Xây dựng qui trình phát hiện nhanh Listeria monocytogenes bằng kĩ thuật khuếch đại đẳng nhiệt Recombinase polymerase amplification (RPA)

NTTU-NCKH-04 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TƠNG KÉT ĐÈ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN Bộ - GIẢNG VIÊN 2020 Tên đề tài: Xây dựng qui trình phát nhanh Listeria monocytogenes kĩ thuật khuếch đại đẳng nhiệt Recombinase polymerase amplification (RPA) Số hợp đồng: 2020.01.015/HĐ-KHCN Chủ nhiệm đề tài: Trần Thị Hậu Đơn vị công tác: Viện Kĩ thuật Công nghệ cao NTT Thời gian thực hiện: 03/2020 - 08/2020 TP Hồ Chỉ Minh, ngày 14 tháng 12 năm 2020 MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH ẢNH ii MỞ ĐẦU.’ CHƯƠNG I TÓNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi khuân Listeria monocytogenes 1.1.1 Đặc điêm hình thái ni 1.1.2 Đặc tính sinh hóa 1.1.3 Cấu trúc kháng nguyên độc tố 1.1.4 Khả gây bệnh 1.2 Tông quan phuơng pháp RPA 1.2.1 Giới thiệu chung 1.2.2 Thành phần phản ứng RPA 1.2.3 Nguyên tăc phản ứng 1.3 Tống quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực cùa đề tài 1.3.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 1.3.2 Tình hình nghiên cứu nước CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cúu 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 2.2 Vật liệu nghiên cứu 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu .9 2.2.2 Thiêt bị dụng cụ thí nghiệm 2.2.3 Hóa chât dùng thí nghiệm 10 2.3 Phương pháp nghiên cứu 11 2.3.1 Tăng sinh tách chiêt DNA hệ gen vi khuân L monocytogenes 11 2.3.2 Đo độ tinh nồng độ DNA 12 2.3.3 Phản ứng PCR 12 2.3.4 Phản ứng RPA 13 2.3.4.1 Khảo sát nhiệt độ thời gian tối ưu cho phản ứng RPA 15 2.3.4.2 Khảo sát độ đặc hiệu phản ứng RPA phát L monocytogenes 15 2.3.4.3 Khảo sát độ nhạy phản ứng RPA 15 2.3.5 Phương pháp điện di gel agarose 15 CHƯƠNG III KET QUẢ VÀ THAO LUẬN 16 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 Ket tách chiết DNA tong số vi khuẩn Listeria monocytogenes 16 Thiết kế mồi cho phản ứng RPA 16 Phản ứng RPA phát L monocytogenes 17 Khảo sát điêu kiện phản ứng RPA 18 Độ đặc hiệu phản ứng RPA phát L monocytogenes 19 Độ nhạy phản ứng RPA phật L monocytogenes 20 CHƯƠNG iv KET LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 21 TÀI LIỆU THAM KHẢÒ 22 DANH MỤC CHỮ VIẾT TÁT ATTP An toàn thực phẩm BHI Brain Heart Infusion BYT Bộ YTế CDC Centers for Disease Control and Prevention CFU Colony forming unit CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide DNA Deoxyribonucleic acid LAMP Loop Mediated Isothermal Amplification LF Lateral Flow L monocytogenes Listeria monocytogenes LSA Listeria selective agar OD Optimal density PCI Phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol PCR Polymerase Chain Reaction ỌCVN Quy chuẩn Việt Nam RPA Recombinase Polymerase Amplification SDA Strand displacement amplification SSB Single-strand binding proteins Taq polymerase Thermus aquaticus polymerase TBE Tris-Borate-EDTA DANH MỤC BẢNG Bảng Các thiết bị dụng cụ thí nghiệm Bảng 2 Các hóa chất dùng thí nghiệm .10 Bảng Thành phần phản ứng PCR .13 Bảng Các thành phần phản ứng RPA 14 Bảng Trình tự moi RPA sử dụng nghiên cứu 17 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Sơ đồ qui trình bước tiến hành nghiên cứu 11 Hình 2 Chu trình nhiệt cùa phản ứng PCR 13 Hình Ket thử nghiệm PCR RPA DNA L monocytogenes 17 Hình Kết khảo sát nhiệt độ thời gian phản ứng RPA 18 Hình 3 Ket xác định độ đặc hiệu phản ứng RPA 19 Hình Ket khảo sát độ nhạy phản ứng RPA 20 ii TÓM TÁT KẾT QUẢ NGHIÊN cứu STT Kết đạt Công việc thực Thiết kế mồi cho phản ứng RPA Cặp mồi phát trình tự gen hly phát nhanh L vi khuẩn L monocytogenes monocytogenes Khảo sát nhiệt độ, thời gian cho Nhiệt độ thời gian tối ưu cho thực phản ứng RPA phản ứng 39 °C 25 phút Khảo sát độ nhạy, độ đặc hiệu Độ đặc hiệu: Khơng khuếch đại trình phản ứng tự DNA cùa vi khuẩn đường ruột khác Độ nhạy cao, phát tối thiếu 310 fg/ul DNA vi khuẩn STT Sản phẩm đạt Sản phẩm đăng ký Qui trình phát vi khuẩn Qui trình phát vi khuân Listeria Listeria monocytogenes monocytogenes Bài báo khoa học Bài báo khoa học đăng tạp chí khoa học cơng nghệ Nguyễn Tất Thành Thời gian thực hiện: 03/2020 - 08/2020 Thời gian nộp báo cáo: Tháng 12/2020 iỉi MỞ ĐẦU Listeria monocytogenes nhóm vi khuấn đường ruột gây ngộ độc thực phẩm nguy hiếm, có khả gây tử vong cho người bị nhiễm Thông thường việc xác định L monocytogenes thực phẩm hầu hết dựa phương pháp truyền thống nuôi cấy vi sinh kết hợp với thử nghiệm sinh hóa, miễn dịch sử dụng phản ứng chuồi polymerase (PCR) phương pháp biến Tuy nhiên, phương pháp thực với qui trình