2.3.1. Nghiên cứu, xây dựng phương pháp định lượng Xylometazolin.HCI
bằng HPLC (sắc ký pha đảo)
*1* Tham khảo các phương pháp định lượng đã công bố: - Dược điển Anh BP2003 và Dược điển Mỹ USP28: Nguyên tắc tiến hành:
+ Chiết tách Xylometazolin.HCl bằng dicloromethane trong môi trường kiềm.
+ Bốc hơi dung môi thu được cặn Xylometazolin. + Thực hiện phản ứng màu với Natri nitroprusside. + Đo độ hấp thụ của dung dịch tại = 560 nm. + Tiến hành tương tự với Xylometazoiin.HCl chuẩn.
+ Dựa trên độ hấp thụ của mẫu thử và mẫu chuẩn tính ra hàm lượng phần trăm của Xylometazolin.HCI có trong chế phẩm.
Đặc điểm của phương pháp: Phương pháp này có quá nhiều công đoạn và cần nhiều thời gian để thực hiện. Đặc biệt, phương pháp có giai đoạn chiết tách. Đây là giai đoạn dễ làm hao hụt lượng Xylometazolin.HCl, nhất là với những người không có nhiều kinh nghiệm. Chính vì lý do này mà phòng KTCL - CTCPDP Traphaco đã không áp dụng phương pháp trên.
- Các phương pháp định lượng đang thực hiện tại phòng KTCL - CTCPDP Traphaco:
+ Phương pháp đo quang: thực hiện tương tự Dược điến Anh BP2003 nhưng bỏ qua giai đoạn chiết tách.
+ Phương pháp HPLC (cột Si 60): Điều kiện sắc ký:
Detector; UV 245 nm
Pha động: Methanol - düng dich đệm amoni nitrat 9,5 (94- 6). Cả hai phương pháp này đều có hạn chế chung; độ ốn định của phương
pháp không cao.
- Phương pháp định lượng mà phòng KTCL - CTCPDP Traphaco đề xuất [phụ lục 3]:
+ Pha động: đệm phosphat-acetonilril = 60 - 40 (đệm phosphat: dung dịch KH2PO4 0 ,0 IM được điều chỉnh đến pH = 3,4 bằng dung dịch H3PO4).
+ Detector UV: 267 nm. - Bài báo, tạp chí;
Định lượng đổng thời Dexamethason và Xylometazolin.HCl trong thuốc nhỏ mũi chứa methyl p-hydroxy benzoat bằng HPLC [phụ lục 4]
Điều kiện sắc ký:
Cột: Nucleosil C8 (250x3 mm, 5 |uim) Pha động: acetonitril - nước = 35 - 65.
<♦ Qua tham khảo các tài liệu và dựa vào cấu trúc phân tử, tính chất lý hoá học của Xylometazolin.HCl cũng như điều kiện thực nghiệm ở các cơ sở sản xuất và tại bộ môn Hoá Dược - Trường ĐH Dược Hà nội đê nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật định lượng Xylometazolin.HCl bằng phương pháp HPLC.
*1* Bằng thực nghiệm khảo sát và nghiên cứu các điều kiện tiến hành đê
x â y dimg phương pháp định lượng:
- Khảo sát điéii kiện sắc ký: Chọn cột, pha động, bước sóng xác định và tốc độ dòng thích hợp để tách tốt nhất và tôi im thời gian phân tích.
- Xây dựng phương pháp định lượng, đánh giá tính thích hợp của hệ thống.
2.3.2. Đánh giá phương pháp vừa xây dựng về các mặt: tính chính xác,
tính tuyến tính, tính đặc hiệu và tính đúng
2.3.3. Áp dụng phương pháp đê xác định hàm luọTig Xylom etazolin.HCI
cho một lò sản phẩm Nostravin
2.3.4. Một sô công thức toán thông ké được sử dụng đẻ đánh giá kết quả
— 1 " .
