải

là pha động, nhimg nó thường

So’ dồ của mộí hệ tiêm mẫu

6 Hệ thống gỉii và phân tích dữ liệu:

Tín hiệu detector là tín hiệu điện và sử dụng thiết bị hiện đại có thể giúp cho việc phân tích dữ liệu Thêm nữa, vài hệ thống có thể luii giữ dữ liệu và có thể lấy ra cho phân tích phức tạp hơn về sau

Mục tiêu chính của việc sử dụng hệ thống lưii và phân tích dữ liệu trên là tăng tính chính xác và tính đúng, trong khi người sử dụng lại giảm được thời gian phải trực máy Có vài loại hệ thống dữ liệu Trong phân tích thông thường (quá trình quản lý dữ liệu và điều khiển quá trình là không tự động), một chương trình tích phân có thể thích hợp Nếu yêu cầu mức độ kiểm tra cao hơn, một thiết bị thông minh hơn là cần thiết: giống như một máy vi tính loại nhỏ ưu điểm của thiết bị thông minh này trong sắc ký thể hiện trong một sô phần Đầu tiên, sự lựa chọn tự động bổ sung trở nên dễ dàng hơn Thứ hai phân tích dữ liệu phức tạp trở nên khả thi hơn Những sự lựa chọn phân tích này bao gồm những đặc trưng như: sự tối lai thông số chạy và sự phân tách của những pic chồng lên nhau Cuối cùng, bảo vệ bằng phần mềm có thê được thiết kế để giảm các lỗi sử dụng hệ thống một cách ngẫu nhiên Ví dụ, người thực hiện có thể thiết lập giới hạn tỷ lệ của sự thay đổi dung môi Điều này sẽ kéo dài tuổi thọ của cột bởi giảm nhiệt độ và các ảnh hưởng hoá học Nói chung, chương trình do ngưòi sử dụng thiết lập rẻ hơn và có tính thực tế hơn.

1.2.3 Các thông sỏ đặc trưng của quá trình sắc ký và các yếu tô ảnh

hưỏng:

a Tốc độ di chuyển của các chất

Sư phân b ố chất tan siữa hai pha:

Sự phân bố của chất tan giữa các pha có thể miêu tả khá đơn giản Chất tan tồn tại trong một trạng thái cân bằng giữa hai pha: pha động và pha tĩnh

A -7—^ Á

^pỉìii cỉộììsị " ^pỉia íĩiìli

Hê s ố phân bố, K , có giá trị bằng tỷ số nồng độ mol của chất tan trong pha

tĩnh trên nồng độ mol của chất tan trong pha động

Cs và C m là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh và pha động

Vói một chất ,nếu K lớn thì chất đó sẽ phân bố nhiều vào pha tĩnh và sẽ di chuyển chậm, nếu K nhỏ thì nó sẽ di chuyển nhanh

10

‘ M

A

\

Thời sign lưu, tp (phút), là thời gian

cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm

mẫu qua cột sắc ký, tói detector và cho g

pic trên sắc đồ (tính từ lúc tiêm đến I

là thời gian lưu của một chất H

không bị lim giữ, nghĩa là tốc độ di jiiY^gchuyển của nó bằng tốc độ di chuyển

trung bình của các phân tử dung mồi

Thừa sốdiinỊi ÌKơrìịì, K \ thường dùng để mô tả tốc độ di chuyến của chất

tan trên cột Thừa số dung lượng cho chất tan A được xác định;

Chiều rộng pic được đo ở 1/10

chiều cao pic

c ao pK

+ Cách 2: A F =

-¿a

ở đây: w là độ rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic.

a là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic

Thực tế: đĩa không tồn tại, chúng là sự liên tưởng về hình ảnh giúp chúng

ta hiểu quá trình xảy ra ở trong cột

Số đĩa lý thuyết của một cột thật có thể được tìm thấy bởi sự phân tích pic sau quá trình rửa giải:

N = 1 6 ; ^ hay N = 5 5 4 ^

Wb' chiều rộng đo ở đáy pic

W |/2: chiều rộng đo ở nửa chiều cao pic

Ta thấy khi cột có hiệu lực cao (N lớn) thì Wg nhỏ

b Sự chọn lọc và sự phân giải

Xét sự tách hai chất A và B trên cột Lúc đầu, cho hỗn hợp hai chất A, B lên đầu cột, ở đó A và B tự phân bố vào hai pha (một cách khác nhau) Thêm dung môi mới vào cột, phần dung môi mới sẽ đẩy dung môi có hoà tan A, B xuống phần cột bên dưới Tiếp tục thêm dung môi mới, A và B bị kéo dần xuống Tại một thời điểm nào đó hai dải A và B tách riêng ra khỏi nhau ỏ’ trên cột Nếu ngừng tại đây ta có sắc ký khai triển

12

Nếu tiếp tục thêm dung môi mới, thì tại một thời điểm nào đó lần lượt dải chất A, rồi đến dải chất B ra khỏi cột gặp detector và cho ta tín hiệu dưới dạng một pic sắc đồ thu được gọi là sắc đổ rửa giải.