phức tạp, tốn nhiều thời gian phụ thuộc điều kiện phịng thí nghiệm Nhiều nghiên cứu gần cho thấy việc sử dụng phương pháp PCR khuếch đại đẳng nhiệt để phát tác nhân virus, vi khuẩn gây bệnh có nhiều lợi so với phương pháp phát truyền thống Trong đó, RPA (Recombinase Polymerase Amplification) phương pháp có ưu điểm trội Đặc biệt, RPA nhanh nhạy đe khuếch đại trình tự DNA mục tiêu nhiệt độ tương đối thấp (37 - 42 °C) thời gian ngắn (20 - 30 phút) so với phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt khác Do đó, chúng tơi thực đề tài “Xây dựng qui trình phát nhanh Listeria monocytogenes kĩ thuật khuếch đại đẳng nhiệt Recombinase polymerase amplification (RPA)” để phát nhanh L monocytogenes, tạo tiền đề để mở rộng khả ứng dụng phương pháp RPA lĩnh vực nghiên cứu thực tiễn Nghiên cứu tiến hành theo nội dung: nuôi cấy, tăng sinh chùng vi khuẩn L monocytogenes, tách chiết DNA hệ gen Vùng gen mục tiêu vi khuẩn xác định thông qua q trình sàng lọc phân tích thơng tin từ báo khoa học liên quan Từ thiết kế mồi phù hợp để nhận diện cách đặc hiệu DNA đặc trưng vi khuẩn L monocytogenes DNA bước tách chiết dùng làm vật liệu cho nghiên cứu bao gồm phương pháp PCR RPA khuếch đại trình tự gene mục tiêu, sử dụng cặp mồi thiết kế Từ đó, xác định điều kiện toi ưu cho phản ứng đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu phản ứng RPA Sản phẩm phản ứng PCR RPA sè xác định phương pháp điện di gel agarose Ket nghiên cứu cho thấy, so với PCR, RPA phát L monocytogenes khơng cần chu trình nhiệt phức tạp, phản ứng có the xảy nhiệt độ 39 °C thời gian 25 phút khơng có phản ứng chéo với DNA số vi khuẩn khác RPA phát DNA vi khuấn nồng độ 310 fg/pL, nhạy gấp 1000 lần so với phản ứng PCR Phương pháp RPA có the sử dụng kĩ thuật phân tử phát nhanh, nhạy hiệu vi khuẩn L monocytogenes thay cho kĩ thuật phát truyền thống phương pháp tiềm cho ứng dụng phát bệnh chồ CHƯƠNG I TỐNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi khuấn Listeria monocytogenes L monocytogenes gây bệnh Listeriosis, phân lập lần Murray năm 1924 bệnh Listeriosis thức cơng nhận bệnh ngộ độc thực phấm vào đầu năm 1980(1) Bệnh Listeriosis xảy với tỉ lệ mắc bệnh vào khoảng 0,7/100000 người nhiễm có thê gây hậu nghiêm trọng tỉ lệ tử vong cao (20 - 30 %) so với bệnh gây vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm khác (2) L monocytogenes thường tìm thấy đất, thực vật, phân động vật L monocytogenes có thời gian sống lâu phát triển nhiệt độ từ °C đến 45 °C, tăng trưởng chậm tủ lạnh nhiệt độ °C (3) Một số loại thực phấm quen thuộc người tiêu dùng liên quan đen nhiễm khuan L monocytogenes pa tê, thịt tươi sống thịt đông lạnh, gà vịt, rau tươi, hải sản (4) Đặc biệt, L monocytogenes có nhiều sữa chưa tiệt trùng sản phẩm từ sữa chưa tiệt trùng, phô mai mềm Theo quy chuẩn ỌCVN 8-3:2012/BYT, giới hạn ô nhiềm vi khuan L monocytogenes sữa sản phẩm sừa dùng 102 CFƯ/g (CFU/ml) số mẫu tối đa cho phép có kết kiếm nghiệm nằm giới hạn (5) 1.1.1 Đặc điểm hình thái ni cấy L monocytogenes trực khuan Gram dương, ngắn, hai đầu trịn Trong mơi trường ni cấy, tế bào vi khuẩn giai đoạn non, chúng tìm thấy dạng trực khuẩn, giai đoạn trễ hơn, dạng hình cầu chiếm ưu thế, đơi vi khuẩn xếp thành dạng chuồi ngắn, dễ gây nhầm lần với Streptococci Vi khuẩn L monocytogenes không sinh bào tử có khả di động, 20 - 25 °C chúng có khả di động mạnh (6) L monocytogenes vi khuấn kỵ khí tùy nghi, dề mọc môi trường nuôi cấy thông thường, pH thích hợp 7,2 - 7,4, nhiệt độ sinh trưởng thích hợp 37 °C, bên cạnh đó, chúng vần có khả sống sót điều kiện lạnh đơng phát triển chậm nhiệt độ °C Môi trường thường sử dụng nuôi cay L monocytogenes môi trường thạch máu, sau 48 nuôi cấy cho khuấn lạc trịn bóng, màu trắng, đường kính 0,5 - mm, có vịng tan máu nhẹ Trên mơi trường Trytose agar, vi khuẩn tạo khóm sáng, trắng mờ có màu xanh lam quan sát ánh sáng nghiêng Trên môi trường Listeria selective agar (LSA), khuấn lạc có vịng đen quanh khóm phân giải esculine sau 24 - 48 (6) 1.1.2 Đặc tính sinh hóa L monocytogenes có khả lên men chậm loại đường glucose, rhamnose, salicin, levulose Không lên men mannitol, xylose, lactose, saccarose Phản ứng catalaza dương tính, thủy phân esculine, urease âm tính, H2S âm tính (6) 1.1.3 Cấu trúc kháng nguyên độc tố Cấu trúc kháng nguyên L monocytogenes phức tạp, dựa kháng nguyên o kháng nguyên lông H, L monocytogenes chia thành kiểu huyết I, II, III, IV, đó, chủng gây bệnh thường gặp thuộc kiểu huyết I IV Vi khuẩn L monocytogenes không tiết ngoại độc tố sản sinh nội độc tố gây hoại tử, cytolysin có tác dụng diệt tế bào Trên bề mặt tế bào vi khuẩn cịn có