Nghiên cứu được tiến hành trên thiết bị HPLC. 2.3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký
Lựa chọn cột sắc ký: trên 2 cột Eclipse XDB C18 (4,6 × 150 mm, 5µm) và cột Zorbax SB C18 (4,6 × 150 mm, 5µm), chọn cột có khả năng tách tốt và chọn lọc
Lựa chọn bước sóng thích hợp: tại đó đáp ứng của felodipin là cực đại nhưng ảnh hưởng của nền mẫu là ít nhất.
Lựa chọn pha động và tốc độ dòng: cho thời gian lưu vừa phải, pic của chất phân tích cân đối, sắc nét, hệ số đối xứng phù hợp mà áp suất cột không quá cao.
Lựa chọn thể tích tiêm: cho pic gọn đẹp, không xen phủ pic khác. 2.3.2. Thẩm định phương pháp
a. Độ phù hợp của hệ thống
- Xác định tính thích hợp của hệ thống bằng cách tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp mẫu chuẩn felodipin có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính. Ghi lại thời gian lưu và diện tích pic đáp ứng qua các lần sắc ký.
- Yêu cầu: Chênh lệch diện tích pic và thời gian lưu giữa các lần tiêm của cùng một mẫu, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD) không lớn hơn 2% [6].
b. Tính chọn lọc (độ đặc hiệu):
- Chuẩn bị mẫu trắng với các thành phần tá dược tương tự như trong chế phẩm nhưng không có hoạt chất felodipin và mẫu felodipin chuẩn trong pha động. So sánh sắc ký đồ thu được từ việc phân tích các mẫu trên.
- Yêu cầu: Khi chạy mẫu trắng, tại vị trí tương ứng với tR của Felodipin không xuất hiện pic [6].
c. Độ tuyến tính và khoảng nồng độ
− Xác lập mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ felodipin. Chuẩn bị một dãy felodipin chuẩn trong pha động có nồng độ như sau: 10-12-16-20-24 µg/ml. Sắc ký trong cùng điều kiện, xây dựng phương trình hồi quy và hệ số tương quan r.
− Yêu cầu: đường hồi quy có dạng đường thẳng và giá trị hệ số tương quan r >0,995 [6].
d. Độ chính xác
− Độ chính xác của phương pháp là mức độ thống nhất giữa các kết quả riêng biệt khi quy trình phân tích được áp dụng lặp đi lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đồng nhất. Độ chính xác được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD).
− Độ lặp lại: tiến hành phân tích 6 phép thử song song (xử lý mẫu, sắc ký) trên một mẫu chế phẩm. Tính kết quả dựa vào đường chuẩn pha trong pha động, tiến hành trong cùng điều kiện. Xác định độ chính xác bằng cách tính độ lệch chuẩn tương đối giữa các giá trị của các lần định lượng.
Yêu cầu: chênh lệch kết quả giữa các lần thử, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD ≤ 2%
− Độ chính xác trung gian: biểu diễn mức dao động của kết quả trong cùng một phòng thí nghiệm được thực hiện ở các ngày khác nhau hoặc thiết bị khác nhau hoặc người phân tích khác nhau. Yêu cầu: khả năng lặp lại kết quả giữa các lần thử, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD ≤ 2% và gộp kết quả của 2 ngày RSD ≤3% [6].
− Độ đúng của phương pháp bằng phương pháp thêm chuẩn felodipin vào mẫu placebo, lượng chất chuẩn thêm vào tương ứng với khoảng 80%, 100%, 120% lượng felodipin có trong mẫu thử (đảm bảo nồng độ ở trong khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng). Ở mỗi nồng độ, tiến hành sắc ký 3 lần thử nghiệm riêng biệt. Tính tỷ lệ thu hồi của Felodipin chuẩn thêm vào. − Yêu cầu: tỷ lệ thu hồi đạt 98,0-102,0%, RSD ≤ 2% [6].
