Quy trình multiplex real-time PCR cải tiến phát hiện nhanh nhiễm Streptococccus nhóm B ở thai phụ khi chuyển dạ

Bài viết Quy trình multiplex real-time PCR cải tiến phát hiện nhanh nhiễm Streptococccus nhóm B ở thai phụ khi chuyển dạ trình bày việc tối ưu quy trình multiplex real-time PCR phát hiện GBS trong vòng 2 giờ sau khi lấy mẫu phết dịch âm đạo – trực tràng của thai phụ bằng phương pháp thực nghiệm.

Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số * 2021 QUY TRÌNH MULTIPLEX REAL-TIME PCR CẢI TIẾN PHÁT HIỆN NHANH NHIỄM STREPTOCOCCCUS NHÓM B Ở THAI PHỤ KHI CHUYỂN DẠ Nguyễn Tuấn Anh1,2, Hà Mạnh Tuấn1,3, Trần Thị Bích Huyền4, Bùi Thị Kim Thảo4, Nguyễn Thị Mỹ Linh5, Ngô Đông Kha1,2, Nguyễn Thanh Danh1,2, Nguyễn Lâm Đức Vũ1,2, Lê Thị Mỹ Ly4, Nguyễn Thụy Vy6, Võ Ngun Trung1,3, Vũ Trí Thanh1,3 TĨM TẮT Đặt vấn đề: Vi khuẩn Streptococcus nhóm B tác nhân quan trọng chủ yếu gây nhiễm khuẩn sơ sinh Thai phụ bị nhiễm vi khuẩn lây cho trẻ sơ sinh trình chuyển Vì tầm sốt trước sinh vi khuẩn này, đặc biệt trước vào giai đoạn chuyển thai phụ, điều cần thiết để hạn chế nhiễm trùng sơ sinh sớm trẻ Có nhiều phương pháp chẩn đốn GBS, có phương pháp đáp ứng nhu cầu có nhanh kết với độ nhạy cao Mục tiêu: Tối ưu quy trình multiplex real-time PCR phát GBS vòng sau lấy mẫu phết dịch âm đạo – trực tràng thai phụ phương pháp thực nghiệm Đối tượng – Phương pháp: Nghiên cứu thực nghiệm tiến hành để tối ưu quy trình chẩn đốn Các thí nghiệm đươc tiến hành bước (step-by-step) để tìm thơng số tối ưu cho điều kiện đánh giá Quy trình đánh giá sử dụng cặp mồi mẫu dò Taq-Man đặc trưng cho gene cfb GBS với kênh màu FAM cặp mồi chứng nội đặc trưng cho gene RPLPO người với kênh màu HEX phản ứng Phản ứng multiplex real-time PCR tối ưu với DNA chuẩn vi khuẩn GBS (ATCC® 12401TM ATCC® 12386TM) DNA người tách chiết từ mẫu phết dịch âm đạo – trực tràng thai phụ xác định âm tính với GBS phương pháp ni cấy nhằm đạt hiệu suất nhân tốt cho tất gene đích cần phát Kết quả; Kết cho thấy quy trình multiplex real-time PCR tối ưu phát xác GBS khoảng nồng độ rộng, từ 101 – 109 sao/phản ứng với tổng thời gian hồn thành quy trình 1giờ 30 phút Kết luận: Quy trình multiplex real-time PCR cải tiến thành công, cho phép phát nhanh GBS với tổng thời gian sử dụng để sàng lọc nhanh GBS trước sinh thai phụ vào giai đoạn chuyển Từ khóa: GBS, multiplex real-time PCR, Taq-Man, trẻ sơ sinh Bệnh viện Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh-Cơ sở Trung tâm Đào tạo Chẩn đoán Y Sinh học Phân tử, Bệnh viện Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh 3Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh 4Khoa Sản, Bệnh viện Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh-Cơ sở 5Cơng ty TNHH CNSH Khoa Thương 6Bộ môn Di truyền, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS.BS Hà Mạnh Tuấn ĐT: 0903311709 Email: hamanhtuan@ump.edu.vn 24 Chuyên Đề Điều Dưỡng - Kỹ Thuật Y Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số * 2021 Nghiên cứu Y học ABSTRACT IMPROVING A REAL-TIME PCR ASSAY FOR THE RAPID DETECTION OF GROUP B STREPTOCOCCUS IN PREGNANT WOMEN AT DELIVERY Nguyen Tuan Anh, Ha Manh Tuan, Tran Thi Bich Huyen, Bui Thi Kim Thao, Nguyen Thi My Linh, Ngo Dong Kha, Nguyen Thanh Danh, Nguyen Lam