lipopolysaccharid gây độc thỏ (6) 1.1.4 Khả gây bệnh L monocytogenes gây bệnh người động vật người, đối tượng có nguy nhiềm khuẩn L monocytogenes cao phụ nữ mang thai, trẻ em, người già người suy giảm hệ miễn dịch Ngộ độc thực pham L monocytogenes gây hậu nghiêm trọng gây trụy thai thai chết phụ nữ có thai xâm nhập vào máu gây nhiễm trùng máu lây lan sang hệ thần kinh gây viêm màng não L monocytogenes gây bệnh thể ẩn phổ biến Các triệu chứng nhiễm khuẩn thường biểu sau vài ngày, vài tuần, đến vài tháng sau nhiễm với triệu chứng phổ biến như: sốt, tiêu chảy, buồn nôn, đau cơ, mệt mỏi, đơi có ớn lạnh, có the xuất triệu chứng bị cảm cúm phụ nữ có thai thường biểu sốt, hội chứng giả cúm, nhiễm khuẩn tiết niệu Bệnh hồn tồn khơng có biểu người mẹ gây nhiễm cho thai nhi qua đường thai dẫn tới sẩy thai hay sinh non trẻ đời mắc bệnh Trường họp nhiễm khuẩn huyết, bệnh nhân thường sốt cao, rét run hạ thân nhiệt, rối loạn nhịp tim, khó thở, trường họp nguy hiểm với khả tử vong cao (7) 1.2 Tổng quan phương pháp RPA 1.2.1 Giới thiệu chung Ngày nay, phương pháp khuếch đại đăng nhiệt dựa phương pháp PCR truyền thống quan tâm phát triển sử dụng rộng rãi khoa học phương pháp khuếch đại đăng nhiệt trung gian vịng lặp (LAMP), khuếch đại dựa trình tự axit nucleic (NASBA), khuếch đại phụ thuộc helicase (HDA), khuếch đại đẳng nhiệt dùng tổ họp enzyme (RPA) khuếch đại vòng tròn (RCA) (8), (9) Các phương pháp thừa hưởng đặc tính PCR truyền thống độ xác, đặc hiệu cao khắc phục nhược diêm thời gian thực máy gia nhiệt đắt tiền phịng thí nghiệm Trong số phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt trên, RPA giới thiệu lần vào năm 2006, kĩ thuật khuếch đại DNA đến mức phát thời gian ngắn nhiệt độ thấp so với kĩ thuật đắng nhiệt lại (10) RPA xác định tác nhân gây bệnh cách xác, nhanh chóng nhờ vào ưu điểm bước chuẩn bị mẫu đơn giản, nhiệt độ hoạt động thấp (37 - 42 °C), tiện lợi có sằn thuốc thử đơng khơ Vì the, RPA phương pháp tiềm lình vực chấn đoán lâm sàn với khả ứng dụng chỗ mà không yêu cầu trang thiết bị phức tạp điều kiện phịng thí nghiệm nghiêm ngặt 1.2.2 Thành phần phản ứng RPA Phản ứng RPA xảy dựa hoạt động ba protein bao gom: protein tái tổ họp RecA recombinase (£ coli RecA), protein liên kết DNA sợi đơn (SSB) DNA polymerase hoạt động kéo dài mồi tong họp mạch khuếch đại (Sau polymerase) Những protein thành phần trình tự tổng hợp DNA, tái tổ họp, sửa chừa DNA trình tái to họp mạch tương đồng Các protein đong yếu tố hồ trợ trình phản ứng RPA protein T4 UvsY- yếu tố tải recombinase hồ trợ RecA trình hình thành sợi nucleoprotein Polyethylene glycol đại phân tử có trọng lượng phân tử cao hoạt động chất làm đông Creatine kinase sử dụng phosphocreatine để tạo ATP cung cấp cho enzyme hệ thống 3.6 Độ nhạy ciia phản ứng RPA phát L monocytogenes Độ nhạy phương pháp RPA phát L monocytogenes phân tích cách thực qui trình phản ứng RPA xác định với dãy nồng độ pha loãng thập phân mẫu DNA tổng số tách chiết từ 310 ng/pl đến 3,1 fg/pl Kết điện di (Hình 3.4B) cho thấy: với nồng độ DNA pha loãng từ 3,1 ng/ pl đen 310 fg/pl (Giếng 1-5, hình 3.4B), phản ứng dương tính cho kích thước sản phấm band điện di với kích thước sản phẩm mong muốn, độ sáng band điện di giảm dần tỉ lệ thuận với độ giảm dãy pha loãng nồng độ DNA Từ nồng độ DNA 31 fg/pl (Giếng 6, hình 3.4B), hình ảnh điện di khơng cịn sản phẩm phản ứng RPA xuất Trong phản ứng PCR với mầu pha loãng cho kết phát DNA từ 310 ng/pl đến 310 pg/pl (Giếng 1-4, hình 3.4A) Do đó, nghiên cứu nồng độ DNA L monocytogenes tối thiểu mà phản ứng RPA phát 310 fg/pl, cho độ nhạy cao gấp 1000 lần phản ứng PCR truyền thống Từ chứng tỏ cặp mồi sử dụng có độ nhạy cao, bắt cặp khuếch đại đoạn gen mong muốn nồng độ DNA mạch khuôn thấp mà phản ứng PCR không phát Nghiên cứu trước dựa phương pháp RPA để khuếch đại trình tự gen mong muốn vi khuẩn L monocytogenes cho thấy phản ứng có độ nhạy cao, có thê phát mục tiêu nồng độ DNA từ vài chục fentogram (28) Do đó, nghiên cứu lần khẳng định khả phát nhạy bén trình tự mục tiêu phương pháp khuếch đại đăng nhiệt RPA Hình Ket khảo sát độ nhạy cùa phàn ứng RPA cho phát L monocytogenes (A) Ket khảo sát giới hạn phát phàn ứng PCR; (B) Ket quâ khảo sát giới hạn phát cùa phản ứng RPA; M: Thang 25 bp 20 CHƯƠNG IV KÉT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Phương pháp RPA thiết lập nghiên cứu cho kết phát L monocytogenes xác thời gian thực phản ứng vòng 25 phút nhiệt độ on định 39 °C không cần chu trình nhiệt độ phức tạp phưong pháp PCR Phản ứng RPA thiết lập có độ đặc hiệu cao, khơng khuếch đại trình tự DNA vi khuẩn khác Phản ứng RPA nhạy phản