Xây dựng phương pháp phát hiện thực phẩm biến đổi gen có nguồn gốc thực vật dựa trên trình tự promoter 34s FMV

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN THỰC PHẨM BIẾN ĐỔI GEN CĨ NGUỒN GỐC THỰC VẬT DỰA TRÊN TRÌNH TỰ PROMOTER 34S-FMV Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS Phạm Vũ Việt Dũng Sinh viên thực : Trần Quang Phát MSSV: 1311100065 Lớp: 13DSH01 Đồ án tốt nghiệp TP Hồ Chí Minh, 2017 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan đề tài nghiên cứu thân thực khơng chép hình thức Các số liệu đề tài có nguồn gốc rõ ràng, tuân thủ nguyên tắc Kết trình bày đề tài thu thập trình nghiên cứu trung thực chưa công bố trước Tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm nội dung khoa học đề tài nghiên cứu Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2017 Sinh viên, Trần Quang Phát Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy cô trường Đại học Công nghệ TP.HCM nói chung, q thầy khoa Cơng Nghệ Sinh Học - Thực Phẩm - Mơi Trường nói riêng tận tình dạy dỗ, giúp em hồn thiện kiến thức, kỹ chuyên môn tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình học tập Xin gửi đến TS Nguyễn Tiến Dũng, ThS Phạm Vũ Việt Dũng với anh chị phòng kiểm nghiệm Sinh học, Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy Sản vùng lời cảm ơn sâu sắc tạo điều kiện thuận lợi, trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt em suốt thời gian qua Xin ghi nhận cơng sức đóng góp q báu, nhiệt tình tồn thể bạn lớp 13DSH01 đóng góp ý kiến, giúp đỡ động viên tơi suốt trình học tập nghiên cứu Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ nuôi dạy đến ngày khôn lớn cho ăn học thành tài Vì chưa có nhiều kinh nghiệm, dựa vào kiến thức hạn hẹp với thời gian ngắn ngủi nên chắn không tránh khỏi sai sót Kính mong nhận góp ý q thầy để kiến thức chúng em ngày hoàn thiện hơn, rút kinh nghiệm bổ ích cho q trình học tập, làm việc sau Cuối cùng, xin kính chúc quý thầy cô trường Đại học Công nghệ TP.HCM dồi sức khỏe thành công nghiệp cao q Đồng kính chúc q thầy cơ, anh chị phòng kiểm nghiệm Sinh học Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy Sản vùng dồi sức khỏe đạt nhiều thành công tốt đẹp sống Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2017 Sinh viên, Trần Quang Phát Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu trồng biến đổi gen (GMO) 1.1.1 Khái niệm trồng biến đổi gen (GMO) .3 1.1.2 Lịch sử hình thành trồng biến đổi gen 1.2 Tình hình trồng biến đổi gen giới Việt Nam 1.2.1 Xu hướng nghiên cứu trồng biến đổi gen giới 1.2.2 Tình hình thương mại hóa trồng chuyển gen 1.2.3 Các yêu cầu dán nhãn sản phẩm GMO giới Việt Nam 11 1.2.4 Tình hình nghiên cứu thực phẩm biến đổi gen Việt Nam 12 1.3 Các phương pháp xác định trồng biến đổi gen 14 1.3.1 Phương pháp sử dụng protein đích phân tích 14 1.3.2 Phương pháp sử dụng DNA đích 14 1.3.3 Một số trình