Xây dựng phương pháp phân tích phát hiện một số chất ức chế men phosphodiesterase 5 trộn trái phép trong thuốc đông dược và thực phẩm chức năng

LÊ THỊ QUỲNH NGA XÂY DựNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍsCH PHÁT HIỆN MỘT SỐ CHẤT ứ c CHê MEN PHOSPHODIẼSTERASE-5 TRỘN TRÁI PHÉP TRONG THUố C ĐÔNG DƯỢC VÀ THựC PHẨM CHỨC NĂNG LUẬN VĂN THẠC SỸ • • Dược HỌC • • CHUYÊN NGHÀNH : KIỂM NGHIỆM THUỐC & ĐỘC CHẤT MÃ SỐ : CH14053 Người hướng dẫn khoa học: TS Trần Việt Hùng LỜI CẢM ƠN V ới lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, tơi xin chân thành cảm ơn TS Trần Việt Hùng, người thầy tận tụy trực tiếp hướng dẫn, bảo suốt q trình thực hồn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám Đốc Viện Kiểm N ghiệm thuốc Trung Ương, Ban giám hiệu, Phòng quản lý sau đại học thầy cô giáo trường Đại học Dược H N ội tạo điều kiện, tận tình hướng dẫn tơi suốt trình học tập thực đề tài Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới bạn đồng nghiệp Khoa Kiểm nghiệm dạng bào chế Khoa Vật lý đo lường giúp đỡ, san sẻ cơng việc đóng góp ý kiến cho tơi hồn thành luận văn Đặc biệt, tơi xin cảm ơn DS D ương M inh Tân, người giúp đỡ tơi nhiều q trình thực đề tài Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình bạn bè động viên, khích lệ tơi suốt q trình học tập thực luận văn H Nội, ngày 06 tháng 10 năm 2011 DS Lê Thị Quỳnh Nga MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỦ VIẾT TÁT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỎ THỊ DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỊ THỊ ĐẶT VẤN ĐẺ CHƯƠNG I TỎNG QUAN 1.1 Vài nét rối loạn cương dương 1.2 Chất ức chế PDE-5 1.2.1 Tống quan chất ức chế PDE-5 1.2.2 Sildenafil 1.2.3 Vardenafil 1.2.4 Tadalafil 1.2.5 Các chất ức chế PDE-5 khác 1.3 Phương pháp phân tích chất ức chế PDE-5 trộn trái phép thuốc thực phấm chức 1.3.1 Phương pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu cao với detector DAD (HPLC-DAD) 1.3.2 Phương pháp phân tích phổ khối (MS) 1.4 Thực trạng trộn trái phép chất ức chế PDE-5 thuốc 12 18 đông dược thực phẩm chức 1.4.1 Tình hình giới 18 1.4.2 Tình hình nước 18 CHƯƠNG II: ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 21 2.1 Đối tượng nehiên cứu 21 2.2 Phương tiện nghiên cứu 21 2.2.1 Hóa chất - thuốc thử 21 2.2.2 Thiết bị - dụna cụ 21 2.3 Phương pháp nghiên cứu 22 2.3.1 Phương pháp phát chất ức chế PDE-5 bằna phương 22 pháp khối phổ trực tiếp (MS) 2.3.2 Xây dựne chương trình sắc ký lỏng hiệu cao (IIPLC) 27 để định tính, định lượng số chất ức chế PDE-5 2.3.3 Khảo sát số mẫu thuốc đôrm dược thực phẩm chức 28 điều trị rối loạn cương dương 2.3.4 Phươns pháp xử lý số liệu 29 CHƯƠNG III: KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 31 3.1 31 Xây dựna phương pháp phát sổ chất ức chế PDE-5 phương pháp khối phổ trực tiếp (MS) 3.1.1 Xây dựna phưcme pháp 31 3.1.2 Đánh Ìá phương pháp 32 3.2 Xây dựns phương pháp định