ứng PCR 100-1000 lần, phát lượng nhỏ DNA vi khuan L monocytogenes phản ứng PCR không phát So sánh phương pháp RPA với phương pháp PCR truyền thống, RPA đơn giản, dễ thực cho lợi ích vượt trội mặt thời gian Tuy nhiên, thực tế, nhiều yếu tố cần đánh giá tối ưu để khai thác giá trị ứng dụng phương pháp RPA đánh giá khả phát trực tiếp tế bào vi khuấn mà không cần bước tách chiết DNA; tối ưu phương pháp đọc kết nhanh rút ngắn thời gian cho tồn q trình thử nghiệm Nhiều nghiên cứu ngồi nước thực thành cơng phương pháp RPA tế bào vi khuẩn không tách chiết hay kết hợp phương pháp RPA với phương pháp đọc kết khác rút ngắn thời gian thử nghiệm cho kết nhanh chóng (22,23) Do đó, nghiên cứu cần thêm thời gian đe xác định khả ứng dụng thực tiền tối ưu thời gian thực phương pháp RPA Chủ nhiệm đề tài 21 TÀI LIỆU THAM KHẢO Schlech WF 3rd, Lavigne PM, Bortolussi RA, Allen AC, Haldane E V, Wort AJ, et al Epidemic listeriosis-evidence for transmission by food N Engl J Med, 1983 308(4):203-6 Bertrand s, Ceyssens PJ, Yde M, Dierick K, Boyen F, Vanderpas J, et al Diversity of Listeria monocytogenes strains of clinical and food chain origins in Belgium between 1985 and 2014 PLoS One 2016 11(10): 1-16 Gasanov u, Hughes D, Hansbro p Methods for the isolation and identification of Listeria spp and Listeria monocytogenes' A review FEMS Microbiol Rev, 2005 29:851-75 Doumith M, Buchrieser c, Glaser p, Jacquet c, Martin p Differentiation of the major Listeria monocytogenes serovars by multiplex PCR J Clin Microbiol 2004 42(8):3819-22 BYT ỌCVN 8-3: 2012/BYT-Quy chuẩn kĩ thuật quốc gia Li w, Bai L, Fu p, Han H, Liu J, Guo Y The Epidemiology of Listeria monocytogenes in China Foodborne Pathog Dis 2018 15(8):459-66 Ramaswamy V, Cresence VM, Rejitha JS, Lekshmi MU, Dharsana KS, Prasad SP, et al Listeria - Review of epidemiology and pathogenesis J Microbiol Immunol Zrt/bci, 2007 40(1 ):4—13 Craw p, Balachandran w, Zanoli LM, Spoto G Isothermal amplification methods for the detection of nucleic acids in microfluidic devices Biosensors, 2013 3(1): 18- 43 Craw p, Balachandran w Isothermal nucleic acid amplification technologies for point-of-care diagnostics: A critical review Lab Chip, 2012 12( 14):2469-86 10 Piepenburg 0, Williams CH, Stemple DL, Armes NA DNA detection using recombination proteins PLoS Biol, 2006 4(7): 1115-21 11 Daher RK, Stewart G, Boissinot M, Bergeron MG Recombinase Polymerase Amplification for Diagnostic Applications Clin Chern, 2016 62(7):947-58 12 Gõksoy EÔ, Kaya o Detection of Listeria monocytogenes by using PCR in Helix 22 pomatia 2006 30:375-80 13 Swetha cs, Babu AJ, Rao TM Detection of Listeria monocytogenes in Milk and Ice Cream byPolymerase Chain Reaction 2016 (May) 14 Si OERDÕ, Zakmar KS, Eichart OR, Zili zs, Ảszló NL Rapid detection of Listeria monocytogenes in raw milk and soft cheese by a redox potential measurement based method combined with real-time PCR 2014 62(July):304—16 15 Donoso w, Castro RI, Guzman L, Lopez-cabana z, Nachtigall FM, Santos LS Fast detection of Listeria monocytogenes through a nanohybrid quantum dot complex 2017 16 Alhogail s, Zourob M, Jordan A Rapid calorimetric sensing platform for the detection of Listeria monocytogenes foodbome pathogen Biosens Bioelectron 2016 17 Huang w, Li L, Chen c, Chen X Fluorescence immunosorbent assay for quantitative detection of Listeria monocytogenes Wei Sheng Yan Jia, 2019 48:279-94 18 Liu H bin, Zang YX, Du X jun, Li p, Wang s Development of an isothermal amplification-based assay for the rapid visual detection of Salmonella bacteria J Dairy Sci [Internet], 2017 100(9):7016-25 19 Geng Y, Tan K, Liu L, Sun XX, Zhao B, Wang J Development and evaluation of a rapid and sensitive RPA assay for specific detection of Vibrio parahaemolyticus in seafood BMC Microbiol, 2019 19(1): 1-9 20 Frimpong M, Ahor HS, Wahed AA El, Agbavor B, Sarpong FN, Laing K, et al Rapid detection of mycobacterium ulcerans with isothermal recombinase polymerase amplification assay PLoS Negi Trap Dis, 2019 13(2): 1-14 21 Miao F, Zhang J, Li N, Chen T, Wang L, Zhang F, et al Rapid and sensitive recombinase polymerase amplification combined with lateral flow strip for detecting African swine fever virus Front Microbiol, 2019 10(MAY):l-7 22 Rames EK, Macdonald J Rapid assessment of viral water quality using a novel recombinase polymerase amplification test for human adenovirus Appl Microbiol Biotechnol, 2019 23 Du XJ, Zang YX, Liu H Bin, Li p, Wang s Recombinase Polymerase Amplification 23 Combined with Lateral Flow Strip for Listeria monocytogenes Detection in Food J Food Sei, 