tự DNA đích áp dụng phương pháp sàng lọc 15 1.3.4 Giới thiệu chung phương pháp PCR 16 CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 18 2.1.1 Địa điểm nghiên cứu 18 2.1.2 Thời gian nghiên cứu 18 2.2 Vật liệu nghiên cứu 18 2.2.1 Nguồn mẫu 18 2.2.2 Hóa chất, dụng cụ thiết bị .20 2.3 Phương pháp nghiên cứu 21 2.3.1 Phương pháp thu mẫu 21 2.3.2 Phương pháp bảo quản mẫu 21 2.3.3 Phương pháp tách chiết DNA .21 2.3.4 Phản ứng PCR .24 2.3.5 Kỹ thuật điện di gel 28 i Đồ án tốt nghiệp 2.4 Xác nhận hiệu lực phương pháp phân tích GMO kỹ thuật PCR 31 2.5 Bố trí thí nghiệm 32 2.5.1 Tách chiết DNA 32 2.5.2 Khảo sát tối ưu hóa phản ứng PCR .32 2.5.3 Đánh giá thông số kĩ thuật phương pháp 34 2.6 Cải tiến phương pháp 36 2.7 Khảo sát mẫu thị trường 37 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 38 3.1 Sản phẩm tách chiết DNA 38 3.2 Tối ưu hóa phản ứng PCR 39 3.2.1 Khảo sát tính chuyên biệt cặp mồi 39 3.2.2 Khảo sát tối ưu nồng độ MgCl2 nồng độ mồi lên phản ứng PCR 40 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ bắt cặp mồi khuôn DNA phản ứng PCR .42 3.3 Đánh giá hiệu lực phương pháp 44 3.4 Đề xuất quy trình khảo sát mẫu thực tế kĩ thuật PCR 46 3.5 Cải tiến phương pháp phản ứng Realtime – PCR 47 3.6 Kết khảo sát mẫu thực tế 49 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .51 4.1 Kết luận 51 4.2 Kiến nghị 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHỤ LỤC .1 ii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT g : microgam M : micromole/lít BĐG : Biến đổi gen Bp : base pair DNA : Deoxyribonucleic acid dNTP : Deoxynucleotide triphosphate EDTA : Ethylene diaminetetra acetic acid Elisa : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay EU : European Union FMV : Virus dạng mosaic GM : Genetically Modified GMC : Genetically Modified Crop GMO : Genetically Modified Organism ISAAA : Tổ chức quốc tế tiếp thu ứng dụng công nghệ sinh học nông nghiệp IRRI : Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế LOD : Limit of detection mA : miliampe mM : milimol/lít PCR : Polymerase Chain Reaction RNA : Ribonucleic acid Ta : Annealing temperature (nhiệt độ bắt cặp) TBE : Tris-borate-EDTA Tm : Temperature melting U : Đơn vị tính hoạt tính Taq polymerase UV : Ultra Violet V : Volt iii Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC BẢNG SỬ DỤNG Bảng 2.1 Trình tự mồi có sẵn sử dụng nghiên cứu [13] 18 Bảng 2.2 Các chủng vi sinh vật 19 Bảng 2.3 Hóa chất sử dụng tách chiết DNA .22 Bảng 2.4 Chương trình phản ứng PCR .27 Bảng 2.5 Thành phần hóa chất phản ứng PCR 28 Bảng 2.6 Khảo sát đồng thời nồng độ MgCl2 nồng độ mồi tối ưu thành phần phản ứng PCR .33 Bảng 2.7 Chương trình chu kỳ nhiệt phản ứng 33 Bảng 2.8 So sánh kết thử khẳng định 35 Bảng 2.9 Thành phần hóa chất phản ứng Realtime - PCR 36 Bảng 2.10.Chương trình phản ứng Realtime - PCR 37 Bảng 3.1 Kết khảo sát 42 Bảng 3.2 