tính, định lượng số chất 35 ức chế PDE-5 bằnơ phương pháp HPLC 3.2.1 Xây dựng phươne pháp 35 3.2.2 Đánh aiá phương pháp 38 3.3 Ket khảo sát số mẫu thuốc đông dược thực 50 phâm chức 3.3.1 Thuốc đông dược 50 3.3.2 Thực phẩm chức năns 53 CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN 62 4.1 Xây dựns phươns pháp phân tích 62 4.2 Ket khảo sát số mẫu thuốc đông dược thực 63 phấm chức năns điều trị rối loạn cươns dương bằnạ phương pháp khối phố trực tiếp phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao với detector DAD KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ KÉT LUẬN 64 KIÉN NGHỊ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 PHỤ LỤC ACPI : Atmospheric Pressure Chemical Ionization ADP : Adenosin diphosphat ATP : Adenosin triphosphat CE-MS : Capillary electrophoresis - Mass Spectrometry Điện di mao quản kết hợp khối phổ c GMP : Cyclic guanosine monophosphate CI : Chemical ionization (lon hóa hóa học) DAD : Diod array detector El : Electron Impact (Va chạm điện tử) ESI : Electro Spray Ionization (lon hóa bang phun điện tử) GC-MS : Gas Chromatogarphy - Mass Spectrometry Sắc ký khí kết hợp khối phổ GLP : Good laboratory practice HPLC : High Performance Liquid Chromatogarphy Sắc ký lỏng hiệu cao IEC : International Electrotechnical Commission ISO : International Standard LOD : Limit of detection (Giới hạn phát hiện) LOQ : Limit of quantitation (Giới hạn định lượng) MS : Mass Spectrometry Orgnization Phổ khối lượne, gọi tắt phổ khối PDA : Photodiode Array PDE-5 : Phosphodiesterase-5 PKG : Protein kinase RSD : Relative Standard Deviation TT : Thứ tự ƯSP : The United States Pharmacopoeia Dược điển Mỹ ƯV : Ultraviolet DANH MỤC CÁC BẢNG « Tên bảng Đặc trưng phổ khối chất chống rối loạn cương dương nhóm ức chế PDE-5 Ket eiá trị chiều cao diện tích pic dãy chuẩn 23 39 xác định LOD sildenafil Ket giá trị chiều cao diện tích pic dãy chuẩn 40 xác định LOD vardenìl Ket giá trị chiều cao diện tích pic dãy chuẩn 41 xác định LOD tadalafil Ket khảo sát tính tuyến tính sildenafil 43 Ket khảo sát tính tuyến tính vardenìl 44 Ket khảo sát tính tuyến tính tadalìl 45 Ket khảo sát độ phương pháp HPLC (đối với 46 sildenafil) Ket khảo sát độ phương pháp HPLC (đối với 46 vardenafil) Ket khảo sát độ phương pháp HPLC (đối với 47 vardenafil) Ket khảo sát độ lặp lại (đối với sildenafil) 48 Ket khảo sát độ lặp lại (đối với vardenaíĩl) 49 Kêt khảo sát độ lặp lại (đơi với tadalìl) 49 Tên hình Sơ đồ biểu diễn chế tác dụng chất ức chế PDE-5 Cấu trúc hóa học Sildenafil Cấu trúc hóa học Vardenafil Cấu trúc hóa học Tadalafil Sơ đồ máy HPLC Dòne ion 14 Bộ phận phát ion 14 Hệ thống MS/MS Triple-quadrupole 15 Một số thực phẩm chức phát bị trộn trái phép 20 chất ức chế PDE-5 Một số thiết bị sử dụng nghiên cứu 22 Quá trình phân mảnh phân tử Sildenafil 24 Quá trình phân mảnh phân tử Vardenafil 25 Quá trình phân mảnh phân tử Tadalafil 25 Phổ khối