2018 83(4): 1041-7 24 Harris LD, Griffith JD Formation of D Loops by the UvsX Protein of T4 Bacteriophage: A Comparison of the Reaction Catalyzed in the Presence or Absence of Gene 32 Protein Biochemistry, 1988 27( 18):6954-9 25 Cục ATTP-BỘ Y tế Sử dụng kì thuật polymerase chain reaction (PCR) khảo sát thử nghiệm nguy nhiễm Listeria monocytogenes số thực phấm thị truờng Hà Nội 2009 26 Ngọc N, Huy B, Đăng QQ, Chuơng NH, Đại T, Hồ TP, et al Xây dựng qui trình phát đồng thời Plasmodium falciparum Plasmodium vivax dựa kĩ thuật recombinase polymerase amplification 2018 60( 12):7—13 27 Nguy M Kĩ thuật chẩn đoán bệnh hại 2018 :61 -4 28 Eid c, Santiago JG Assay for: Listeria monocytogenes cells in whole blood using isotachophoresis and recombinase polymerase amplification Analyst, 2017 142(1 ):48-54 24 PHỤ LỤC MINH CHỨNG ĐI KÈM SẢN PHẤM DẠNG 2: Qui trình phát L monocytogenes phương pháp khuếch đại đăng nhiệt RPA 25 Phát nhanh Listeria monocytogenes kĩ thuật khuếch đại đẳng nhiệt Recombinase polymerase amplification (RPA) Trần Thị Hậu*, Trần Hồng Diễm, Phùng Thị Thu Hường Viện Kĩ thuật Công nghệ cao NTT, Trường ĐH Nguyền Tất Thành, TP Hồ Chí Minh *Tác già liên hệ: tthau@,ntt.edu.vn Mã đề tài: 2020.01.015 TÓM TẤT Listeria monocytogenes vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm phổ biến, có khả dần đến tử vong cho người nhiềm khuẩn Thơng thường, L monocytogenes phát kĩ thuật vi sinh truyền thống phương pháp sinh học phân tữ phổ biến Polymerase Chain Reaction (PCR) Tuy nhiên, khã ứng dụng thực tế lâm sàng cùa kĩ thuật bị hạn che ton mật thời gian yêu cầu nghiêm ngặt thiết bị điều kiện phịng thí nghiệm Do đó, phương pháp đơn giàn hiệu cần thiết cho phát nhanh L monocytogenes Trong nghiên cứu này, phương pháp khuếch đại nhiệt Recombinase Polymerase Amplification (RPA) xây dựng đế phát nhanh đặc hiệu L monocytogenes Ket nghiên cứu cho thấy, phàn ứng RPA xảy nhiệt độ 39°c thời gian 25 phút RPA phát DNA vi khuẩn nồng độ tối thiếu 310fg/pl, nhạy gấp 1000 lần so với phán ứng PCR thông thường Phương pháp RPA xây dựng nghiên cứu có tiềm trở thành kĩ thuật phân tữ phát nhanh trực tiếp vi khuấn L monocytogenes thay the cho phương pháp phát truyền thong ĐẬT VÁN ĐÈ Listeria monocytogenes thuộc nhóm loại vi khuấn đường ruột phố biến, tác nhân gây ngộ độc thực phẩm nguy hiềm gây bệnh Listeriosis người, bệnh xảy tỷ lệ nhập viện tứ vong cao[ ] L monocytogenes thường tìm thấy sữa tươi chưa tiệt trùng phơ mai mềm Bên cạnh đó, việc tiêu thụ loại thực phẩm tìr thịt chế biến sẵn, bão quản bàng cách trữ mát trữ đông yeu to nguy gây nhiềm khuẩn Theo báo cáo cùa Tổ chức Y tế giới (WHO), đợt bùng phát bệnh Listeriosis xảy Nam Phi năm 2018 với 978 trường hợp xác nhận nhiễm khuẩn L monocytogenes[Z\ Hầu hết trường họp nhiễm khuấn trẻ sơ sinh, phụ nữ có thai, người già người suy giâm miền dịch Tại Việt Nam, phân tích trường hợp mắc bệnh viêm màng L monocytogenes người lớn cho thấy hậu nghiêm trọng cũa việc nhiềm khuẩn L monocytogenes[3] L monocytogenes phát phương pháp vi sinh truyền thống kĩ thuật nhân bàn acid nucleic, phổ biến PCR Phương pháp nuôi cấy vi sinh truyền thống để phát L monocytogenes tốn thời gian phức tạp địi hịi mơi trường ni cấy thích họp cho phát triền L monocytogenes\Ạ] Hơn nữa, so xét nghiệm sinh hoá yêu cầu thực đe xác định xác diện L monocytogenes trước phân lập chũng[5] Trong thập ký gần đây, kĩ thuật PCR nhân bàn acid nucleic sừ dụng rộng rãi phát nhiều tác nhân vi rút, vi khuẩn gây bệnh khác nhờ vào ưu điểm bật độ nhạy độ tin cậy xét nghiệm mang lại[6] Tuy nhiên, qui trình thực PCR yêu càu chu trình nhiệt phức tạp với trang thiết bị đắt tiền kĩ thuật viên có kinh nghiệm Từ hạn chể cùa phương pháp chứng tỏ khả ứng dụng xét nghiệm lâm sàng chúng để phát L monocytogenes điều kiện thiếu thốn trang thiết bị không khã thi Gần đây, phương pháp khuếch đại đắng nhiệt dựa kĩ thuật PCR nghiên cứu ứng dụng rộng rãi phân tích mầm bệnh vi sinh vật nhằm loại bỏ bước vịng ln nhiệt q trình khuếch đại[7—9] Trong đó, RPA đánh giá phương pháp có nhiều ưu điềm noi trội độ đặc hiệu độ nhạy cao với giới hạn phát lí tưởng Hơn nữa, qui trinh thực RPA nhanh chóng đơn giàn, chi sữ dụng mồi thiết ke đặc hiệu nhiệt độ thấp khoáng 37°c - 42°c đề phàn ứng hoạt động RPA nhân bán đoạn DNA mục tiêu bang cách gắn ket moi với trình tự DNA mục tiêu nhờ enzyme recombinase RecA cấu trúc tạo on định bang protein SSB, ngăn ngừa tách cùa mồi khỏi mạch khn mồi kéo dài đe hình thành mạch nhờ enzyme DNA polymerase[10] Thực tế, RPA ứng dụng phát vi sinh gây bệnh nước, thực phấm trong trọt, chăn nuôi Ờ Việt Nam, RPA phương pháp khuếch đại đắng