Xây dựng phương pháp định lượng felodipin trong viên nén GPKD bằng HPLC

Ứng dụng phương pháp phân tích định tính, định lượng felodipin trong viên nén felodipin giải phóng có kiểm soát .... Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghiệp dược phẩm trong và ngo

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUY ỄN THỊ HUYỀN

XÂY D ỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG FELODIPIN TRONG VIÊN

NÉN GPKD B ẰNG HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ N ỘI - 2013

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUY ỄN THỊ HUYỀN

XÂY D ỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG FELODIPIN TRONG VIÊN

L ỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian thực hiện đề tài, tôi may mắn nhận được yêu thương,

sự giúp đỡ tận tình của gia đình, thầy cô và bè bạn Vì vậy, những trang đầu

của khóa luận này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới những người đã nhiệt tình

dạy dỗ, giúp đỡ tôi trong thời gian qua

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị

Ki ều Anh, người trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tôi những kỹ năng cần thiết,

cách tư duy và hỗ trợ giúp tôi giải quyết những khó khăn khi thực hiện khóa

luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, anh chị ở Phòng phân tích, kiểm

nghiệm và tương đương sinh học - Viện công nghệ Dược phẩm quốc gia đã

giúp đỡ tận tình, tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành khóa luận

Đồng thời, tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, các thầy cô giáo, các

cán bộ trường Đại học Dược Hà Nội đã giảng dạy, chỉ bảo, dìu dắt tôi trong

suốt năm năm học tập tại trường

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, bạn bè, những người thân yêu

đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thời gian tôi

thực hiện đề tài này

Mặc dù đã có nhiều cố gắng nhưng do còn nhiều hạn chế về mặt lý luận

và thực tiễn nên khóa luận có thể còn nhiều thiếu sót Tôi rất mong được sự

góp ý của thầy cô giáo và các bạn để khóa luận này được hoàn thiện hơn

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2013 Sinh viên

Nguyễn Thị Huyền

M ỤC LỤC DANH M ỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH M ỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Đại cương về felodipin 3

1.1.1 Công thức và tính chất lý hóa 3

1.1.2 Dược động học 4

1.1.3 Tác dụng dược lý 4

1.1.4 Chỉ định 5

1.1.5 Chống chỉ định 5

1.1.6 Thận trọng 5

1.1.7 Tác dụng không mong muốn (ADR) 6

1.1.8 Liều lượng và cách dùng 6

1.1.9 Quá liều và xử trí 7

1.1.10 Tương tác thuốc 7

1.1.11 Một số chế phẩm felodipin trên thị trường 8

1.2 Một số nghiên cứu định lượng felodipin 9

1.3 T ổng quan về HPLC 11

1.3.1 Khái niệm và các thông số đặc trưng cho quá trình sắc ký 11 1.3.2 Cấu tạo máy HPLC 14

1.3.3 Ứng dụng kỹ thuật của HPLC 14

CH ƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng và phương tiện nghiên cứu 16

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu 16

2.2 N ội dung nghiên cứu 17

2.3 Ph ương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 18

2.3.2 Thẩm định phương pháp 18

2.3.3 Ứng dụng phương pháp phân tích định tính, định lượng felodipin trong viên nén felodipin giải phóng có kiểm soát 20

2.3.4 Phương pháp xử lý kết quả 20

PH ẦN 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21

3.1 Xây dựng điều kiện phân tích Felodipin bằng HPLC 21

3.1.1 Lựa chọn cột sắc ký 21

3.1.2 Lựa chọn bước sóng thích hợp 22

3.1.3 Khảo sát lựa chọn tốc độ dòng và pha động 23

3.1.4 Lựa chọn thể tích tiêm mẫu 25

3.2 Chu ẩn bị mẫu 26

3.2.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 26

3.2.2 Chuẩn bị dung dịch thử: 27

3.2.3 Chuẩn bị mẫu trắng: 27

3.3 Th ẩm định phương pháp HPLC định lượng Felodipin 27

3.3.1 Độ thích hợp của hệ thống 27

3.3.2 Tính đặc hiệu 28

3.3.3 Độ tuyến tính 29

3.3.4 Độ chính xác 31

3.3.5 Độ đúng: 32

3.4 Ứng dụng định tính và định lượng Felodipin trong chế phẩm 33

3.5 BÀN LU ẬN 36

K ẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 38 TÀI LI ỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ATC (Anatomical Therapeutic Chemical): Hệ thống phân loại thuốc