QUA IJRINH SAC K ¥

Sơ đồ minh hoạ quá tyình rách hai chất A vù B trên cột sắc ký

Sư chon ỉoc: (miêu tả sự tách của hai chất A và B trên cột)

Đô phân siả i:

'■ư

|:,Ị'-+ Độ phân giải cơ bản đạt được khi R = 1,5

+ Ngoài ra còn tính R dựa trên:

-4 , ư l '

Muốn đạt được độ phân giải cao thì có 3 cách:

+ Tăng N (tãng số lượng đĩa lý thuyết):

Tăng chiều dài cột dẫn đến tăng thời gian lưu và tâng sự doãng pic - đó không phải là điều mong muốn

Giảm chiều cao của một đĩa lý thuyết bằng cách giảm kích cỡ của các tiểu phân nhồi pha tĩnh

+ Kiểm soát thừa số dung lượng k ’; thay đổi thành phần pha động

+ Hệ số chọn lọc a, có một số cách để thay đổi:

Thay đổi thành phần pha động Thay đối nhiệt độ của cột Thay đổi thành phần của pha tĩnh

Sử dụng liên kết hoá học đặc biệt: kết hợp một chất trong dạng phức hợp với một chất tan vào trong pha tĩnh

14

1.2.4 Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký

So sánh sắc kỷ pha thuận và sắc ký pha đảo

Sắc ký pha thuận STT Nội dung

Loại này sử dụng làm pha tĩnh cho sắc ký pha thuận

đê phân tích các chất ít hoặc không phân cực

Silica đã alkyl hoá, được điều chế bằng cách alkyl hoá các nhóm OH trên bề mặt Silica bằng các gốc alkyl: R của mạch carbon (C2, C8, C18) hay các gốc carbon vòng Do các nhóm OH thân nước được thay bằng các gốc R kỵ nước nên bề mặt trở nên ít phân cực hơn Silica đã alkyl hoá được sử dụng cho sắc ký pha đảo để phân tích các chất phân cực, ít phân cực hay sắc ký cặp ion

Pha động Dung môi hữu cơ:

n-hexane, heptane, chloroform,

alcohol

Hỗn hợp nước với methanol, acetonitril

và một số chất thêm vào (đệm cặp ion)

15

- Sơ đồ minh hoạ thứ tự rửa giải của các thành phần trong sắc ký pha thuận

+ Chất nhồi cột cho pha tĩnh trên nền silica (SÌO2):

CH-,

CH3

+Một số nhóm thế trong sắc ký pha thuận và pha đảo:

Pha thuận: nhóm thế làm tăng độ phân cực:

cyano: -C2H4CN

16

+ Một SỐ loại cột thường dùng trong sắc ký pha thuận và pha đảo:

Loại sắc ký N hóm th ế R Tên thương mại

Lichrosord RP18

+ Yêu cầu pha tĩnh trong HPLC:

Phải trơ và bền vững với môi trường sắc ký

Có khả năng tách một hỗn hợp chất tan nhất định

Tính chất bề mặt ổn định

Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt

Cỡ hạt phải tương đối đổng nhất

- Pha động:

+ Pha động quyết định thời gian lull của chất tan và hiệu quả tách của quá trình sắc ký

+ Yêu cầu đối với pha động:

Phải trơ đối với pha tĩnh

h - r i

17

Phải hoà tan được chất phân tích.

Phải bền vững theo thời gian

Phải có độ tinh khiết cao

Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký

Phù hợp với loại detector

Phải có tính kinh tế và không ảnh hưởng nhiều đến môi trường

+ Các yếu tố của pha động ảnh hưởng đến kết quả tách của một hỗn hợp chất:

Thành phần của các chất tạo ra pha động

3 Đo tín hiệu detector

b Các phương pháp định lượng

1 Phương pháp chuẩn ngoại: là phương pháp định lượng cơ bản trong đó

cả hai mẫu chuẩn và mẫu thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện

So sánh diện tích hoặc chiều cao pic của mẫu thử với diện tích hoặc chiều cao pic của mẫu chuẩn đã biết nồng độ sẽ tính được nồng độ của các chất có trong mẫu thử

2 Phương pháp chuẩn nội:

- Nguyên tắc: Thêm những lượng giống nhau của chất chuẩn thứ hai vào

cả chuẩn ngoại lẫn mẫu thử rồi tiến hành sắc ký Chất chuấn thứ hai này được gọi là chuẩn nội

- ưu điểm: giúp cực tiểu hoá các sai số có thể nảy sinh do quá trình xử lý mẫu (chiết xuất, tinh chế), do máy móc và kỹ thuật tiến h ành,

- Phương pháp chi dùng khi không lạo được mẫu placebo

3 Phương pháp chuẩn hoú diện tích pic:

- Nguyên tắc; Hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều

thành phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic của nó so với tổng diện tích của tất ca các pic thành phần Irên sác đổ

Phương pháp này yêu cầu tất cả các thành phần đều được rửa giải và được phát hiện, và tất cả các thành phần đều có đáp ứng detector như nhau

- Áp dụng: ít dùng, chỉ dùng trong xác định hàm lượng tạp chất khi coi đáp ứng của các tạp là như nhau

19