MS lần full scan dung dịch sildenafil 10 32 |ig/ml Phổ khối MS/MS full scan dung dịch sildenafil 10 33 ng/ml Phô khối MS lần full scan dung dịch vardenafil 10 33 ng/ml Phố khối MS/MS full scan dung dịch vardenafil 10 34 |ig/ml Phổ khối MS lần full scan dung dịch tadalafil 10 34 (Ig/ml Phổ khối MS/MS full scan dung dịch tadalafil 10 Ịig/ml 35 Sắc ký đồ mẫu trắng phân tích HPLC 38 Hình 3.8 Sắc ký đồ dung dịch sildenafil 10 ng/ml phân tích 38 HPLC Hình 3.9 Sắc ký đồ dung dịch vardenafil 10 |ig/ml phân tích bane 38 HPLC Hình 3.10 Sắc ký đồ dune dịch tadalafil 10 ng/ml phân tích 39 HPLC Hình 3.11 Sắc ký đồ xác định LOD sildenafil 40 Hình 3.12 Sắc ký đồ xác định LOD vardenafil 41 Hình 3.13 Sắc ký đồ xác định LOD vardenll 42 Hình 3.14 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc nồng độ (mcg/ml) 43 diện tích pic (mAu.s) sildenafil Hình 3.15 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc none độ (mcg/ml) 44 diện tích pic (mAu.s) vardenafil Hình 3.16 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc nồng độ (mcg/ml) diện tích pic (mAu.s) tadalìl 45 ĐẬT VÁN ĐÈ Từ năm 1998 đên nay, có dược chất tơnơ họfp thuộc nhóm ức chế men phosphodiesterase-5 (PDE-5) công nhận làm thuốc điều trị rối loạn cươna, dươns là: sildenafil citrate (Viagra, Pfizer, 1998), vardenafil hydroclorid (Levitra, Bayer, 2003), tadalafil (Cialis, Lily, 2003)[19], [25], Tuy nhiên, từ xa xưa naười có nhữne thuốc dân eian dùno đế đièu trị cho đàn ông yêu sinh lý Do thị trườne cũn Si tồn nhiều loại thuôc đône dược thực phâm chức có nguồn sốc từ dược liệu dùng để diêu trị rối loạn ciron 11 dương Trong năm íiần đây, e,iới Việt Nam phát thấy dược chất nhiều chất tương tự chúns chưa côna nhận làm thuốc trộn trái phép nhiều thuốc thực phâm chức [19], [20], [25] Việc nàv đe dọa nghiệm trọna đen sức khởe cộng done Bơi việc định loại thc trèn đê điều trị roi loạn cương dươn? cho bệnh nhân cần có theo dõi chặt chỗ bác sỹ liều dùng thời gian sử dụng Doi với thuốc đỏng dược thực phâm chức thường, dược mua điều trị mà không cần kè đơn cua bác sỹ Vì vậv, nhữna loại thuốc nàv mà bị trộn trái phép dược chât trên, n s i bệnh sử dụns, lâu dài với lượng lớn Hây n h ne biến chứng tác dụng phụ nguy Viện Kiêm nghiệm Thuốc Trung ưưng - Bộ y tế phát số thực phâm chức năn , thc đơna dược có chứa chât ức chê PDH-5 như: Supai 99 Tonskat All Plus (Malaisia) có chứa nor-acctildcnafil, Spartan (Malaisia) cỏ chứa acetildenìl Mãnh nam (neuyên liệu nhập từ Trune, Quốc) có chứa acctildenafil Hiện nay, Cục Vệ sinh an toàn thực phẩm có định u cầu thc đơng dược thực phẩm chức năne có nguồn ?ốc từ dược liệu dùng để điều trị rối loạn cươne dương phải kiểm tra phát có mặt chất ức chế PDE-5 Tuy nhiên chưa có phươnơ pháp phân tích thức thốne để kiểm tra chất 10 C òn g thận Nam Á Phổ M S D :\T a n\C u on gT han TIC 150-600-ÍS I M S2TJC 150-600 \Ạ hiệu lớn MS/MS mảnh mẹ m/z=489 (E=45%) , \ I? /A \