HPLC (High Performance Liquid Chromatography): Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HIV (Human Immuno-deficiency Virus): Virus gây suy giảm miễn dịch ở người

MS (Mass spectrometry): Khối phổ

UV- VIS (Ultraviolet - Visible): Tử ngoại - khả kiến

PA (Pure for analysis): Độ tinh khiết phân tích

t1/2: Thời gian bán thải

USP (The United States Pharmacopeia): Dược điển Mỹ

v/v: Thể tích/thể tích

v/v/v: Thể tích/thể tích/thể tích

DANH M ỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các chế phẩm felodipin trên thị trường 8

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát lựa chọn cột 21

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát tỷ lệ pha động 24

Bảng 3.3 Cách pha các dung dịch chuẩn 27

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ tuyến tính 30

Bảng 3.6 Kết quả xác định độ chính xác 31

Bảng 3.7 Kết quả đánh giá độ đúng 33

Bảng 3.8 Kết quả định lượng Felodipin trong viên giải phóng có kiểm soát 34

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Công thức cấu tạo felodipin 3

Hình 1.3 Sơ đồ hệ thống HPLC 14

Hình 3.1 Sắc ký đồ của Felodipin phân tích bằng cột Zorbax SB 21

Hình 3.2 Sắc ký đồ của Felodipin phân tích bằng cột Eclipase XDB 22

Hình 3.3 Phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch Felodipin chuẩn 23

Hình 3.4 Sắc ký đồ của hệ pha động thứ 1 24

Hình 3.5 Sắc ký đồ của hệ pha động thứ 2 24

Hình 3.6 Sắc ký đồ của hệ pha động thứ 3 25

Hình 3.7 Sắc ký đồ của Felodipin (khảo sát điều kiện sắc ký) 26

Hình 3.8 Sắc ký đồ của mẫu trắng 29

Hình 3.9 Sắc ký đồ của mẫu chuẩn nồng độ 20µg/ml 29

Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ 30

và diện tích pic 30

Hình 3.11 Sắc ký đồ của mẫu chuẩn 35

Hình 3.12 Sắc ký đồ của mẫu định lượng 35

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh tim mạch là bệnh khá phổ biến, là gánh nặng sức khỏe chính yếu,

để lại nhiều tàn phế và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn thế giới Trong đó, tăng huyết áp (hay còn gọi là cao huyết áp) là bệnh rất tiêu

biểu và thường gặp nhất Nếu không được chẩn đoán và điều trị có thể gây ra các biến chứng và di chứng nặng nề như tai biến mạch não, suy thận… ảnh hưởng xấu đến chất lượng cuộc sống người bệnh, trở thành gánh nặng cho gia đình và cho xã hội Do vậy, thuốc điều trị bệnh tim mạch cũng như tăng huyết

áp ngày càng chiếm tỷ trọng lớn, có vai trò quan trọng trong công tác chăm sóc sức khỏe cộng đồng

Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghiệp dược phẩm trong và ngoài nước trong nhiều năm gần đây, dạng bào chế viên tác dụng kéo dài đã

ra đời để phù hợp với đặc thù điều trị các bệnh tim mạch là phải sử dụng thường xuyên, lâu dài mà giảm được số lần dùng thuốc, giảm tác dụng bất lợi nhiều nhất như: viên nén giải phóng chậm, viên nén bao film giải phóng chậm, viên nén giải phóng kéo dài, viên nén giải phóng có kiểm soát… Dược điển của Anh, Mỹ chỉ có một số ít chuyên luận về viên tác dụng kéo dài, trong khi đó Dược điển Việt Nam chưa có một chuyên luận riêng về dạng bào chế này Nhiều dược chất được dùng trong các dạng bào chế này như: diltiazem, nicardipin, nifedipin, verapamil, …Trong đó, felodipin là một trong những thuốc đang được sử dụng khá phổ biến ở Việt Nam trong mấy năm gần đây