nhiệt khác chưa ứng dụng phồ biến, dịch bệnh vi sinh vật gây mối lo toàn xã hội Trong nghiên cứu này, xây dựng qui trình RPA nhàm phát nhanh vi khuẩn L monocytogenes với mong muốn góp phần vào xây dựng cơng cụ kiếm soát ngăn chặn nguy bùng phát ngộ độc thực phấm diện rộng Việt Nam VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nuôi cấy tách chiết DNA vi khuẩn L monocytogenes chủng vi khuẩn đường ruột phổ biến bao gom Salmonella enterica, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Bacillus cereus, Vibrio parahaemolyticus cung cap Phịng thí nghiệm vi sinh thuộc Viện Kĩ thuật Cơng nghệ cao NTT, trường Đại học Nguyễn Tất Thành Chúng L monocytogenes nuôi cấy môi trường lỏng Brain Heart Infusion (BHI) (HiMedia, Án Độ) vô trùng, lắc 180 vòng/phút qua đêm 37°c Iml dung dịch tăng sinh L monocytogenes li tâm thu tế bào, sau bo sung SOOul CTAB có chứa 2% CTAB, lOOmM Tris-HCL (pH = 8), 20mM EDTA (pH = 8), 1,4M NaCl (Bio Basic, Canada), ú 65°c Li tâm 14000 vòng/phút 4°c 15 phút để thu hồn hợp tách chiết có chứa DNA vi khuấn Các thành phần không mong muốn hồn hợp polysaccharide, protein loại bò bang bước rữa Phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol (PCI) (25: 24: 1), li tâm lạnh thu lớp địch DNA tũa cồn 99% theo ti lệ 1: 2,5 Tủa DNA hoà tan 50pl nước sinh học phân tữ bảo quàn -20°C sứ dụng Độ tinh nồng độ DNA xác định thông qua phương pháp đo quang sứ dụng máy Jenway Genova Plus Cuvet Traycell hellma Analytics 10X Thiết kê môi Moi RPA thiết ke đặc hiệu theo hướng dần TwistDx (Cambridge, Mỹ) đe nhận diện vùng gen hly vi khuẩn L monocytogenes[\ 1] Trình tự mục tiêu (CP023861.1) tài từ Genbank Độ đặc hiệu mặt lí thuyết cặp mồi kiểm tra bang phần mềm NCBI Blast Trinh tự mồi sau thiết ké gửi tong họp Integrated DNA Technologies 1DT (Singapore) Thiết lập phán ứng PCR Phàn ứng PCR thiết lập với tổng tích 20pl bao gồm thành phần: 0,4 pM mồi mồi, 4j.ll 5X Mytaq reaction buffer (Bioline, Mỹ), 0,2p MyTaq DNA polymerase (Bioline, Mỹ), lượng nước sinh học phân tữ vừa đù pl DNA mạch khuôn Phán ứng PCR vận hành theo chu trình ln nhiệt với bước biến tính 95°c, giai đoạn mồi bất cặp với trinh tự mạch khuôn 58°c giai đoạn kéo dài mồi 72°c Sân phẩm PCR phát phương pháp điện di gel agarose 1,5% Thiết lập phán ứng RPA Phản ứng RPA thiết lập theo qui trình cung cấp TwistDx (Cambridge, Mỹ) 50pl hồn hợp phản ứng chuấn bị tube 0,2ml với 2,4|11 mồi mồi loại nồng độ lOpM, 29,5pl rehydration buffer, 2pl DNA mạch khuôn, 2,5 pl magnesium acetate lượng nước sinh học phân tữ vừa đũ Các phán ứng ủ máy ú nhiệt khô BioSan Dry - Bio TDB-100 nhiệt độ 39°c 25 phút Sau kết thúc phán ứng, bổ sung 50pl PCI vào tube, vortex li tâm 14000 vòng/phút phút, thu dịch điện di gel agarose 1,5% Khảo sát nhiệt độ thời gian cho phản ứng RPA Đố xác định nhiệt độ thời gian mà phàn ứng RPA hiệu nhất, phàn ứng khảo sát nhiệt độ 35°c, 37°c, 39°c, 41 °C khoáng thời gian 15, 20, 25 30 phút Két khão sát quan sát báng điện di gel agarose 1,5% Phân tích độ đặc hiệu phán ứng RPA DNA tách chiêt cũa chúng vi khuân Salmonella enterica, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Bacillus cereus, Vibrio parahaemolyticus sữ dụng làm vật liệu khuôn đe khảo sát độ đặc hiệu cũa phàn ứng RPA phát L monocytogenes Phàn ứng thực điều kiện nhiệt độ thời gian khào sát Ket kết luận dương tính có sàn phẩm khuếch đại tạo điện di gel agarose Phân tích độ nhạy cùa phán ứng RPA DNA mạch khn pha loãng nước sinh học phân từ theo dãy thập phân với nồng độ DNA giám dần từ 310ng/pl đen 3,1 fg/pl 1Ị11 mồi nong độ pha loãng sứ dụng làm lượng mầu cho phàn ứng RPA đe xác định nồng độ DNA L monocytogenes tối thiếu mà phương pháp RPA phát Thí nghiệm tương tự thiết lập cho phàn ứng PCR, từ đánh giá độ nhạy RPA so với PCR KÉT QUẢ Xây dựng phán ứng RPA phát DNA L monocytogenes Moi RPA thiết ke đế phát gen hly cùa vi khuẩn L monocytogenes, vùng gen nghiên cứu trước chứng minh vùng gen đặc trưng đế chan đoán L monocytogenes[\2], Ket quà kiếm tra mồi bang phần mềm NCBI Blast cho thấy mồi thiết kế (Bâng 3) đạt yêu cầu đặc tính kĩ thuật tính đặc hiệu mặt lí thuyết đế phục vụ cho nghiên cứu Bảng Trinh tự mồi RPA sù dụng nghiên cứu Tên mơi Trình tự Nucleotide hly-Ỹ CCCATTAGGCGGAAAAGCATATTCGCTTAATA /í/y-R CCTGCTTCTAGTTGTTGGTACAATGACATCG STT Phàn ứng RPA PCR thiết lập sữ dụng pl DNA tách chiết với nong độ 310ng/pl làm mạch khuôn Ket điện di sán phẩm cùa phàn ứng gel agarose cho thấy phân ứng RPA tạo sân phấm band nhất, có kích thước tưong đồng với kích thước sàn phấm PCR phù họp với kích thước sàn phẩm dự kiến 228bp so sánh với thang DNA 25bp Như vậy, cặp mồi thiết kế