- Giá trị trung bình; x= - X xi
- Độ lệch chuán SD: SD / = 1
/ 7 - 1
- Độ lệch chuẩn tương đối RSD: RSD(%) = ^ . 100
Í...S
- Khoảng tin cậy: X ±
PHẦN III; THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ
3.1. Xây dựng phương pháp định lượng Xylometazolin.HCI trong thuốc nhỏ mũi Nostravin bằng HPLC
3.1.1. Nguyên tắc lựa chọn điều kiện sác ký
<♦ Nguyên tắc;
- Chọn cột sắc ký: trong phương pháp HPLC với điều kiện sắc ký pha đảo. cột sắc ký thường dùng là Nucieosil C8. C18: Lichrosord RP8. RP18,. .. Với điều kiện sẩn có cua phòng thí nghiệm, chúng lôi sử dụng CỘI Nucleosil C18
(250 X 4mm; 5|im).
- Chọn pha động: Trong phương pháp HPLC pha đảo, pha động thường
dùng là acetonitril, methanol. nước hay hỗn hợp của các dung môi trên. Dựa vào pKa của Xylometazolin.HCl và điểu kiện hoá chất hiện có trong phòng thí nghiệm chúng tôi lựa chọn đệm phosphat với pH acid.
- Chọn bước sóng: dựa vào cấu trúc phân tử của Xylometazolin.HCl là có hai vòng thofm nên có thế sẽ hấp thụ u v . Do đó, chúng tôi dự kiến dùng Detector u v .
<♦ Dựa trên các nguyên tắc trên thì trong các phương pháp chúng tôi đã tham khảo (mục 2.3.1), chỉ có phương pháp mà phòng KTCL - CTCPDP Traphaco đề xuất là khá phù hợp. Từ đó. chúng tôi tiến hành nghiên cứu bước đầu dựa trên các điều kiện của phương pháp này.
3.1.2. Tiến hành khảo sát và lựa chọn các điều kiện sác ký cho phương
pháp định lượng
♦> Đầu tiên, chúng tôi tiến hành thử theo phương pháp mà phòng KTCL - CTCPDP Traphaco đề xuất.
Kết quả: không có pic nào xuất hiện. Điều đó chứng tỏ các điều kiện của phương pháp sắc ký này là chưa phù hợp.
♦t* Sau đó. chúns tôi tiến hành kháo sát và lựa chọn các điều kiện sắc ký;
- Detector: Chúng tôi tiến hành khảo sát phổ hấp thụ của Xylometazolin. HCl:
XvlometiazDlin.HCl
nrn
Phổ của Xylometazolin.HCl có một cực đại tại Amax = 213 nm.
Trong quá trình tiến hành sắc ký. tại bước sóng A = 213 nm thi thường mất khá lâu để ổn định đường nền và quá trình sắc ký nhiều khi không ổn định. Do đó chúng tôi đã lựa chọn bước sóng phát hiện A = 225 nm, tại bước sóng này quá trình sắc ký ổn định hơn và độ hấp thụ của Xylometazolin.HCl cũng không thấp hơn nhiều so với độ hấp thụ tại bước sóng A = 213 nm.
- Pha động'. Khi thay đổi thành phần và tỷ lệ của pha động (acetonitril - đệm phosphat). chúng tôi đã rút ra được một số kết luận:
+ Nồng độ dung dịch KH2PO4:
Khi giảm nồng độ đệm từ 0,01 M tới 0,005 M thì quá trình tách giữa pic của Xylometazolin.HCl và tạp càng tốt. Tại nồng độ 0,06 M hai pic bắt đầu tách hẳn khỏi nhau.
Nếu nồng độ đệm thấp hơn 0.005M thì không đủ đệm cho quá trình sắc ký.
^ C h ọ n nồng độ dung dịch đệm: 0,005M.
+ pH của dung dịch đệm chỉ ảnh hưởng đến Xylometazolin.HCl;
Khi giảm pH từ 3,50 đến 3,00 thì thời gian lưu (tß) của pic Xylometazolin.HCl cũng giảm và hệ sô' bất đối của pic tốt hơn (giảm từ 2,95 đến 1,8 6).
Mặc dù vậy. pH cũng không được giảm thấp quá vì như vậy có thê làm giảm tuổi thọ của cột.
^ C h ọ n pH = 3,00.
+ Thay đổi tỷ lệ pha động thì chỉ thay đổi thời gian lun (ĩr) và sự thay đổi này là tỷ lệ giữa thành phần: pic của Xylometazolin.HCl và pic của tạp. Chúng tôi đã lựa chọn tỷ lệ sao cho thời gian phân tích là tối ưu (thời gian phân tích khoảng 6 - 7 phút).