2.3.3. Ứng dụng phương pháp phân tích định tính, định lượng felodipin trong viên nén felodipin giải phóng có kiểm soát viên nén felodipin giải phóng có kiểm soát
− Phân tích định tính dựa trên thời gian lưu của pic felodipin trong mẫu thử trùng thời gian lưu của pic felodipin trong mẫu chuẩn đáp ứng .
− Định lượng felodipin của chế phẩm thử bằng phương pháp định lượng đã xây dựng ở trên theo phương pháp chuẩn hóa diện tích 1 điểm. Yêu cầu: hàm lượng felodipin nằm trong khoảng 90,0%-110,0% [1].
2.3.4. Phương pháp xử lý kết quả
Kết quả thực nghiệm được xử lý bằng phương pháp thống kê trên Microsolf Office Excel 2007.
PHẦN 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Xây dựng điều kiện phân tích Felodipin bằng HPLC
3.1.1. Lựa chọn cột sắc ký
Qua nghiên cứu tính chất lý hóa của felodipin kết hợp với tài liệu tham khảo và điều kiện sẵn có của phòng thí nghiệm, chúng tôi lựa chọn sắc ký phân bố pha đảo. Khảo sát nghiên cứu trên 2 cột: Eclipse XDB C18 (4,6 × 150mm, 5µm) và cột Zorbax SB C18 (4,6 × 150 mm, 5µm) trên hệ pha động gồm Acetonitril: dung dịch đệm KH2PO4 25 mM pH 3,0: Methanol (30:30:40), đo ở bước sóng 362nm, tốc độ dòng 1,2 ml/phút. Kết quả được trình bày ở bảng 3.1
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát lựa chọn cột
STT Cột Thời gian lưu
tR (phút)
Hệ số đối xứng F
1 Zorbax SB 5,427 1,754
2 Eclipse XDB 7,273 0,998
Hình 3.2. Sắc ký đồ của Felodipin phân tích bằng cột Eclipse XDB
Nhận xét: từ bảng trên nhận thấy cột Eclipse XDB cho thời gian lưu hợp lý, hệ số đối xứng F nằm trong khoảng cho phép (0,8 ≤ F ≤ 1,5), do vậy chúng tôi lựa chọn cột Eclipse XDB C18 cho nghiên cứu.
3.1.2. Lựa chọn bước sóng thích hợp
Để xác định bước sóng thích hợp phát hiện felodipin, chúng tôi tiến hành quét phổ UV-VIS của pic felodipin trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn felodipin nồng độ 20 µg/ml.
Hình 3.3. Phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch Felodipin chuẩn
Kết quả: ở hình cho thấy felodipin có 3 cực đại hấp phụ ở các bước sóng 197 nm, 238 nm, 362 nm. Để giảm ảnh hưởng của nền mẫu nhưng vẫn đảm bảo độ nhạy của phương pháp chúng tôi lựa chọn bước sóng đo là 362 nm
3.1.3. Khảo sát lựa chọn tốc độ dòng và pha động • Lựa chọn tốc độ dòng: • Lựa chọn tốc độ dòng:
Tiến hành sắc ký với điều kiện sắc ký đã chọn với tốc độ dòng thay đổi 0,8 ml/phút; 1,0 ml/phút; 1,2 ml/phút, nhằm chọn tốc độ dòng thích hợp đảm bảo việc chất phân tách tốt và định lượng felodipin đồng thời rút ngắn thời gian phân tích, áp suất cột lại không quá cao.
• Lựa chọn pha động:
Song song với việc lựa chọn tốc độ dòng, tiến hành nghiên cứu thành phần pha động dựa trên hỗn hợp gồm Acetonitril: dung dịch đệm KH2PO4 25 mM pH 3,0: Methanol. Khảo sát pha động với Acetonitril: dung dịch đệm KH2PO4
Dung dịch đệm KH2PO4 25 mM pH 3,0 được chuẩn bị như sau: Hòa tan 1,7 g kali dihydrophosphat trong 400 ml nước, điều chỉnh pH đến 3,0 bằng dung dịch acid phosphoric và thêm nước vừa đủ 500 ml [1].
