Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TÁT THÀNH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG NGUYEN TAT THANH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ÁP DỤNG KỸ THUẬT RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION (RPA) NHẰM PHÁT[.]
Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TÁT THÀNH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG NGUYEN TAT THANH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ÁP DỤNG KỸ THUẬT RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION (RPA) NHẰM PHÁT HIỆN NHANH CÓ MẶT CỦA PSEUDOMONAS AERUGINOSA TRONG MẪU NƯỚC UỐNG Sinh viên thực : Võ Thị Anh Thư Chuyên ngành TP.HCM, tháng năm 2018 : Công nghệ Sinh học Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẮT THÀNH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG csGIbo KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ÁP DỤNG KỸ THUẬT RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION (RPA) NHẰM PHÁT HIỆN NHANH CÓ MẶT CỦA PSEUDOMONAS AERUGINOSA TRONG MẪU NƯỚC UỐNG Sinh viên thực : Võ Thị Anh Thư Mã số sinh viên :1411532880 Lóp : 14DSH02 Chun ngành : Cơng nghệ Sinh học Giáo viên hướng dần : TS Phùng Thị Thu Hường TP.HCM, tháng năm 2018 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: Ba Mẹ lời cám ơn sâu sắc Cám ơn gia đình ln bên tôi, ủng hộ cho niềm tin, chăm lo, động viên, hồ trợ mặt từ vật chất đến tinh thần đe tơi hồn thành khóa luận Tơi xin cám ơn cô Phùng Thị Thu Hường chị Trần Hồng Diềm người hướng dần tận tình dẫn động viên tơi suốt q trình thực khóa luận, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu trình thực Ban giám hiệu trường Đại học Nguyền Tất Thành, cán công tác tạo điều kiện giúp suốt thời gian học tập Các thầy cô khoa Công nghệ Sinh học Môi trường dạy dỗ, truyền đạt nhiều kiến thức bổ ích kỳ chuyên ngành cho em suốt thời gian học tập trường Cuối cùng, cám ơn tất cán bạn Viện Kì thuật Cơng nghệ cao Nguyền Tất Thành trường Đại học Nguyễn Tất Thành giúp đỡ, tạo điều kiện cho lời khuyên kinh nghiệm quý báo đề hoàn thành luận văn Tác giả Võ Thị Anh Thư Khoa Công nghệ Sinh học Môi trường Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành 11 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC .iii TÓM TẨT vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC CÁC HÌNH X DANH MỤC CÁC BẢNG xi ĐẶT VÁN ĐÈ 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài CHƯƠNG TỐNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung vê Pseudomonas aereginosa 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm sinh vật học p aeruginosa 1.1.2.1 Hình thái, cấu tạo 1.1.2.2 Cấu trúc tế bào 1.1.3 Phân bố 1.1.4 Nuôi cấy .5 1.1.5 Đặc điểm hóa sinh 1.1.6 Khả đề kháng 1.1.7 Độc tố 1.1.8 Khả gây bệnh 1.1.9 Phòng bệnh điều trị 1.2 Tổng quan phương pháp 1.2.1 Kì thuật RPA 1.2.2 Cách thức thực 11 1.2.3 ứng dụng đa dạng kỳ thuật RPA 12 1.3 Các nghiên cứu phát p aeruginosa nước giới 13 1.3.1 Nghiên cứu giới 13 1.3.2 Nghiên cứu Việt Nam 13 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 15 2.1 Nơi thực 15 iii 2.2 Nội dung thực 15 2.3 Phương pháp nghiên cứu 15 2.3.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.3.2 Hóa chất 15 2.3.3 Dụng cụ, thiết bị 16 2.4 Phương pháp nghiên cứu 17 2.4.1 Lựa chọn gen mục tiêu đặc trưng cho p.aeruginosa, sàng lọc mồi phù hợp 17 2.4.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn 18 2.4.3 Kiêm tra độ tinh DNAbằng máy đo quang phổ 18 2.4.4 Phương pháp điện di 19 2.4.5 Thực phản ứng PCR truyền thống đe đánh giá thành phần phản ứng 20 2.4.6 Phương pháp xác định nong độ tế bào 22 2.4.7 Phương pháp RPA có tách chiết DNA vi khuẩn 23 2.4.8 Phương pháp RPA trực tiếp không tách chiết DNA vi khuấn 25 2.4.9 Tối ưu hóa điều kiện phản ứng kỳ thuật RPA phát nhanh có mặt p aeruginosa mầu nước uống 26 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Ket lựa chọn gen mục tiêu thiết kế mồi tách chiết DNA 27 3.2 Kết tách chiết DNA vi khuẩn 27 3.3 Ket hoạt động thành phần phản ứng kỳ thuật PCR truyền thống 28 3.4 Ket hoạt động kỳ thuật RPA 29 3.5 Ket xác định độ nhạy phản ứng PCR với cặp mồi thiết kế cho RPA ' 30 3.6 Ket khảo sát phản ứng RPA theo nhiệt độ 31 3.7 Ket khảo sát hiệu phản ứng RPA theo thời gian ủ phản ứng 32 3.8 Kết khảo sát nồng độ DNA tách chiết phát kỳ thuật RPA 33 3.9 Ket khảo sát so lượng tế bào tối thiểu mà RPA có the phát 34 3.10 Ket xác định độ nhạy cùa phản ứng RPA với DNA không tách chiết 35 3.11 Thảo luận 36 KÉT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 iv PHỤ LỤC 42 V TÓM TẢT Pseudomonas aeruginosa loại vi khuấn gây nhiễm trùng hội nguy hiểm đặc biệt người suy giảm miền dịch đưa vào