Đuc Vu, Le Thi My Ly, Nguyen Thuy Vy, Vo Nguyen Trung, Vu Tri Thanh * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol 25 - No - 2021: 24 - 33 Backgrounds: Group B Streptoccoccus (GBS) is an important cause of newborn infection Pregnant women colonized with group B Streptococcus might vertically transmit to the infant during delivery Therefore, screening for group B Streptococcal colonization in pregnant women, especially before delivery, is necessary to prevent early-onset newborn infection There are many diagnostic methods for the detection of GBS, but few suitable ones meet the need of a quick turn-around time with good sensitivity Obiectives: To optimize and improve a multiplex real-time PCR assay for diagnosis of GBS within two hours after collecting rectovaginal samples from pregnant women by experimental study Method: The experimental study was performed to optimize a diagnostic test The experiments were carried out step-by-step to find out the optimal parameter for each evaluated component The assay used a primer pair and Taq-Man probe specific to cfb gene of GBS with FAM fluorescene channel and another primer pair and Taq-Man probe specific to RPLPO gene of humans with HEX fluorescence channel in one reaction The multiplex real-time PCR was optimized with standard DNA of the GBS strains ATCC® 12401TM and ATCC® 12386TM and human DNA extracted from rectovaginal swab samples of pregnant women negative for GBS by culture with the purpose of getting the highest amplification efficiency for all tagerted genes Results: The results showed that the optimized multiplex real-time PCR protocol could detect GBS precisely in a wide dynamic range, from 101 to 109 copies/reaction with overall completion time of one and a half hours Conclusion: The multiplex real-time PCR protocol was successfully optimized and allowed for quick detection of GBS with total time less than two hours and possibly used for quick prenatal screening of GBS in pregnant women when going into labor Keywords: GBS, multiplex real-time PCR, Taq-Man, infants tình trạng nhiễm khuẩn sơ sinh Trẻ sơ sinh bị ĐẶT VẤNĐỀ nhiễm GBS bị nhiễm trùng máu, viêm Theo thống kê y tế giới WHO năm phổi, viêm màng não tử vong khơng 2017, Việt Nam có tỷ lệ nhiễm khuẩn sơ sinh phát xử lý kịp thời Hiện nay, khoảng 10% – 20% bệnh sơ sinh Đây nguyên hướng dẫn cập nhật Tổ chức Y tế giới nhân gây tử vong thứ hai cho trẻ sơ sinh sau hội (WHO), Hiệp hội sản phụ khoa giới (FIGO), chứng suy hơ hấp Mặc dù điều trị được, Cơ quan phòng chống dịch bệnh Hoa Kỳ (CDC), nhiễm khuẩn sơ sinh dẫn đến tử vong Hiệp hội sản phụ khoa Hoa Kỳ (ACOG) Hiệp phát muộn hội vi sinh Hoa Kỳ (ASM)(1,2,3) khuyến cáo xác Một tác nhân quan trọng định tình trạng nhiễm khuẩn GBS thai phụ chủ yếu gây nhiễm khuẩn sơ sinh vi khuẩn xét nghiệm tầm soát trước sinh Streptococcus nhóm B (Group B Streptococcus cần phải tiến hành tháng cuối thai kỳ Tại GBS) với tên cụ thể Streptococcus agalactiae Việt Nam, Bộ y tế chưa ban hành hướng dẫn cụ Thai phụ bị nhiễm vi khuẩn lây cho thể việc tầm soát GBS thai phụ giai đoạn trẻ sơ sinh trình chuyển gây trước sinh(4) Tuy nhiên, số bệnh viện lớn Chuyên Đề Điều Dưỡng - Kỹ Thuật Y Học 25 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số * 2021 bệnh viện Từ Dũ, bệnh viện Hùng Vương, bệnh viện Quốc tế Phương Châu, bệnh viện Phụ sản Thành phố Cần thơ áp dụng tầm soát GBS tuần thứ 35-37 thai phụ sử dụng phác đồ điều trị theo Quy trình Phác đồ điều trị bệnh viện dựa theo hướng dẫn tổ chức quốc tế Việc tầm soát GBS thai phụ ba tháng cuối thai kỳ sử dụng phác đồ điều trị kháng sinh dự phòng vào chuyển theo khuyến cáo chứng minh giúp giảm tỷ lệ nhiễm khuẩn sơ sinh sớm, giảm tỷ lệ trẻ có di chứng nặng nề ảnh hưởng nhiễm khuẩn sơ sinh, giảm tỷ lệ tử vong trẻ sơ sinh bệnh viện Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Cơ sở thời gian nghiên cứu Phương pháp tầm soát GBS thường sử dụng phương pháp nuôi cấy truyền thống; nhiên phương pháp cần từ – ngày cho kết chẩn đốn Phương pháp ni cấy không đáp ứng yêu cầu cho kết chẩn đoán thời gian ngắn hơn, đặc biệt trường hợp thai phụ vào chuyển mà chưa xác định tình trạng nhiễm GBS trước Chính thế, phương pháp PCR hay cụ thể real-time PCR phát triển để rút ngắn thời gian trả kết xét nghiệm GBS, từ – Tuy nhiên, quy trình real-time PCR chưa đáp ứng yêu cầu thời gian tình thai phụ vào chuyển Vì thế, cải tiến tối ưu quy trình real-time PCR mới, để trả kết chẩn đốn GBS vịng giờ, nhằm giúp bác sĩ lâm sàng có sở sử dụng phác đồ kháng sinh dự phòng phù hợp thai phụ, từ giảm tỷ lệ nhiễm khuẩn sơ sinh trẻ sơ sinh Địa điểm thời gian nghiên cứu Nghiên cứu thực thời gian từ Tháng 6/2020 đến Tháng 3/2021 Trung tâm Đào tạo Chẩn đoán Y Sinh học phân tử - Cơ sở 2, bệnh viện Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Mục tiêu Tối ưu quy trình multiplex real-time PCR sử dụng mẫu dò Taq-Man để phát nhanh GBS Tiêu chuẩn chọn Thai phụ có tuổi thai ≥37 tuần đồng ý tham gia nghiên cứu Tiêu chuẩn loại trừ Thai phụ sử dụng kháng sinh, dùng thuốc đặt âm đạo làm thủ thuật thụ rửa âm đạo vòng 48h Thai phụ sanh non, vỡ ối sớm, tiền đạo Vật liệu Chủng vi khuẩn Streptococcus agalactiae chuẩn (ATCC® 12401TM ATCC® 12386TM) Phương pháp nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu thực nghiệm Các thí nghiệm đươc tiến hành bước (step-by-step) để tìm thơng số tối ưu cho điều kiện đánh giá Các biến số nghiên cứu bao gồm hoạt động mồi mẫu dị (tốt hay khơng tốt), nhiệt độ lai phản ứng, nồng độ MgCl2, nồng độ mồi mẫu dò, nồng độ enzyme, phương pháp tách chiết khoảng động học phản ứng Qua thí nghiệm thiết kế, giá trị tốt biến số xác định thông qua giá trị Ct xác định vượt ngưỡng phản ứng realtime PCR Trong thí nghiệm, nghiệm thức có giá trị Ct trung bình lần lặp lại nhỏ sai số không vượt 0,5 Ct tốt Phương pháp thực Phương pháp tiến hành tối ưu phản ứng real-time PCR Mẫu DNA tổng số (người) tách chiết từ mẫu dịch phết âm đạo – trực tràng (âm tính với GBS) thai phụ thu thập khoa Phụ sản, Quy trình real-time PCR phát GBS xây dựng qua bước chính: (1) Kiểm tra hoạt động nhân mồi tín hiệu mẫu dị, (2) Tối ưu hóa nhiệt độ lai, (3) Tối ưu hóa nồng độ MgCl2, (4) Tối ưu hóa nồng độ mồi mẫu dị, (5) Tối ưu hóa nồng độ enzyme, (6) Khảo sát 26 Chuyên Đề Điều Dưỡng - Kỹ Thuật Y Học ĐỐI TƯỢNG- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số * 2021 động học phản ứng real-time PCR (8) Tối ưu hóa phương pháp tách chiết Chọn lựa thiết kế mồi/mẫu dò Cặp mồi/mẫu dò đặc hiệu cho gene cfb