Kết quả được trình bày ở bảng 3.2 và hình 3.4, 3.5, 3.6
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát tỷ lệ pha động
STT Tỷ lệ pha động
ACN: đệm: MetOH lưu tThời gian R(phút)
1 40:40:20 14,824
2 40:30:30 9,278
3 30:30:40 7,269
Hình 3.4. Sắc ký đồ của hệ pha động thứ 1
Hình 3.6. Sắc ký đồ của hệ pha động thứ 3
Nhận xét: từ kết quả ở bảng 3.2 thấy hệ dung môi Acetonitril: dung dịch đệm KH2PO4 25 mM pH 3,0: Methanol tỷ lệ: 30:30:40 với tốc độ dòng 1,2 ml/phút cho thời gian lưu hợp lý, pic cân đối, có hệ đối xứng nằm trong khoảng cho phép, thời gian lưu ngắn mà áp suất cột lại không cao.
Kết quả: lựa chọn pha động có tỷ lệ Acetonitril: dung dịch đệm KH2PO4 25 mM pH 3,0: Methanol với tỷ lệ: 30:30:40 (v/v/v) với tốc độ dòng 1,2 ml/phút. 3.1.4. Lựa chọn thể tích tiêm mẫu
Tiến hành khảo sát thể tích tiêm mẫu ở 3 mức 20 µl, 40 µl, 50 µl. Nhận xét: với thể tích tiêm mẫu là 20 µl cho pic đẹp, cân đối. Kết luận: lựa chọn thể tích tiêm mẫu là 20µl.
Kết luận: từ các kết quả khảo sát trên, điều kiện sắc ký lựa chọn là:
Cột sắc ký: Eclipse XDB C18 (4,6×150 mm, 5µm)
Detector: UV bước sóng 362 nm
Pha động: Acetonitril: dung dịch đệm KH2PO4 25 mM pH 3,0: Methanol với tỷ lệ: 30:30:40 (v/v/v)
Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút
Nhiệt độ phân tích: nhiệt độ phòng thí nghiệm
Dung dịch đệm KH2PO4 25 mM pH 3,0: Hòa tan 1,7 g kali dihydrophosphat trong 400 ml nước. Điều chỉnh pH đến 3,0 bằng dung dịch acid phosphoric và thêm nước vừa đủ 500 ml [1].
Hình 3.7 là sắc ký đồ của felodipin thu được ở điều kiện sắc ký thiết lập được
Hình 3.7. Sắc ký đồ của Felodipin (khảo sát điều kiện sắc ký)
3.2. Chuẩn bị mẫu
3.2.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn
- Cân chính xác khoảng 25,0 mg Felodipin chuẩn vào bình định mức dung tích 25,0 ml, thêm khoảng 15,0 ml pha động, lắc cho tan, sau đó pha loãng bằng pha động đến vạch, lắc đều được dung dịch nồng độ 1 mg/ml.
- Pha dãy chuẩn:
Cho vào 5 bình định mức 50 ml các thể tích dung dịch felodipin nồng độ 1 mg/ml chính xác như bảng 3.3, pha loãng bằng pha động đến vạch, lắc đều.
Bảng 3.3. Cách pha các dung dịch chuẩn STT Bình định mức (ml) Thể tích dung dịch chuẩn gốc (µl) Nồng độ dự kiến sau pha loãng (µg/ml) 1 50 500 10 2 50 600 12 3 50 800 16 4 50 1000 20 5 50 1200 24 Lọc qua màng 0,45 µm để chạy sắc ký. 3.2.2. Chuẩn bị dung dịch thử:
Cân chính xác khối lượng của 20 viên chế phẩm, tính khối lượng trung bìnhviên, nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng khoảng 5,0 mg felodipin (viên có khối lượng trung bình 354,60 mg) cho vào bình định mức dung tích 50,0 ml, thêm khoảng 30 ml pha động, siêu âm 15 phút thêm pha động vừa đủ tới vạch, lắc đều. Ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 5 phút. Lấy 10,0 ml dịch sau ly tâm vào bình định mức 50,0 ml, thêm pha động tới vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm, được dung dịch thử.