Chương trình nhiệt chạy phản ứng PCR sau tối ưu 43 Bảng 3.3.Thành phần hóa chất sau tối ưu hóa .44 Bảng 3.4.Kết phân tích phát promoter FMV mẫu chuẩn MON89788 5% 44 Bảng 3.5 Kết giá trị đánh giá thông số phương pháp .45 Bảng 3.6 Diễn giải kết điện di .46 iv Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH Hình 1.1 Gạo vàng, loại thực phẩm biến đổi gen có nhiều ưu điểm .4 Hình 1.2 Bản đồ diện tích trồng biến đổi gen giới 2016 theo ISAAA .9 Hình 1.3 Diện tích trồng biến đổi gen giới sau 20 năm 10 Hình 1.4 Tình hình nhập đậu tương quý I năm 2017 [18] 11 Hình 2.1 Kích thước vạch thang 100bp DNA Ladder Plus 19 Hình 2.2 Quy trình tách chiết DNA Kit SureFood PREP Basic Art No S1052 23 Hình 2.3 Các giai đoạn phản ứng PCR [1] .27 Hình 2.4 Các bước kỹ thuật điện di [1] 29 Hình 3.1 Kết điện di tách chiết DNA từ mẫu thị trường .39 Hình 3.2 Kết khảo sát tính đặc hiệu cặp mồi dùng để phát dương tính GMO với chủng vi sinh vật khác 40 Hình 3.3 Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ MgCl2 nồng độ mồi lên phản ứng PCR phát GMO 41 Hình 3.4 Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ MgCl2 nồng độ mồi lên phản ứng PCR phát GMO 41 Hình 3.5 Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ bắt cặp mồi khuôn DNA .43 Hình 3.6 Sơ đồ quy trình phân tích khảo sát mẫu thực tế đề xuất 46 Hình 3.7 Kết khuếch đại Realtime – PCR mẫu chuẩn 48 Hình 3.8 Đường xác định nhiệt độ nóng chảy kết real-time PCR khoảng 80ºC .48 Hình 3.9 Kết chạy điện di sản phẩm Realtime – PCR 49 Hình 3.10 Kết mẫu xét nghiệm GMO thị trường 50 v Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU Công nghệ sinh học phát triển mở nhiều triển vọng cho trồng biến đổi gen Với lợi ích mà trồng biến đổi gen mang lại (kháng sâu bệnh, tăng suất, tăng giá trị dinh dưỡng ), với yêu cầu người ngày tăng vấn đề an ninh lương thực, nâng cao suất, chất lượng trồng đặc biệt đối phó với biến đổi khí hậu Cây trồng biến đổi gen dự báo tiếp tục tăng năm tới [7] Ở Việt Nam, để tạo đà cho phát triển trồng biến đổi gen, nhiều quan nghiên cứu Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long… có nghiên cứu ban đầu như: sàng lọc gen hữu ích, thiết kế vector chuyển gen Tới nay, có báo cáo kết ban đầu nghiên cứu chuyển gen ngô, đậu tương, lúa, bơng Việt Nam cịn hạn chế Công tác nghiên cứu, phát triển trồng biến đổi gen ngày mạnh mẽ hơn, đặc biệt việc khảo nghiệm đánh giá rủi ro đa dạng sinh học môi trường chuyển gen: ngô, vải đậu tương với mục đích làm giống Chính phủ cho phép Tại thị trường Việt Nam, số hạt giống ngô chuyển gen cấp phép có nguồn gốc từ cơng ty Syngenta, DEKALB, Pioneer Hi-bred tính trạng kháng sâu thuốc trừ cỏ, bao gồm Bt11, GA21, bt11xGA21, MON89034, NK603, MON89034xNK603, TC1507[28] Các giống ngô phép trồng khảo nghiệm diện rộng với mục đích làm thức ăn gia súc Mặc dù chưa có khẳng định hợp pháp chứng minh thực phẩm biến đổi