Tiêu chuẩn Việt Nam nước uống nước đóng chai Bộ trưởng Bộ Khoa học Công nghệ ban hành theo Quyết định 23/2004/QĐ-BKHCN Tiêu chuẩn Việt Nam từ năm 2004 đến Đe tài: “Áp dụng kỹ thuật Recombinase Polymerase Amplification (RPA) nhằm phát nhanh có mặt Pseudomonas aeruginosa mẫu nước uống”, thực từ tháng 2/2018 đến 8/2018 Phịng thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học - Viện Khoa học Kỳ thuật Công nghệ cao Nguyễn Tất Thành - Trường Đại học Nguyễn Tất Thành (298A Nguyễn Tất Thành, Phường 13, Quận 4, Tp Hồ Chí Minh) với mục tiêu áp dụng kỳ thuật RPA nhằm phát nhanh có mặt p aeruginosa mẫu nước uống Đe tài có bốn nội dung: tiến hành lựa chọn gen mục tiêu đặc trưng cho vi khuẩn p aeruginosa thích hợp phản ứng RPA, qua sàng lọc đe tìm trình tự moi đe nhân đoạn gen RPA; tối ưu hóa điều kiện phản ứng RPA bao gồm hàm lượng mồi, nhiệt độ phản ứng, thời gian phản ứng; đánh giá hiệu phản ứng RPA RPA trực tiếp khơng tách chiết DNA vi khuấn khía cạnh lượng tế bào vi khuấn tối thiểu phát được; so sánh phản ứng RPA, RPA trực tiếp không tách chiết DNA vi khuẩn phản ứng PCR truyền thống Các thí nghiệm bố trí theo kiêu hoàn toàn ngầu nhiên Những kết đạt sau tháng nghiên cứu: Lựa chọn gen mục tiêu thiết kế mồi phù hợp để phát triển phương pháp RPA Tối ưu hóa điều kiện phản ứng RPA với tế bào tách chiết không tách chiết vi khuan p aeruginosa Phản ứng RPA RPA trực tiếp khơng tách chiết có độ nhạy cao thời gian thực phản ứng nhanh PCR truyền thống VI SUMMARY Pseudomonas aeruginosa is a widespread, opportunistic Gram negative bacillus that causes various clinical infections and severe infectious diseases According to microbiology standards for drinking water, p aeruginosa is one of the most important standards The thesis entitles “Application of recombinase polymerase amplification in the detection of Pseudomonas aeruginosa from drinking water” Finishing the thesis at biotechnology laboratory of NTT Hi - Tech Institute - Nguyen Tat Thanh University in August 2018 (298A Nguyen Tat Thanh, Ward 13, District 4, Ho Chi Minh city) with the goal of applying RPA technology to establish an optimized RPA method to rapidly detect p aeruginosa in drinking water samples The thesis includes contents: choosing specific target sequence and design primers for detecting that sequence with RPA; the DNA templates p aeruginosa strain was extracted and detected by polymerase chain reaction (PCR) and RPA; time for reactions of two methods were recorded and the sensitivity of these methods in detecting p aeruginosa was analyzed; established and optimized RPA technology for fast detection of p aeruginosa from drinking water The experiments were completely ramdomized The results of this research are as follows: - With RPA technique, amplification and detection could be completed simultaneously, which took 15 minutes, and the total time was 35 minutes - The established optimized RPA technology for fast detection of p aeruginosa requires shorter time, with high sensitivity and specificity It was of great value in fast detection of p aeruginosa infection in drinking water DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT p aeruginosa: Pseudomonas aeruginosa s aureus: Staphylococcus aureus pg: Microgram |11: Microlitre nm: Nanometer bp: Base pair kb: Kilobase MR: Methyl red VP: Voges Proskauer ODC: Ornithine decarboxylase LDC: Lysine decarboxylase ADH: Arginine dehydrolase RPA: Recombinase Polymerase Amplification CDC: Trung tâm ngăn ngừa kiếm sốt bệnh Hoa Kì (Centers for Disease Control and Prevention) PCR: Polymerase Chain Reaction LAMP: Loop - mediated isothermal amplification DNA: Deoxyribonucleic acid RNA: Ribonucleic acid CTAB: Cetyl trimethylammonium bromide CFU: Colony - forming unit PCI: Phenol: Chloroform: Isoamylacohol Tm; Melting Temperature viii F: Forward R: Reverse OD: Mật độ quang UV: Ultra Violet TAE: Tris - acetate - EDTA LB: Luria - Bertani Taq: Thermus aquaticus Fg: Femtogram Pg: Picogram IX ... RPA nhằm phát nhanh có mặt Pseudomonas aeruginosa mẫu nước uống? ?? nhằm phát nhanh có mặt p aeruginosa mầu nước uống Mục tiêu đề tài Áp dụng kỳ thuật RPA nhằm phát nhanh có mặt p aeruginosa mẫu nước. .. TRƯỜNG csGIbo KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ÁP DỤNG KỸ THUẬT RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION (RPA) NHẰM PHÁT HIỆN NHANH CÓ MẶT CỦA PSEUDOMONAS AERUGINOSA TRONG MẪU NƯỚC UỐNG Sinh viên thực : Võ Thị Anh... chuẩn Việt Nam từ năm 2004 đến Đe tài: ? ?Áp dụng kỹ thuật Recombinase Polymerase Amplification (RPA) nhằm phát nhanh có mặt Pseudomonas aeruginosa mẫu nước uống? ??, thực từ tháng 2/2018 đến 8/2018