3.2.3. Chuẩn bị mẫu trắng:
Là mẫu tá dược tự tạo bằng cách trộn theo nguyên tắc đồng lượng dựa vào công thức của viên, không chứa dược chất được cân và xử lý mẫu giống mẫu thử.
3.3. Thẩm định phương pháp HPLC định lượng felodipin
3.3.1. Độ thích hợp của hệ thống
Tiến hành: chuẩn bị mẫu felodipin chuẩn nồng độ 20 µg/ml như mục 3.2.1. Sắc ký lặp lại 6 lần dung dịch này theo điều kiện đã chọn. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thống sắc ký
Stt Thời gian lưu (phút) Diện tích pic(mAU.s) Hệ số đối xứng Sthuyố đĩa lý ết 1 7,273 398,6 0,959 8411 2 7,154 396,2 0,994 8293 3 7,051 397,9 0,996 8102 4 7,280 396,6 0,988 8664 5 7,281 396,8 0,990 8602 6 7,175 399,0 0,997 8463 TB 7,203 397,5 8422,5 RSD% 1,29 0,29 Nhận xét:
Kết quả ở bảng cho thấy RSD của thời gian lưu và diện tích pic của Felodipin của 6 phép thử <2%,các giá trị đối xứng nằm trong khoảng cho phép 0,8 ≤ F≤ 1,5 và số đĩa lý thuyết trung bình cao.
Điều này chứng tỏ hệ thống sử dụng là phù hợp và đảm bảo ổn định cho phép phân tích định lượng felodipin.
3.3.2. Tính đặc hiệu
− Chuẩn bị dung dịch chuẩn Felodipin nồng độ 20 µg/ml như mục 3.2.1, mẫu trắng như mục 3.2.3
− Tiến hành sắc ký với điều kiện đã chọn với 3 mẫu chuẩn bị trên. Kết quả thu được các sắc ký đồ như ở hình 3.8, 3.9.
Hình 3.8. Sắc ký đồ của mẫu trắng
Hình 3.9. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn nồng độ 20µg/ml
Nhận xét: ở hình 3.9 cho thấy pic của felodipin có tR= 7,303 phút, pic cân đối sắc nét
Trên sắc ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện pic trong khoảng thời gian phân tích từ 7- 8 phút. Chứng tỏ phương pháp có tính đặc hiệu cao.
3.3.3. Độ tuyến tính
Tiến hành: chuẩn bị một dãy chuẩn felodipin có nồng độ 10-12-16-20-24 µg/ml như mục 3.2.1, sắc ký theo điều kiện đã chọn. Ghi các giá trị diện tích pic đo được ứng với các nồng độ của dung dịch trên và thiết lập phương trình hồi quy và hệ số tương quan r.
Kết quả khảo sát độ tuyến tính được trình bày ở bảng 3.5 và hình 3.10
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ tuyến tính
Nồng độ C (µg/ml) 10,01 12,01 16,02 20,02 24,02 Diện tích pic (mAU.s) 174,4 211,2 292,4 376,7 455,8 Kết quả Phương trình hồi quy tuyến tính:
y=20,237x - 30,125
Hệ số tương quan tuyến tính: R=0,9999
Hình 3.10. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic
Nhận xét: Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy trong khoảng nồng độ đã khảo sát, diện tích pic thu được đáp ứng trên sắc ký đồ tỷ lệ thuận với nồng độ của chúng,sự phụ thuộc thể hiện qua đường thẳng hồi quy tuyến tính (hình 3.10) và hệ số tương quan R= 0,9999. Như vậy phương pháp có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ trong khoảng nồng độ khảo sát 10 - 24 µg/ml.