gen có hại cho sức khỏe Người tiêu dùng có quyền lựa chọn việc sử dụng không sử dụng thực phẩm biến đổi gen Trước tranh cãi vậy, chọn mua thực phẩm chứng nhận không chứa biến đổi gen (NonGMO) thực phẩm hữu - loại thực phẩm hồn tồn khơng chứa biến đổi gen GMO có chứng nhận hữu cơ, tìm hiểu cách nhận biết, hay phòng tránh thực phẩm biến đổi gen trước có khẳng định thức từ loại thực phẩm Sản phẩm GMO có mặt thị trường Việt Nam chưa kiểm soát chặt chẽ Hiện GMO quy định dán nhãn thị trường Đồ án tốt nghiệp phân tích phát hiện, định lượng nhiều phương pháp khác có phương pháp khuếch đại DNA (PCR) Hiện nay, đa số phương pháp sàng lọc GMO dựa trình tự promoter 35SCaMV terminator NOS Để mở rộng thêm trình tự sàng lọc GMO, thực đề tài “Xây dựng phương pháp phát Genetically Modified Organism - (GMO) dựa trình tự promoter 34S-FMV” Đề tài thực Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy Sản vùng  Mục đích nghiên cứu: Xây dựng hồn chỉnh quy trình phát GMO dựa trình tự promoter 34SFMV với thông số giới hạn phát hiện, độ nhạy, độ đặc hiệu đạt yêu cầu sử dụng Phòng kiểm nghiệm Sinh học Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy Sản vùng  Mục tiêu nghiên cứu: Để hoàn thiện phương pháp đáp ứng yêu cầu đưa vào áp dụng thực tế, đề tài bao gồm hai mục tiêu lớn: - Tối ưu thông số để thực phản ứng PCR nồng độ MgCl2, nồng độ primer, nhiệt độ bắt cặp - Xác định thông số phương pháp: LOD50, độ nhạy, độ đặc hiệu, độ xác phương pháp  Nội dung nghiên cứu: - Tách chiết DNA từ mẫu thực phẩm chứa đậu nành biến đổi gen kiểm tra mức độ tinh sản phẩm tách chiết - Khảo sát tối ưu nồng độ primer, nồng độ MgCl2, nhiệt độ bắt cặp mồi nhằm tối ưu hóa phản ứng PCR - Đánh giá hiệu lực sử dụng phương pháp thông qua thông số: LOD, độ nhạy, độ đặc hiệu - Áp dụng quy trình để phân tích số mẫu ngồi thị trường - Một số đề xuất cải tiến phương pháp Đồ án tốt nghiệp 3.4 Đề xuất quy trình khảo sát mẫu thực tế kĩ thuật PCR Hình 3.6 Sơ đồ quy trình phân tích khảo sát mẫu thực tế đề xuất Bảng 3.6 Diễn giải kết điện di Mẫu 100 10-1 + + Trường hợp Mẫu âm Mẫu âm Chứng tách chiết PCR dương - - + 46 Kết Dương tính Đồ án tốt nghiệp + - - - + Dương tính + + + - + Không kết luận + + + - - Không kết luận - - + - + Có thể Âm tính - - + + - Không kết luận - - - - + Âm Tính - + - - + Dương Tính Trong tất trường hợp, mẫu kiểm soát âm phải cho kết âm tính, mẫu kiểm sốt dương cho kết dương tính Khi đó:  Mẫu phân tích (pha lỗng khơng pha lỗng) cho kết dương tính trả lời “Phát sản phẩm biến đổi gen (GMO) với diện trình tự promoter 34S-FMV”  Mẫu phân tích cho kết âm tính trả lời “Khơng phát sản phẩm biến đổi gen (GMO) với diện trình tự promoter 34S-FMV” Ngồi ra, với trường hợp đặc biệt (trường hợp – – – 6), cần thực phân tích lại, có ngoại nhiễm mẫu chứng âm mẫu chứng dương bị ức chế trình PCR (trường hợp – 6) Với trường hợp 5, có ngoại nhiễm, mẫu