Chế phẩm viên nén felodipin 5 mg đang được nghiên cứu bào chế Do đó, để đánh giá đúng và kịp thời chất lượng chế phẩm nghiên cứu là yêu cầu bắt

buộc Để góp phần phát triển một chế phẩm thuốc mới chúng tôi tiến hành

thực hiện đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng felodipin trong viên nén

giải phóng kéo dài bằng HPLC” với các mục tiêu sau:

 Xây d ựng quy trình định tính và định lượng Felodipin trong viên nén b ằng HPLC

 Th ẩm định quy trình phân tích đã xây dựng nhằm định tính và định lượng Felodipin trong viên nén Felodipin 5 mg giải phóng kéo dài

b ằng phương pháp HPLC

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về felodipin

1.1.1 Công thức và tính chất lý hóa

Công thức cấu tạo:

Hình 1.1 Công th ức cấu tạo Felodipin

Công thức phân tử: C18H19Cl2NO4

Khối lượng phân tử: 384,3

Tên khoa h ọc: Ethyl methyl dimethylpyridine-3,5-dicarboxylat [10], [17]

4-(2,3-dichlorophenyl)-1,4-dihydro-2,6-Mã ATC: C08C A02 [2]

Phân lo ại: Felodipin là thuốc chẹn kênh calci có tính chọn lọc cao trên mạch,

dùng trong điều trị tăng huyết áp và đau thắt ngực ổn định [2]

1.1.2 Dược động học

Hấp thu: Felodipin hấp thu gần như hoàn toàn qua đường tiêu hoá sau khi

uống nhưng chuyển hoá lần đầu ở gan và có sinh khả dụng tuyệt đối (SKD) khoảng 15% Nồng độ đỉnh trong huyết tương đạt được sau 3-5 giờ

Thức ăn ảnh hưởng đến tốc độ hấp thu, không ảnh hưởng đến mức độ hấp thu

Phân b ố: Liên kết với protein huyết tương xấp xỉ 99%, chủ yếu là albumin

Thể tích phân bố ở trạng thái ổn định là 10 L/kg

Chuy ển hóa: Felodipin chuyển hoá mạnh qua gan Các chất chuyển hóa được

xác định không có hoạt tính gây giãn mạch

Th ải trừ: Bài xuất chủ yếu (khoảng 70% liều dùng) qua nước tiểu dưới dạng

các chất chuyển hoá không hoạt tính, phần còn lại chưa chuyển hoá được đào thải qua phân, ít hơn 0,5% liều dùng được bài tiết dưới dạng không đổi trong nước tiểu Thời gian bán thải (t1/2) của felodipin là 11-16 giờ Felodipin có độ thanh thải cao, trung bình 1200 mL/phút Độ thanh thải giảm ở người cao tuổi

và bệnh nhân suy giảm chức năng gan Không có nguy cơ tích lũy thuốc khi điều trị kéo dài [2], [16]

1.1.3 Tác dụng dược lý

Tác dụng hạ áp động mạch: Felodipin là thuốc chẹn kênh calci chậm có tính

chất chọn lọc thuộc nhóm dihydropyridin Felodipin làm giảm trương lực động mạch (nhất là trên tiểu động mạch), dẫn đến tác dụng giãn mạch gây hạ huyết áp Do tính chất chọn lọc cao đối với cơ trơn thành tiểu động mạch nên felodipin ở liều điều trị không gây tác dụng trực tiếp đến tim, đặc biệt đến tính

co bóp cơ tim hoặc tính dẫn truyền Felodipin không gây hạ huyết áp thế đứng

vì thuốc không ảnh hưởng đến cơ trơn tĩnh mạch hoặc cơ chế kiểm soát hệ giao cảm Felodipin có tác dụng thải natri và lợi tiểu nhẹ do giảm tái hấp thu

natri và nước qua ống thận, do đó không gây ứ dịch và muối ở bệnh nhân khi điều trị lâu dài