hoàn toàn hiệu quà cho cá phưong pháp RPA PCR đế khuếch đại trinh tự mục tiêu genome cùa vi khuấn L monocytogenes B M M Hình Ket quà thữ nghiệm PCR RPA DNA L monocytogenes (A) M: Thang 25bp; 1-2: sàn phấm PCR; 3: đối chứng âm (B) M: Thang 25bp; 1: sàn pham PCR; 2: chứng âm phân ứng PCR; 3: sản pham RPA, 4: chứng âm phàn ứng RPA Nhiệt độ thời gian tối ưu cho phản ứng RPA Kết kháo sát điều kiện nhiệt độ (Hình 2A) cho thấy tất nhiệt độ khảo sát, phản ứng RPA cho sản phấm khuếch đại trinh tự mục tiêu với hình ảnh điện di band nhất, khơng có sán phẩm kí sinh Tuy nhiên, 35°c, 37°c 41 °C, band sán phẩm điện di mờ, 39°c band xuất sáng rõ ràng nhất, chứng tỏ 39°c nhiệt độ phản ứng RPA hoạt động hiệu quà Các khảo sát ve thời gian cho phản ứng RPA thực nhiệt độ 39°c Ớ mốc thời gian ngan từ 15 đen 20 phút, phàn ứng có the tạo sàn phấm khuếch đại DNA với hình ành band điện di mờ bàn gel (Hình 2B) Từ 25 phút trở đi, band điện di cho kết quã sáng rõ Do đó, nghiên cứu này, 25 phút thời gian thích hợp cho phản ứng RPA phát L monocytogenes xây hoàn toàn B A M 3 M kb 200bp Hình Ket quà khảo sát nhiệt độ thời gian phàn ứng RPA phát L monocytogenes (A) Khảo sát nhiệt độ phán ứng; M: Thang 25bp; - 4: tương ứng nhiệt độ kháo sát 35°c, 37°c, 39°c, 41°c (B) Kháo sát thời gian phàn ứng; M: Thang kb; 1-4: tương ứng với mốc thời gian khảo sát 15, 20, 25, 30 phút Độ đặc hiệu phán ứng RPA phát L monocytogenes Ket đánh giá độ đặc hiệu cũa phán ứng RPA cho thấy chi có phàn ứng RPA với vi khuẩn L monocytogenes cho kết dương tính, phàn ứng RPA với DNA chúng vi khuẩn lại cho kết q âm tính (Hình 3) Vì vậy, khơng xáy phân ứng chéo chủng vi khuẩn L monocytogenes chủng vi khuẩn khác kiếm tra, đồng nghĩa với phàn ứng RPA xây dựng đặc hiệu cho phát L monocytogenes, kết quà tương đồng với kết quà nghiên cứu trước[ 13] M Hình Ket xác định độ đặc hiệu cũa phản ứng RPA cho phát L monocytogenes M: thang kb: 1-6 tương ứng với phán ứng RPA với DNA chúng vi khuẩn L monocytogenes, s aureus, s enterica, c perfringens, Vibrio parahaemolyticus Bacillus cereus Độ nhạy phán ứng RPA phát L monocytogenes Độ nhạy phương pháp RPA phát L monocytogenes đánh giá dựa phân tích kết quà điện di hình 4: Với nồng độ DNA pha lỗng từ 3,1 ng/pl đen 310fg/pl (Giếng 1-5, hình 4B), phàn ứng dương tính độ sáng band điện di giảm dần tỉ lệ thuận với độ giám cùa dãy pha loãng nồng độ DNA Từ nồng độ DNA 31 fg/pl (Giếng 6, hình 4B), khơng cịn sản phấm phàn ứng RPA xuất Trong phàn ứng PCR chi cho kết quâ phát từ lOng/pl đén 31 Opg/pl (Giếng 1-4, hình 4A) Do đó, nghiên cứu nồng độ DNA L monocytogenes tối thiểu mà phản ứng RPA phát 310fg/pl, cho độ nhạy cao gấp 1000 lần phàn ứng PCR truyền thống Tìr chứng tỏ cặp mồi sứ dụng có độ nhạy cao, bắt cặp khuếch đại đoạn gen mong muốn nong độ DNA mạch khuôn thấp mà phàn ứng PCR không phát B A M 456 M Hình Kết khão sát độ nhạy cùa phản ứng RPA cho phát L monocytogenes (A) Ket kháo sát giới hạn phát phân ứng PCR; M: Thang 25bp; 1-6: Nồng độ DNA pha loãng từ 310ng đến 3,lpg (B) Ket quà khảo sát giới hạn phát cùa phán ứng RPA; M: Thang 25bp; 1-7: Nồng độ DNA pha loãng từ 3,lng đen 3,lfg BÀN LUẬN Listeria monocytogenes tác nhân gây ngộ độc thực phẩm nguy hiểm gây bệnh Listeriosis người Đe kịp thời ngăn chặn hậu quâ nghiêm trọng cũa nhiềm khuẩn L monocytogenes mang lại, việc phát triến phương pháp phát nhanh chóng hiệu quã cần thiết Hiện nay, RPA kĩ thuật khuếch đại đấng nhiệt biến nghiên cứu ứng dụng phát mầm bệnh vi sinh vật nước thực phẩm Trong nghiên cứu này, phương pháp RPA xây dựng phát hiệu quâ gen hly L monocytogenes Đối với việc sữ dụng phương pháp RPA đe phát nhanh L monocytogenes, thời gian xét nghiệm ngan quan trọng Trong nghiên cứu này, đánh giá thời gian tối ưu để phân ứng RPA phát DNA L monocytogenes tách chiết hiệu quà 25 phút, phân ứng thiết lập nhiệt độ ũ ổn định 39°c, rút ngắn thời gian đáng kế so với phương pháp khác Ngoài ra, u cầu hệ thống phịng thí nghiệm tiêu chuẩn máy luân nhiệt đát tiền không cần thiết thực thữ nghiệm Những ưu điếm làm cho RPA tiết kiệm thời gian chi phí Hơn nữa, che hoạt động đơn giản thiết lập đắng nhiệt làm cho RPA phù hợp đế phát L monocytogenes nhanh chóng có tiềm ứng dụng nơi xét nghiệm có điều kiện trang thiết bị hạn chế Nghiên cứu chi RPA có độ đặc hiệu cao vi phản ứng RPA-L monocytogenes không khuếch đại trinh tự DNA cùa so vi khuẩn khác thuộc nhóm vi khuẩn gây nhiễm phố biển thực phấm Bên cạnh đó, RPA chứng minh nhạy so với xét nghiệm PCR nghiên cứu Giới hạn phát DNA L monocytogenes cùa phương pháp RPA 31 Ofg, có độ nhạy cao khoảng 1000 lần so với giới hạn phát cũa PCR Tương tự với nghiên