phân tích cho kết âm tính mẫu chứng dương khơng bị ức chế q trình PCR nên nghi ngờ sản phẩm âm tính Tuy nhiên, cần thực lại q trình phân tích để xác định rõ 3.5 Cải tiến phƣơng pháp phản ứng Realtime – PCR Khảo sát nhằm mục đích thử nghiệm việc phát gen mục tiêu mẫu dương GMO từ đậu nành kỹ thuật RT-PCR Nằm hướng phát triển đề tài, kỹ thuật giúp giảm thời gian thực kết phân tích sớm 47 Đồ án tốt nghiệp hơn, kết hợp với việc đánh giá nhiệt độ nóng chảy giảm thiểu mẫu dương tính giả Khảo sát thực mẫu dịch chiết DNA mẫu dương có nồng độ 5% tinh Tiến hành phản ứng PCR, thành phần phản ứng Bảng 2.9 Chương trình phản ứng Bảng 2.9 Hình 3.7 Kết khuếch đại Realtime – PCR mẫu chuẩn Kết real-time PCR, chứng âm có tín hiệu, nhiên tín hiệu trễ, nghi ngờ nhiễm dimer, cần đánh giá điểm nóng chảy để biết thêm có phải dương tính giả hay khơng Hình 3.8 Đường xác định nhiệt độ nóng chảy kết real-time PCR khoảng 80ºC 48 Đồ án tốt nghiệp Sản phẩm khuếch đại từ dimer primer khác biệt với sản phẩm khuếch đại từ DNA đích chiều dài, từ dimer primer chiều dài khơng vượt 50 – 55bps, từ DNA đích chiều dài thường q 100bps Như vậy, để phân biệt được đường biểu diễn khuếch đại ống phản ứng sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích từ dimer primer, phải dựa vào tính chất đặc trưng giúp phân biệt chiều dài hai loại sản phẩm khuếch đại này, tính chất đặc trưng nhiệt độ chảy (melting To, Tm), nhiệt độ làm cho sợi đơi DNA bị biến tính 50% tức có 50% số sợi đơi bị biến tính hồn tồn Theo kết nhiệt độ chảy trung bình 80,5ºC Mẫu âm có tín hiệu thấp primer hấp thụ sóng huỳnh quang Hình 3.9 Kết chạy điện di sản phẩm Realtime – PCR Với mẫu 1; 2; mẫu chứng dương tách Kit SureFood PREP Basic Art No S1052 cho vạch mục tiêu rõ sáng Có thể thấy chu kỳ nhiệt cặp mồi ổn định chạy Realtime-PCR Từ kết điện di thấy chứng âm dương tính giả 3.6 Kết khảo sát mẫu thực tế Sau hồn thiện q trình tối ưu hóa phản ứng PCR đề xuất quy trình cải tiến phương pháp, tiến hành khảo sát 10 mẫu thị trường Các mẫu lấy từ mẫu xét nghiệm GMO Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy Sản vùng Có kết Hình 3.9 49 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.10 Kết mẫu xét nghiệm GMO thị trường L Thang chuẩn 100bp, mẫu Cà chua, mẫu Gạo, mẫu Nếp, mẫu Khoai tây nghiền, Cám cá, Bắp mỹ, Bột Sắn, Bột Khoai, Đậu nành, 10 Bắp nếp Kết phân tích cho thấy mẫu phân tích âm tính với GMO sau lần lặp lại, có Bắp mỹ hiển thị kết dương tính Bắp mỹ thực phẩm biến đổi gen 50 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận  Kết luận: Trong khuôn khổ đề tài thực hiện, thu kết sau: - Kết tối ưu hóa phản ứng PCR  Khẳng định cặp mồi FMV sử dụng chuyên biệt phát thực phẩm biến đổi gen  Nồng độ MgCl2 tối ưu cho phản ứng PCR 1,5mM  Nồng độ mồi tối ưu cho phản ứng PCR 0,2μM;  Nhiệt độ bắt cặp mồi tối ưu cho phản ứng PCR 60ºC - Kết đánh giá hiệu lực sơ cấp