Tác dụng chống đau thắt ngực: Felodipin cải thiện sự cân bằng trong cung

và cầu oxygen của cơ tim Lưu lượng động mạch vành cũng như lượng cung cấp oxygen cho cơ tim tăng lên nhờ giãn mạch vành Felodipin giảm huyết áp toàn thân nên làm giảm hậu gánh thất trái, do đó giảm nhu cầu oxygen của cơ tim Felodipin làm tăng khả năng gắng sức và giảm số cơn đau thắt ngực ở người bệnh đau thắt ngực ổn định

Cũng như các thuốc chẹn calci khác, felodipin không ảnh hưởng đến chuyển hoá glucid và lipid và không làm thay đổi tỷ lệ thành phần giữa các lipid huyết tương, nên có thể dùng cho người bị đái tháo đường hoặc bệnh gút [2], [3]

1.1.4 Chỉ định

Điều trị tăng huyết áp

Điều trị dự phòng cơn đau thắt ngực ổn định [2]

1.1.5 Chống chỉ định

Quá mẫn với dihydropyridin

Nhồi máu cơ tim cấp

Suy tim mất bù hoặc chưa kiểm soát được

Với người suy gan nặng: liều tối đa là 5 mg/ngày

Cần phải ngừng felodipin nếu sau khi bắt đầu điều trị thấy xuất hiện cơn đau thắt ngực hoặc bệnh đau thắt ngực nặng lên hoặc có sốc tim

Giống các chất giãn tiểu động mạch khác, felodipin trong một số hiếm trường hợp có thể gây tình trạng tụt áp đáng kể, mà tình trạng này ở người nhạy cảm

có thể gây thiếu máu cục bộ cơ tim

Không uống thuốc với nước ép bưởi [2]

1.1.7 Tác dụng không mong muốn (ADR)

Tác dụng không mong muốn thường gặp nhất liên quan đến tác dụng giãn mạch của thuốc: nhức đầu, mặt đỏ bừng hoặc cảm giác nóng bừng, phù ngoại biên Hầu hết các phản ứng này tùy thuộc liều dùng, xảy ra lúc bắt đầu điều trị hoặc sau khi tăng liều, thường thoáng qua và giảm dần theo thời gian

Giống các dẫn chất dihydropyridin khác, hiện tượng phù mắt cá chân liên quan đến tác dụng giãn mạch có thể gặp khi dùng felodipin

Ở người bệnh mạch vành, felodipin có thể gây đau ngực khoảng 15-20 phút sau khi uống thuốc, khi đó phải ngừng thuốc ngay tức thì [2], [16]

1.1.8 Liều lượng và cách dùng

Điều trị tăng huyết áp: Liều dùng cần điều chỉnh theo đáp ứng của người

bệnh và sự dung nạp thuốc sau khoảng 2 tuần sử dụng Liều khởi đầu ở người lớn là 5 mg/lần/ngày Tùy theo đáp ứng của người bệnh, có thể giảm liều tới 2,5 mg/ngày hoặc tăng liều lên 10 mg/ngày Nếu liều 10 mg/ngày không đủ

để kiểm soát huyết áp, có thể phối hợp với một thuốc chống tăng huyết áp khác như thuốc chẹn bêta Đối với bệnh nhân lớn tuổi nên cân nhắc dùng liều khởi đầu 2,5 mg/ngày

Liều duy trì thông thường là 2,5 - 10 mg/ngày, uống một lần vào buổi sáng

Dự phòng cơn đau thắt ngực ổn định: Liều dùng là 10 mg/ngày uống một

lần Nên bắt đầu với liều 5 mg/lần/ngày trong tuần đầu, sau đó tăng liều lên

10 mg/ngày

Liều dùng cần được điều chỉnh ở người bệnh cao tuổi hoặc suy gan nặng Liều khởi đầu thông thường là 2,5 mg/ngày, liều tối đa 5 mg/ngày

Cách dùng: Dùng đường uống, thuốc nên được uống cùng bữa ăn nhẹ (không

có nhiều chất béo hay carbohydrat) Với các dạng bào chế giải phóng kéo dài, chỉ được nuốt nguyên viên cùng với nước, không nhai vỡ, không chia nhỏ viên thuốc [2]