->Chọn tỷ lệ: đệm phosphate - acetonitril = 35 - 65.
*1* Từ đó chúng tôi đề xuất quy trình định lượng Xylometazolin.HCl trong thuốc nhỏ mùi Nostravin:
- Điều kiện sắc ký:
1. Cột Nucleosil C18 (250 X 4 mm, 5 |.im)
2. Pha động: đệm phosphate - acetonitril = 35 - 65 (đệm phosphat; dung dịch KH.PO40M05M được điều chinh về pH = 3,00 bằng dung dịch
H3PO4) 3. Detector UV; 225 nm 4. Thể tích tiêm; 20 |il. 5. Tốc độ dòng : Iml/phiìt 6. Nhiệt độ phòng thí nghiệm. -Cách pha các mẫu:
+ Mẫu thử: Dùng pipet hút chính xác 10,0 ml dung dịch thuốc nhỏ mũi cho vào bình định mức 50,0 ml; thêm nước vừa đủ tới vạch, lắc đều. Dùng pipet hút chính xác 10,0 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 2 0 ,0 ml; thêm acetonitril vừa đủ tới vạch, lấc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 ị^m. Ta có nồng độ của mẫu đem đo: c=0,05m g/m l.
+ Mẫu chuẩn: Cân chính xác O.IOOO g Xylometazolin.HCl chuẩn cho vào bình định mức 100,0 ml; thêm nước vào hoà tan và bổ sung nước vừa đủ tới vạch, lắc đều. Dùng pipet hút chính xác 10,0 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 100,0 ml; thêm nước vừa đủ tới vạch, lắc đều. Dùng pipet hút chính xác 10,0 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 2 0 ,0 ml; thêm acetonitril vừa đủ tới vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0.45 |.im. Nồng độ cúa mẫu đem đo: Q -0,05m g/m l.
+ Mẫu trắng: acetonitril - nước = 50/50. - Cách tính kết quả;
Dựa vào diện tích pic thu được từ sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu chuẩn để tính hàm lượng Xylometazolin.HCl trong chế phẩm như sau;
ỵ _ ọ / - S l . m c . p . / A O O
Sc
Trong đó: x % : hàm lượng Xylometazolin.HCl trong chế phẩm St, Sc; diện tích pic của mẫu thử và mẫu chuẩn,
mc: khối lượng cân chính xác của Xylometazolin.HCl chuẩn, p: hàm lượng của Xylometazolin.HCl chuấn
f: hệ số pha loãng (f= 1/2 0 0).
3.1.3. Thử tính thích hợp của hệ thống
Để tiến hành sắc ký định lượng, chúng tôi tiến hành xác định tính thích hợp của hệ thống.
- Thực hiện trên mẫu thử và mẫu chuẩn có nồng độ 0,05mg/ml Xylometazolin.HCl.
Thể tích tiêm: 20|il. - Tiến hành sắc ký
Bảng 1: Kết quả xác định tính thích hợp của hệ thống S T T H ệ số bất đôi (AF) Độ phán giải (Rs) Diện tích pic (m AU. min) 1 1,92 2,78 42,5017 2 1,90 2,79 42,6487 3 1,86 2,77 42,4893 4 1,83 2,77 42,4985 5 1,85 2,77 42,5567 Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) RSD=0,1570 % 160 N G O C #1 Ịrn o d iíie d by A d m in istra to r] T in h Ih ic h ho p U V j/ 'IS _ 1 .rriA U 3 -5 , 4 3 7 X flo m e t a z o lin e , H C I V V V L 2 2 5 nm 2 - 3 . 8 2 7 T h io m e r s a l ị \ \ 1 - 2.0 0 0a í '! 1 ì 1 Ịị ị Ị 1 1 j ' w J \ \ rnin 1 1 ì 1 ! ' 1 ĩ i ! Ễ 1 i M M 1 T : T ì i ị n : 0,0 2'0 4 0 6 , 0 8 , 0 10 D 120 14 0 160 18 0 Hình I : sắc ký đồ thử tính thích ìu/p của hệ thổng
Kết quả trình bày ở bảng 1 cho thấy:
- Độ lệch chuẩn tương đối của các kết quả thu được: RSD = 0,1570 %
( « 2%).