quy trình đề xuất theo tiêu chuẩn ISO 16140-2003 xác định thông số kỹ thuật phương pháp sau:  Giới hạn phát (LOD50) 0,625%;  Độ xác 96,67%;  Độ nhạy 95%;  Độ đặc hiệu 100%;  Tỷ lệ dương tính giả 0%; tỷ lệ âm tính giả 5% Các thơng số nhận cho thấy phương pháp phù hợp để áp dụng phòng kiểm nghiệm - Bước đầu thử nghiệm quy trình phân tích Realtime-PCR - Bước đầu phân tích diện số thực phẩm biến đổi gen thị trường 4.2 Kiến nghị Do giới hạn đề tài nên số điểm chưa nghiên cứu Mặt khác, để kết nghiên cứu áp dụng nhiều vào thực tế, chúng tơi xin có số ý kiến sau: - Khảo sát ổn định phương pháp số mẫu chưa khảo sát đề tài - Khảo sát đánh giá qui trình cải tiến để áp dụng vào thực tế 51 Đồ án tốt nghiệp - Đánh giá quy trình phản ứng Mutiplex Realtime-PCR để phát lúc event (35S-CaMV, t-NOS 34S-FMV) 52 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tài liệu tiếng việt [1] Lê Tấn Thành “Đánh giá đa dạng di truyền cá Tra chọn giống thị phân tử microsatellite”, Luận văn tốt nghiệp trường Đại học Công Nghệ TP.HCM, (2015) [2] Sổ tay hướng dẫn tính tốn thơng số xác nhận giá trị sử dụng phương pháp sinh học phân tử Cục Quản Lý Chất Lượng Nông Lâm Sản Thủy Sản Bộ Nông Nghiệp Phát Triển Nông Thôn Việt Nam [3] TCVN 7605: 2007 Thực phẩm – Phương pháp phân tích để phát sinh vật biến đổi gen sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen [4] TCVN 7608: 2007 Thực phẩm – Phương pháp phân tích để phát sinh vật biến đổi gen sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen – Yêu cầu chung định nghĩa [5] Thông tư liên tịch 45/2015 Hướng dẫn ghi nhãn thực phẩm biến đổi gen bao gói sẵn quy định cách thức ghi nhãn thực phẩm, TTLT-BNNPTNTBKHCN  Tài liệu tiếng anh [6] ISAAA briefs Brookes G, Barfoot P, 2006 [7] The potential of genetically enhanced plants to address food insecurity Nut Research Rev; 17:23–42, Christou P, Twyman RM, 2004 [8] Food and Agriculture Organisation The State of Food Insecurity in the World Rome: FAO; 2001 [9] Engineering plants with increased disease resistance: what are we going to express? Trends Biotech;23:275–82, Gurr SJ, Rushton PJ, 2005 [10] ISO 21569 -2005 / amd1:2013 ( E ) Foodstuffs -Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Qualitative nucleic acid based methods [11] ISAAA Brief is an extension of the 20 Volumes of Annual Briefs (1996 to 2015) on global status of biotech/GM crops authored by Clive James, 2016 53 Đồ án tốt nghiệp [12] In A Grain Of Golden Rice, A World Of Controversy Over GMO Foods, Dr Gerard Barry,2013 [13] Interlaboratory trial validation of an event-specific qualitative polymerase chain reaction-based detection method for genetically modified RT73 rapeseed, Liangwen Pan, Huya Zhang, Tao Yang,2007 [14] The geography and causes of food insecurity in developing countries Agriculture Economics; 22:199–215, Smith LC, El Obeid AE, Jensen HH, 2000 [15] The Soybean Plant: Botany, Nomenclature, Taxonomy, Domestication, and Dissemination by William Shurtleff and Akiko Aoyagi, 2004 [16] WHO, Food safety,2014 [17] World Bank World Development report 2000/2001 Attacking poverty Washington DC: World Bank; 2000  Tài liệu website [18] https://www.customs.gov.vn [19] http://www.vacne.org.vn/nhung-van-de-cua-sinh-vat-bien-doi-gen%E2%80%93-gmo/29453.html [20] http://www.r-biopharm.com/products/food-feedanalysis/gmo/screen/item/surefood-gmo-35s-nos-fmv [21] http://antoansinhhoc.vn/tinh-hinh-phat-trien-cay-trong-bien-doi-gen-trenthe-gioi [22] http://iasvn.org/homepage/Tinh-hinh-nhap-khau-nguyen-lieu-san-xuatthuc-an-chan-nuoi-quy-I2017-9698.html [23] http://antoansinhhoc.vn/tinh-hinh-nghien-cuu-sinh-vat-bien-doi-gen-o-vietnam/ [24] http://pcrvietnam.blogspot.com/2014/10/phuong-phap-real-time-pcr.html [25] https://sites.google.com/site/kysuhodhinhhai/cay-trong-bien-dhoi-gen/lichsu-cay-trong-bien-doi-gen [26] http://www.mard.gov.vn/Pages/news_detail.aspx?NewsId=37520&Page=1 54 Đồ án tốt nghiệp [27] https://happytrade.org/dan-nhan-thuc-pham-bien-doi-gen-GMO-nhin-tu- the-gioi-ve-viet-nam [28] http://www.mard.gov.vn/Pages/news_detail.aspx?NewsId=37520&Page=1 55 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC A Một số hình ảnh chạy điện di cặp mồi event promoter 34S- FMV Hình ảnh điện di kiểm tra LOD50 phát promoter FMV mẫu chuẩn MON89788 5% Hình A1 - Kết 10 mẫu dương tính mẫu chuẩn 5% Hình A2 - Kết mẫu dương tính mẫu chuẩn 2,5% Hình A3 - Kết mẫu dương tính mẫu chuẩn 1,25% Đồ án tốt nghiệp Hình A4 - Kết mẫu dương tính mẫu chuẩn 0,625% Hình A5 - Kết mẫu dương tính mẫu chuẩn 0,3125% Hình ảnh điện di kết đánh giá thông số phương pháp mẫu chuẩn MON89788 5% với 40 mẫu dương tính GMO, 10 mẫu âm tính (Nuclease-Free Water), 10 mẫu dương virus HAV với mật độ 100PFU/µl Hình A6 - Kết 10 mẫu âm tính (Nuclease-Free Water) Đồ án tốt nghiệp Hình A7 - Kết 10 mẫu âm tính với chủng Virus HAV Hình A8 - Kết 10 mẫu dương tính với mẫu chuẩn GMO 5% Hình A9 - Kết 10 mẫu dương tính với mẫu chuẩn GMO 5% Đồ án tốt nghiệp Hình A10 - Kết 10 mẫu dương tính với mẫu chuẩn GMO 5% Hình A11 - Kết mẫu dương tính với mẫu chuẩn GMO 5% Đồ án tốt nghiệp B Danh mục Cấp Giấy xác nhận thực vật biến đổi gen.[28] ... PCR phát điện di gel agaroza (Phụ lục B, TCVN 7605:2005) Phát trình tự DNA có nguồn gốc từ đoạn khởi động (promoter) FMV 34S cải dầu GM RT73 Do promoter 34S- FMV có mặt số thực vật biến đổi gen. .. áp dụng phương pháp sàng lọc Phát trình tự DNA có nguồn gốc từ đoạn khởi động (promoter) 35S virus khảm súp lơ (CaMV): Do promoter 35S-CaMV có mặt số thực vật biến đổi gen Đoạn DNA 195bp promoter. .. nhiên Ví dụ q trình lai xa cỏ dại với trồng biến đổi gen có họ hàng tạo lồi cỏ dại mang gen biến đổi Sinh vật biến đổi gen có nhiều loại khác Nó dịng lúa mỳ thương mại có gen bị biến đổi tia điện