1.1.9 Quá liều và xử trí

Triệu chứng: Gây giãn mạch ngoại vi quá mức kèm theo tụt huyết áp và đôi

khi chậm nhịp tim

Xử trí: Khi xuất hiện tụt huyết áp trầm trọng, cần điều trị triệu chứng Trường

hợp chậm nhịp tim và tắc nghẽn dẫn truyền: Atropin 0,5-1 mg tiêm tĩnh mạch

ở người lớn (20-50 mcg/kg ở trẻ em), truyền dịch (glucose, muối sinh lý hoặc dextran) [2]

Do đó, cần thiết phải theo dõi biểu hiện lâm sàng và điều chỉnh liều felodipin trong và sau khi kết hợp với các thuốc trên [2], [3]

1.1.11 Một số chế phẩm felodipin trên thị trường

B ảng 1.1 Các chế phẩm felodipin trên thị trường [3], [8]

Chế phẩm Hàm lượng Dạng bào chế Hãng

sản xuất

Nước sản xuất

Efelo-5 5mg Viên nén giải

phóng chậm Aegis Ltd

Cộng hòa Sip

Felodil ER 5mg

Viên nén bao film giải phóng chậm

Korea United Pharm Inc Hàn Quốc

Viên bao film giải phóng chậm Stada-VN J.V

Việt Nam (sx nhượng quyền)

Felutam CR 5mg

Viên nén giải phóng có kiểm soát

Vellpharm

VN

Việt Nam (sx nhượng quyền)

Flodicar MR 5mg

Viên nén bao film giải phóng kéo dài

Pymepharco Việt Nam

Plendil 2,5mg, 5mg,

10mg

Viên nén giải phóng kéo dài

AstraZeneca

Plendil Plus

Felodipin 5mg Metoprolol 50mg

Viên nén giải phóng kéo dài

AstraZeneca

1.2 Một số nghiên cứu định lượng felodipin

• Fusun Gedil, Osman Ustun, Okan Atay nghiên cứu định lượng Felodipin trong chế phẩm (cụ thể thử trên viên Plendil® của hãng AstraZeneca - Thụy Điển) bằng phương pháp quang phổ UV-VIS và phương pháp HPLC Phương pháp quang phổ hấp thụ UV-VIS được tiến hành đo quang ở hai bước sóng

234 nm và 360 nm, xây dựng khoảng nồng độ tuyến tính của felodipin tương ứng lần lượt là 4-24 µg/ml và 8-60 µg/ml Phương pháp được thẩm định về độ đúng cho lượng tìm lại lần lượt là 100,2 ± 0,71%, 99,6 ± 0,98% và RSD% tương ứng là 0,73% và 1,01% bằng cách thêm chuẩn nằm trong khoảng tuyến tính [12]

• Định lượng felodipin trong môi trường khan là hỗn hợp chứa: propanol và acid perchloric, dùng dung dịch Cerium sulphat 0,1 M làm dung

2-methyl-2-dịch chuẩn độ, chỉ thị phát hiện là ferroin R (1ml dung dịch Cerium sulphat 0,1 M tương đương 19,221 mg Felodipin) [10]

• Martin Ahnoff và cộng sự (2004) đã xác định felodipin trong huyết tương người bằng sắc ký khí mao quản sử dụng detector bắt điện tử - ECD Felodipin trong huyết tương được chiết với toluen mà không cần làm sạch,

sắc ký trên cột mao quản silica phủ CPtmSil8 hoặc CPtmSil5 (25m×0,32mm)

Kết quả thu được đường chuẩn tuyến tính trong khoảng nồng độ 2 – 10 nmol/l, độ lặp lại của phương pháp với RSD % là 4 - 8% (2 nmol/l), 2 - 4% (40 nmol/l) Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp đảm bảo độ chính xác,

độ ổn định và đặc hiệu cao, có thể xác định felodipin trong mẫu huyết tương

có nồng độ 1 nmol/l trở lên mà không cần làm sạch trong quá trình chiết đồng

thời quá trình oxy hóa felodipin trong bộ phận tiêm và cột được giảm thiểu [9]