- Độ phân giải giữa pic của Xylometazolin.HCl và tạp là: Rs = 2.78 (>1,5)
- Các giá trị AF đều nằm trong khoảng: 0,9 - 2,0.
Như vậy, hệ thống mà chúng tôi sử dụng đảm bảo tính thích hợp để định lượng Xylometazolin.HCl trong thuốc nhỏ mũi Nostravin.
3.2. Đánh giá phưong pháp
Chúng tôi tiến hành đánh giá phương pháp định lượng Xylometazolin.HCl bằng HPLC mới xây dựng với các chi tiêu:
- Đánh giá tính chính xác - Đánh giá tính tuyến tính - Đánh giá tính đặc hiệu - Đánh giá tính đúng
3.2.1. Tính chính xác
- Độ chính xác của phương pháp được đánh giá bằng độ lệch chuẩn tương đối của 5 phép thử song song.
- Pha 5 mẫu thử có nồng độ Q = 0,05 mg/ml - Tiến hành sắc ký theo quy trình.
- Kết quả được trình bày trong bảng 2:
Bảng 2: Kết quả xác định tính chính xác S T T 1 2 3 4 5 D iện tích pic (m AU .m in) 42,4898 42,7338 42,4417 42,6972 42,5941 Giá trị trung bình: X = 42,5913 Độ lệch chuấn: SD = 0,1267
Độ lệch chuẩn tương đối; RSD = 0,2975%
Kết luận: Vì RSD < 2% nên phương pháp trên là chính xác.
3.2.2. Tính tuyến tính
- Chúng tôi tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ với diện tích pic của Xylometazolin.HCl trên chất chuẩn Xylometazolin.HCl.
- Pha 5 mẫu chuẩn có nồng độ các dung dịch lần lượt: Q = 0,025; 0,040; 0,050; 0,060; 0,075 mg/ml.
- Tiến hành sắc ký.
- Các kết quả được trình bày trong báng 3 và hình 2:
Bảng 3: Kết quả xác định tính tuyến tính S T T N ồ n g độ (mg/ml) Diện tích pic (m A ư .m in ) 1 0,025 20,2428 2 0,040 32,4374 3 0,050 40,6601 4 0,060 48,9809 5 0,075 60,9094 70 -1 •Ì 60 3 I i 50 1 40 Ì •’O f 20 Ì 10 ® 0 T ĩ n h t u y e n t i n h >' = X - 0 . 1 1 5 9 r = 0 , 9 9 9 9 -« 4jJ)J0 9 4 ề»40.&&ia-
JLiLA2i!â, Tinh tuy en tmh
-^-^-g4S8-
o o ; 0,04 0,06
HoníỊi <!«> «iiỊyi iìil^
0.08
Hình 2: Đ ồ thị biếu diễn phương ninh hồi quy tuyến tính giữa nồng độ I'à
diện tích pic.
- Phương trình:
y = 815,24 X -0,1159
Với hệ số tương quan tương ứng r = 0,9999 (r>0,99)
Y_intercep= - 0,1159; Độ lệch chuẩn của y_intercep; Sb = 0,1808
Với độ tin cậy 95 % ta có khoảng tin cậy của y_intercep: - 0,1159 ± 0,5019 hay - 0,6178 < y_intercep < 0,3860 ->chứa gốc toạ độ.
Tất cả các giá trị đo được nằm trên đưòfng hồi quy hoặc phân bố đồng đều cả hai phía của đường hồi quy.
Kết luận: Phương pháp là tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sát: 0,025
- 0,075 mg/ml hay tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 50% - 150% nồng độ
làm việc.
3.2.3. Tính đặc hiệu
- Mục đích: chứng minh sự có mặt của tạp chất hoặc tá dược không ảnh hưởng đến cách tiến hành định lượng.
- Đây là chỉ tiêu rất quan trọng trong phương pháp định lượng Xylometazolin.HCl trong thuốc nhỏ mũi Nostravin vì trong thuốc nhỏ mũi Nostravin ngoài hoạt chất Xylometazolin.HCl còn có thêm chất bảo quản Thiomersal. Chất này ảnh hưởng rất lófn đến kết quả định lượng. Do đó, trong đề tài này chúng tôi tiến hành nghiên cún xây dựng một phương pháp định lượng để có thể loại bỏ được sự ảnh hưởng của Thiomersal tới kết quả định lượng.