cứu trước đó, thử nghiệm RPA thành công việc phát DNA vi khuẩn mục tiêu nồng độ thấp[ 13] Do đó, nghiên cứu lần khắng định khả phát nhạy bén trinh tự mục tiêu phương pháp khuếch đại đắng nhiệt RPA Tóm lại, nghiên cứu sữ dụng phương pháp RPA đế phát nhanh L monocytogenes Việt Nam Chúng đánh giá rang RPA có qui trình thực nhanh chóng, đơn giãn, khơng u cầu kĩ thuật viên có kinh nghiệm Phương pháp phát nhanh xác L monocytogenes, thay phương pháp phát truyền thống Ngồi ra, RPA hồn tồn trở thành cơng cụ chấn đốn có giá trị ứng dụng thực tiễn khã phát trực tiếp tế bào vi khuấn mầu lâm sàng đánh giá kĩ TÀI LIỆU THAM KHẢO [ ] Carvalho F, Sousa s, Cabanes D How Listeria monocytogenes organizes its surface for virulence Front Cell Infect Microbiol [Internet], 2014 4:48 [2], WHO Listeriosis - South Africa 2018 [3], Chau TTH, Campbell JI, Schultsz c, van Vinh Chau N, Diep TS, Baker s, et al Three adult cases of Listeria monocytogenes meningitis in Vietnam PLoS Med, 2010 7(7) [4], Curtis GD, Lee WH Culture media and methods for the isolation of Listeria monocytogenes Int J Food Microbiol, 1995 26(1): 1-13 [5], Taherkhani A, Attar H, MM A, Mirzaee SA, Jalali M Prevalence of Listeria monocytogenes in the river receiving the effluent of municipal wastewater treatment plant IntJ Env Heal Eng, 2013 3:37-41 [6], Swetha cs, Babu AJ, Rao TM Detection of Listeria monocytogenes in Milk and Ice Cream byPolymerase Chain Reaction 2016 (May) [7], Li w, Bai L, Fu p, Han H, Liu J, Guo Y The Epidemiology of Listeria monocytogenes in China Foodborne Pathog Dis, 2018 15(8):459-66 [8], Craw p, Balachandran w Isothermal nucleic acid amplification technologies for point-of-care diagnostics: A critical review Lab Chip, 2012 12( 14):2469-86 [9], Xu G, Hu L, Zhong H, Wang H, Yusa SI, Weiss TC, et al Cross priming amplification: Mechanism and optimization for isothermal DNA amplification Sci Rep, 2012 2:1-7 [10], Piepenburg o, Williams CH, Stemple DL, Armes NA DNA detection using recombination proteins PLoS Biol, 2006? 4(7): 1115-21 [11], Daher R Recombinase polymerase amplification technology : Assessment for nucleic acid- based point-ofcare diagnostics 2015 [12], Le Monnier A, Abachin E, Beretti JL, Berche p, Kayal s Diagnosis of Listeria monocytogenes meningoencephalitis by real-time PCR for the hly gene J Clin Microbiol, 2011 49(11):3917-23 [13], Du XJ, Zang YX, Liu H Bin, Li p, Wang s Recombinase Polymerase Amplification Combined with Lateral Flow Strip for Listeria monocytogenes Detection in Food J Food Set, 2018 83(4): 1041 —7 Rapid detection of Listeria monocytogenes by using Recombinase Polymerase Amplification (RPA) Hau Thi Tran*, Diem Hong Tran, Huong Thi Thu Phung NTT Hi-Tech Institute, Nguyen Tat Thanh University, HCMC, Vietnam ’Corresponding author: tthau@ntt.edu.vn Abstract Listeria monocytogenes is one of the most common types of food poisoning bacteria which can cause serious foodborne diseases or even lethality Generally, L monocytogenes can be detected using traditional microbiology or molecular biology techniques, notably PCR However, the application of these methods at point-of-care is restricted due to the strict requirement of equipment and skilled personnel In this study, recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal PCR method was developed to rapidly and specifically detect L monocytogenes Results showed that RPA, without requiring complex thermal cycles, was well-performed in the optimal conditions of 39°c within only 25 minutes The limit of RPA detection identified was 31Ofg of L monocytogenes genomic DNA, which was 1000-fold more sensitive than the conventional PCR Therefore, RPA established in this study could be an alternative standard method to confirm the presence of L monocytogenes in food Accordingly, this rapid and sensitive method could be further applied to clinical testing for diagnosis of L monocytogenes infection, especially at areas with limited settings Keywords: Listeria monocytogenes, PCR, RPA ... chúng tơi thực đề tài ? ?Xây dựng qui trình phát nhanh Listeria monocytogenes kĩ thuật khuếch đại đẳng nhiệt Recombinase polymerase amplification (RPA)? ?? để phát nhanh L monocytogenes, tạo tiền đề... 2: Qui trình phát L monocytogenes phương pháp khuếch đại đăng nhiệt RPA 25 Phát nhanh Listeria monocytogenes kĩ thuật khuếch đại đẳng nhiệt Recombinase polymerase amplification (RPA) Trần Thị... hiệu cần thiết cho phát nhanh L monocytogenes Trong nghiên cứu này, phương pháp khuếch đại nhiệt Recombinase Polymerase Amplification (RPA) xây dựng đế phát nhanh đặc hiệu L monocytogenes Ket