• Phương pháp dùng nhiều nhất định lượng Felodipin là bằng HPLC Một số nghiên cứu:

− Năm 2012, P Santhosh Kumar và cộng sự tiến hành phân tích định tính

và phân tích định lượng Felodipin trong viên nén bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detector mảng diod Sắc ký trên cột Waters Symmetry C18 (4,5 ×

250 mm, 5µm), pha động là acetonitril: nước (80:20 v/v), bước sóng phát hiện

234 nm và thời gian phân tích là 10 phút [13]

− Fusun Gedil (Ustun) và cộng sự tiến hành phân tích định lượng Felodipin trong chế phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng chất chuẩn nội dilsulfiram, sắc ký ở nhiệt độ phòng trên cột Luna C18 (4,5 × 250 mm, 5µm),

pha động là methanol: dung dịch đệm phosphat 0,055 M pH=3,0±0,1 (83:17 v/v), detector UV phát hiện ở bước sóng 275 nm, thể tích tiêm mẫu 20 µl Kết

quả cho thấy thời gian lưu của Felodipin là 12,52 phút và của chất chuẩn nội

là 9,64 phút [12]

− Margareth Gabrielsson và cộng sự tiến hành phân tích định lượng 4 chất chuyển hóa axit cacboxylic của felodipin trong huyết tương bằng HPLC Sau khi lấy huyết tương chứa 4 chất chuyển hóa,thêm chất chuẩn nội rồi thực hiện chiết lỏng - lỏng và pha rắn, detector UV phát hiện ở 220 nm, cột sắc ký LiChrospher 60 RP (4 x 250 mm, 5 µm) và cột bảo vệ: cyano Brownlee guard (3,2 x 15 mm, 7 µm), pha động là methanol: dung dịch đệm phosphat 0,0 5M pH 3,5 (45:80 v/v), tốc độ dòng: 1,15ml/phút, giới hạn phát hiện của các chất chuyển hóa là 20 nmol/l [11]

− Luis H Miglioranca và cộng sự (2005) đã định tính và định lượng felodipin trong huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ kép (LC-MS/MS) sử dụng nimodipin làm chuẩn nội Felodipin trong huyết tương (0,5 ml) được chiết theo quy trình chiết lỏng -

lỏng bằng hỗn hợp dung môi diethyl ether/hexan (80:20 v/v), mà không cần làm sạch Sắc ký ở nhiệt độ phòng trên cột C18 (4,6 x 100 mm, 3µm), pha động acetonitril : nước (80:20 v/v) chứa 10 mM acid formic, tốc độ dòng

0,8mL/phút, thể tích tiêm mẫu 40 µl, thời gian phân tích 5 phút Felodipin và chuẩn nội được phát hiện bằng detector MS/MS theo kỹ thuật ghi phổ MRM (Multiple Reaction Monitoring), chế độ ion hóa bằng phun điện tử ion dương nghiên cứu cho thấy phương pháp đảm bảo độ đúng và chính xác để định

lượng felodipin trong huyết tương người [14]

− Định lượng felodipin trong chế phẩm viên nén felodipin giải phóng kéo dài bằng HPLC detector UV phát hiện ở bước sóng 362 nm, pha động là Acetonitril: dung dịch đệm NaH2PO4 pH 3 ± 0,05: Methanol (2:2:1 v/v/v), cột C18 (4,6 ×150 mm, 5 µm), tốc độ dòng là 1 ml/phút [17]

một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp

suất cao Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại

cỡ là tùy thuộc vào pha tĩnh sử dụng Khi phân tích sắc ký các chất được hòa tan trong dung môi thích hợp và đa số sự phân tách đều xảy ra ở nhiệt độ thường nên các thuốc không bền với nhiệt không bị phân hủy khi sắc ký Sắc

ký được hoàn thành trong một thời gian rất ngắn (khoảng 30 phút) [4], [5], [7]

b Các thông số đặc trưng cho quá trình sắc ký [4], [5], [7]

• Thời gian lưu tR: là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi

chất tan được rửa giải ra khỏi cột ở điểm có nồng độ cực đại Trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn, thời gian lưu của mỗi chất là hằng định Vì vậy, có

thể dung thời gian lưu để phát hiện định tính các chất

Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:

- Bản chất, thành phần, tốc độ pha động

- Bản chất sắc ký của pha tĩnh, kích thước, độ xốp, cấu trúc xốp…

- Cấu tạo và bản chất của phân tử chất tan, các nhóm thế

- Trong một số trường hợp còn phụ thuộc pH pha động, nồng độ chất tạo

phức, nếu các yếu tố này có ảnh hưởng đến các cân bằng động trong quá trình sắc ký

• Hệ số phân bố K: là đại lượng đặc trưng cho sự phân bố của chất tan

giữa pha động và pha tĩnh

𝐾𝐾 = CCs

MTrong đó: Cs: là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh

CM: là nồng độ mol của chất tan trong pha động

K càng lớn sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm Nếu các chất trong hỗn hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều thì khả năng tách diễn ra càng dễ dàng hơn

K: hệ số phân bố Qm: lượng chất trong pha động

VS: thể tích pha tĩnh tR : thời gian lưu

Vm: thể tích pha động t’R: thời gian lưu hiệu chỉnh

QS: lượng chất trong pha tĩnh to: thời gian chết

chọn cột, pha động… sao cho k’ nằm trong khoảng tối ưu: 1≤ k’ ≤8

• Hệ số đối xứng của pic F

F=𝑊𝑊 2𝑎𝑎Trong đó:

W: chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic

a: Khoảng cách từ đường vuông góc hạ đỉnh đến mép đường cong phía trước tai vị trí 1/20 chiều cao pic

• Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N và chiều cao của đĩa H

Trong đó:

W: chiều rộng đo đáy pic

W1/2: chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic

Nếu gọi L là chiều dài cột sắc ký thì chiều cao của đĩa lý thuyết được tính

tRB, tRA: thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (B và A)

WB, WA: độ rộng pic ở các đáy pic

W1/2B, W1/2A: độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic

Các giá trị tRB, tRA, WB, WA, W1/2B, W1/2A tính theo cùng một đơn vị

Yêu cầu RS>1, giá trị tối ưu RS=1,5

1.3.2 Cấu tạo máy HPLC

4- Bộ phận tiêm mẫu 8- In dữ liệu

1.3.3 Ứng dụng kỹ thuật của HPLC

Các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ

của chất phân tích tỷ lệ với diện tích pic hay chiều cao pic của nó

Có 4 phương pháp định lượng sử dụng trong sắc ký:

− Phương pháp chuẩn ngoại − Phương pháp thêm chuẩn

− Phương pháp chuẩn nội − Phương pháp chuẩn hóa diện tích Trong khuôn khổ của khóa luận, tôi xin trình bày cụ thể về phương pháp chuẩn ngoại - chuẩn hóa nhiều 1 điểm và chuẩn hóa nhiều điểm

− Chuẩn hóa 1 điểm: chọn nồng độ chất phân tích trong mẫu chuẩn xấp xỉ

với nồng độ chất phân tích trong của mẫu thử Tính nồng độ của mẫu thử theo công thức:

Sx (Hx): diện tích (chiều cao) của pic mẫu thử

Ss (Hs): diện tích (chiều cao) của pic mẫu chuẩn

− Chuẩn hóa nhiều điểm: chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ chất chuẩn tăng dần, tiến hành sắc ký Vẽ đồ thị chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa diện tích S (hoặc chiều cao H) pic với nồng độ của chất chuẩn (C)

Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác định Có thể tính toán theo 2 cách:

 Áp dữ kiện diện tích (hoặc chiều cao) pic của chất thử vào đường chuẩn

sẽ suy ra nồng độ của nó

 Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích (hoặc chiều cao) pic với nồng độ của chất cần xác định

Y=a+bCx Trong đó:

Y: diện tích pic b: độ dốc của đường chuẩn

a: giao điểm của đường chuẩn Cx: nồng độ chất thử

Dựa vào phương trình hồi quy này ta tính được nồng độ chất thử:

Cx= 𝑌𝑌−𝑎𝑎

𝑏𝑏 [5]