- Để khảo sát tính đặc hiệu của phương pháp chúng tôi tiến hành như sau: + Pha các mẫu:
Mẫu trắng: hỗn hợp gồm acetonitril - nước = 50 - 50.
Mầu Thiomersaì : Cân chính xác 45,0 mg Thiomersal cho vào bình 100,0 ml; Thêm nước vừa đủ đến vạch. Dùng pipet hút chính xác 10,0 ml dung dịch trên cho vào bình 20,0 ml. Thêm acetolnitril vừa đủ tới
vạch, lắc đều.
--> CThiome,s.i = 0,0225 m g/m l.
Mầu chuẩn: pha như các phần Irên để được nồng độ: Q = 0,05 mg/ml.
Mẫu hỗn họp: chứa Xylometazolin.HCl và Thiomersal có nồng độ lần lượt là 0,05 mg/ml và 0,0225 mg/ml.
+ Tiến hành sắc ký.
+ Các kết quả được trình bày trong hình 3, hình 4, hình 5, hình 6:
'NGOC#1 [modified by Administrator] Xylometazolin.HCl UV_VIS_1
'l40 __________________ chuan 0,05________________________ -ia mAU 1 - 5.440 r-'T WVL:225 nm min 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.55
Hình 3: sắc ký đồ của mẫu chuẩn
NGOC #1 [modified by Administrator] Mau trang
1.0ữ O.OỮ -1.0 0. UV_VIS_1 mAU WVL:225 nnr ì 1 - m 1 1 1 i i 1 1 1 1 1 1 1 1 i 1 1 i 1 ! 1 1 i 1 1 1 4.50 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80 6.00 6.20 6.40 Hình 4: sắc ký đồ của mầu trắng 32
NGOC #1 [modified by Administrator] Mau Thiomersal UV_VIS_1 50.Ỡ mAU -5.Ơ WVL;225 nm 1 - 3.847 Thiomersal min ỉ 1 1 1 1 1 1 1 1 7 r n 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0
Hình 5: sắc kỷ đồ của mầu Thiomersaì
160
N G O C #1 Ịmoditìed by Administrator] Mau hon hũp
U V J/ IS _ 1 -20 .tììAU 3 ~ 5,439 Xylornetazoline HCl 1 VVVL:225 nm 2 - 3,835 Thiornersai 1 1 Ị ỉị I ị ị 1 ỉ Ị « ị ỉ miti r r 1 Ĩ T ĩ ĩ Ị P .... ... .... p .. 1..-J.... 0.0 2,ũ 4 0 6,0 8 ũ ỈUU 14.0 16,0 Hình 6: sắc ký đồ của màu hỗn họp Từ các sắc ký đồ ta thấy:
- Sắc ký đồ hình 3: Xylometazolin.HCl được rửa giải tại khoảng thời gian lưu: Ir= 5,4 phút.
- Sắc ký đổ hình 4: không có pic lạ nào tại thời gian lim của Xylometazolin.HCl.
- Sắc ký đồ hình 5: cũng không có pic lạ nào tại thời gian lull của Xylometazolin.HCl và chỉ có một pic của Thiomersal tại khoảng thời gian kai ír = 3,8 phút.
- Sắc ký đổ hình 6: pic của Xylometazolin.HCl tách rời hẳn pic của Thiomersal vód độ phân giải; Rs = 2.77-> hai pic coi như tách nhau hoàn toàn.
> Kết luận: Vậy phương pháp định lượng Xylometazolin.HCl trong Nostravin được xây dựng có tính đặc hiệu cao.
3,2.4. Tính đúng
<♦ Nguyên tắc: Áp dụng một phương pháp phân tích để định lượng một hỗn hợp tự tạo gồm tất cả các Ihành phần có trong công thức pha chế thuốc. Hoạt chất được thêm vào với số lượng đã biết trong toàn bộ
khoảng nồng độ khảo sát.
❖ Tiến hành:
- Pha các mẫu tự tạo:
+ Pha 5 mẫu tự tạo trong bình 100.0 ml như bảng 4:
Bảng 4: Lượng cân các thành phần trong mẫu tự tạo