100 150 200 250 300 350 400 450 500 5 10 15 20 25 30 Nồng độ felodipin (µg/ml) Di ện tíc h pic ( m A U .s)
3.3.4. Độ chính xác
a.Độ lặp lại
− Chuẩn bị dung dịch thử như mục 3.2.2 làm 6 mẫu.Tiến hành sắc ký, ghi lại sắc ký đồ và tính nồng độ felodipin trong các dung dịch thử theo đường chuẩn xây dựng được từ dãy chuẩn.
− Kết quả xác định độ lặp lại của kết quả định lượng được trình bày ở bảng 3.6.
b.Độ chính xác trung gian
Phân tích định lượng felodipin trong viên ở ngày tiếp theo. Tiến hành tương tự như độ lặp lại trong ngày: phân tích 6 mẫu thử độc lập. Tính toán nồng độ chất thử theo đường chuẩn xây dựng được trong cùng ngày phân tích. Kết quả xác định hàm lượng felodipin trong viên được trình bày ở bảng 3.6
Bảng 3.6. Kết quả xác định độ chính xác STT Khối lượng cân (mg) Diện tích pic (mAU.s) Hàm lượng so với lượng ghi trên nhãn (%) Các giá trị thống kê (%) Độ lặp lại 1 354,88 384,5 102,36 TB=101,98 RSD%=0,96 2 357,00 384,2 101,68 3 367,20 393,7 101,12 4 356,37 391,8 103,72 5 357,10 382,0 101,11 6 366,09 395,6 101,88 Độ chính xác trung gian 7 355,70 390,5 105,81 TB=106,08 RSD%=0,88 8 351,40 390,2 107,02 9 355,30 391,9 106,31 10 361,50 396,2 105,62 11 353,10 383,2 104,61 12 356,30 395,9 107,09 Gộp kết quả 2 ngày (n=12) RSD%=2,24
Nhận xét: kết quả ở bảng cho thấy:
Với điều kiện đã chọn, độ lặp lại của các kết quả định lượng trong mỗi ngày phân tích cho RSD đạt được là 0,96% và 0,88% đều nhỏ hơn 2%. Đánh giá gộp kết quả 2 ngày cho RSD là 2,24 % nhỏ hơn 3%.
Kết luận: phương pháp có độ lặp lại trong ngày và độ chính xác trung gian đáp ứng yêu cầu thẩm định với chế phẩm thuốc.
3.3.5. Độ đúng: Tiến hành: Tiến hành:
- Pha dãy chuẩn: chuẩn bị như mục 3.2.1
- Mẫu tự tạo: Cân lượng mẫu tá dược tương đương khối lượng bột chứa 5 mg felodipin vào bình định mức 50,0 ml. Thêm chính xác khoảng 4 mg, 5 mg và 6 mg chất chuẩn felodipin vào bình, thêm 35 ml pha động. Siêu âm 15 phút, bổ sung bằng pha động tới vạch, lắc đều. Ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 5 phút. Lấy 10,0ml dịch sau ly tâm vào bình định mức 50,0 ml, thêm pha động tới vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm.
Sắc ký theo các điều kiện đã chọn ở trên, tìm độ thu hồi của chất chuẩn. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp được trình bày ở bảng 3.7
Bảng 3.7. Kết quả đánh giá độ đúng Mức nồng độ STT Khối lượng chuẩn thêm vào(mg) Nồng độ Felodipin (µg/ml) Diện tích pic (mAU.s) Lượng felodipi n tìm lại (mg) %tìm lại Mức 1 80% 1 4,01 16,06 297,1 4,04 100,66 2 3,97 15,87 291,3 3,97 100,07 3 4,04 16,16 299,4 4,07 100,76 Mức 2 100% 4 5,02 20,08 371,3 4,96 98,79 5 4,96 19,84 369,1 4,93 99,43 6 5,05 20,20 370,5 4,95 98,01 Mức 3 120% 7 6,02 24,096 454,4 5,99 99,36 8 5,95 23,81 452,5 5,96 100,17 9 6,06 24,24 454,7 5,99 98,83