GBS chọn lựa từ nghiên cứu trước(5) cặp mồi/mẫu dò đặc hiệu cho gene RPLPO người làm chứng nội phản ứng thiết kế (Khoa Thương) phần mềm sinh học phân tử chuyên dụng PrimerQuest, Oligo Analyzer, Annhyb, Blast (NCBI) với trình tự tương ứng sau: GBS-F: 5’-GGGAACAGATTATGAAAAAMCG-3’; GBS-R: 5’-AAGGCTTCTACACGACTACCAA-3’; GBS-P: 5’-FAM-AGACTTCATTGCGTGCCAACCCTGAGACBHQ1-3’; IC-F: 5’-GCAGATCCGCATGTCCCTTCGC-3’; IC-R: 5’-CTCCAGAGCTGGGTTGTTTTCCAGG-3’; IC-P: 5’-HEX-AGGCTGTGGTGCTGATGGG CAAGAACACCATGATG-BHQ1-3’ Mẫu dò gene cfb phát GBS đánh dấu màu FAM Mẫu dị gene RPLPO kiểm sốt phản ứng đánh dấu màu HEX Mồi mẫu dò đặt tổng hợp công ty IDT (Integrated DNA Technologies, USA) Phương pháp tách chiết DNA DNA gene mẫu vi khuẩn GBS DNA tổng số mẫu phết dịch âm đạo-trực tràng được tách chiết theo nguyên tắc hấp phụ đặc hiệu lên pha rắn (màng silica) kit tách chiết cột - “DNA column-based extraction kit” (Khoa Thương) Tất thao tác kỹ thuật thực theo quy trình hướng dẫn kit nhà sản xuất Tổng thời gian hoàn thành quy trình tách chiết cho mẫu 25-30 phút Thành phần chương trình phản ứng real-time PCR Nghiên cứu Y học Chương trình nhiệt cho phản ứng real-time PCR bao gồm 15 phút 95oC, 40 chu kỳ lặp lại gồm 15 giây 95oC 20 giây 60oC Tín hiệu thu nhận với hai màu FAM (510-530 nm), HEX (560580 nm) Quy trình thực hệ thống real-time PCR Mx3005P (Stratagene) Tổng thời gian hoàn thành phản ứng real-time PCR hệ thống Mx3005P 58 phút Kiểm tra hoạt động nhân mồi tín hiệu mẫu dị Mục tiêu: kiểm tra hiệu hoạt động nhân mồi tín hiệu mẫu dị phát GBS Thiết kế: amplicon chứng dương (DNA) tổng hợp nhân tạo DNA chủng GBS chuẩn (ATCC® 12386TM) sử dụng vật liệu chuẩn để đánh giá hiệu hoạt động phản ứng Thành phần chương trình real-time PCR trình bày phần phương pháp nghiên cứu Tối ưu hóa nhiệt độ lai Mục tiêu: khảo sát nhiệt độ lai (Ta) tối ưu cho hoạt động mồi mẫu dị, từ xác định nhiệt độ lai thích hợp cho phản ứng Thiết kế: amplicon có nồng độ 101, 104 106 sao/phản ứng DNA vi khuẩn GBS chuẩn (ATCC® 12386TM) sử dụng để tối ưu Mẫu DNA người (genomic DNA / gDNA) âm tính với GBS bổ sung vào tất phản ứng khảo sát, trừ phản ứng chứng âm Thành phần real-time PCR phối hợp thêm mồi mẫu dò chứng nội sử dụng, bao gồm 300 nM mồi chứng nội IC-F/R 100 nM mẫu dò chứng nội IC-P (IDT) tổng thể tích phản ứng 25 μL Chương trình nhiệt thí nghiệm trước, riêng nhiệt độ lai khảo sát từ 56oC - 66oC Hỗn hợp phản ứng real-time PCR tối ưu có thành phần gồm 1X Buffer, mM MgCl2, 200 μM dNTPs, U h-Taq DNA polymerase (Solgent), 300 nM mồi GBS-F/R, 100 nM mẫu dò GBS-P, 300 nM mồi chứng nội IC-F/R, 100 nM mẫu dò chứng nội IC-P (IDT) µl DNA tách chiết tổng thể tích phản ứng 25 µL Tối ưu hóa nồng độ MgCl2 Mục tiêu: xác định nồng độ MgCl2 tối ưu cho phản ứng real-time PCR Thiết kế: DNA mẫu vật liệu chuẩn, thành phần real-time PCR (có nồng độ MgCl2 khảo sát từ – mM) chương trình nhiệt thí nghiệm trước, riêng nhiệt độ lai mồi tối ưu 60oC sử dụng Chuyên Đề Điều Dưỡng - Kỹ Thuật Y Học 27 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số * 2021 Tối ưu hóa nồng độ mồi mẫu dị Mục tiêu: xác định tổ hợp nồng độ mồi mẫu dò tối ưu cho phản ứng real-time PCR Thiết kế: DNA mẫu vật liệu chuẩn, thành phần real-time PCR (4 mM MgCl2 tối ưu) chương trình nhiệt (nhiệt độ lai 60oC tối ưu) sử dụng thí nghiệm trước Nồng độ mồi GBS-F/R từ 300 – 600 nM kết hợp với nồng độ mẫu dò GBS-P từ 100 – 200 nM khảo sát chất ức chế phản ứng PCR Mỗi phương pháp thực lần tách chiết độc lập, lần mẫu DNA tách chiết từ mẫu chạy PCR lặp lại lần Mẫu dùng thí nghiệm mẫu dịch phết âm đạo - trực tràng thai phụ đồng ý tham gia nghiên cứu Mẫu trộn tạo thành từ mẫu bệnh nhân tích 1200 μl/mẫu Một số mẫu bổ sung thêm sinh khối GBS để đạt nồng độ mong muốn Tối ưu hóa nồng độ enzyme Mục tiêu: xác định nồng độ enzyme tối ưu cho phản ứng real-time PCR Thiết kế: DNA mẫu vật liệu chuẩn, thành phần real-time PCR chương trình nhiệt sử dụng thí nghiệm trước với thông số tối ưu Nồng độ enzyme h-Taq (Solgent) từ 1U – 2U/phản ứng khảo sát Khảo sát động học phản ứng real-time PCR Đánh giá hiệu tối ưu phản ứng real-time PCR Mục tiêu: chứng minh hiệu tối ưu hóa phản ứng Thiết kế: so sánh hai thành phần phản ứng (cơ tối ưu) Mẫu DNA chuẩn chương trình nhiệt thí nghiệm trước Thành phần real-time PCR tối ưu sau: 1,5 U h-Taq DNA polymerase (Solgent), 200 µM dNTPs, mM MgCl2, 1X PCR Buffer, 600 nM mồi GBS, 200 nM mẫu dò GBS, 300 nM mồi chứng nội, 100 nM mẫu dò chứng nội (IDT) µl DNA tách chiết tổng thể tích phản ứng 25 µL Tối ưu hóa phương pháp tách chiết Mục tiêu: chọn lựa phương pháp tách chiết DNA phù hợp nhanh Thiết kế: ba phương pháp tách chiết với nguyên lý khác chọn để tách chiết DNA phương pháp tủa (Khoa Thương), phương pháp cột lọc (Khoa Thương) phương pháp Nhiệt (Lucigen) Phương pháp tủa dựa vào tính tan khác DNA protein dung môi hữu (phenol chloroform) Phương pháp cột lọc dựa vào tính chất hấp phụ đặc hiệu DNA lên màng silica cột lọc Phương pháp nhiệt dựa vào nhiệt độ để phá hủy màng tế bào, giải phóng DNA bất hoạt 28 Mục tiêu: xác định khoảng động học phản ứng real-time PCR tối ưu, khả nhân quy trình dãy nồng độ DNA đích từ thấp đến cao Thiết kế: DNA tổng hợp nhân tạo (amplicon, IDT) có nồng độ 1010 sao/phản ứng pha loãng bậc 10 thành nồng độ nhỏ hơn, bao gồm 109, 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101 sao/phản ứng Mỗi nồng thực lặp lại lần phản ứng real-time PCR với thành phần chương trình tối ưu, sau phản ứng kết thúc, đường chuẩn xây dựng thơng số nhân quy trình xác định Phương pháp thống kê Giá trị Ct trung bình sai số phản ứng real-time PCR sử dụng để tính tốn dựa lần lặp lại so sánh nghiệm thức thí nghiệm Nghiệm thức có giá trị Ct trung bình nhỏ giá trị sai số lần lặp lại < 0,5 Ct nồng độ mẫu quan sát xác định tốt Y đức Nghiên cứu thông qua Hội đồng Đạo đức nghiên cứu Y sinh học Đại học Y Dược TP HCM, số 370/HĐĐĐ-ĐHYD ký ngày 02/6/2020 Nghiên cứu phần nghiên cứu lớn cấp kinh phí Sở Khoa học Cơng nghệ Thành phố Hồ Chí Minh theo Quyết định số 551/QĐ-SKHCN, ngày 4/6/2020 Hợp đồng thực nhiệm vụ nghiên cứu khoa học công nghệ số 32/2020/HĐ-QPTKHCN, ngày 25/6/2020 Chuyên Đề Điều Dưỡng - Kỹ Thuật Y Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số * 2021 Nghiên cứu Y học KẾT QUẢ Tối ưu hóa nhiệt độ lai Kiểm tra hoạt động nhân mồi tín hiệu mẫu dị Nhiệt độ lai 60oC chọn giá trị Ct màu FAM tốt (thấp nhất) so sánh nghiệm thức với mẫu chứng có nồng độ khác Tín hiệu chứng nội (HEX) ổn định (Bảng 2) Bảng Giá trị Ct khảo sát hiệu nhân mồi tín hiệu mẫu dị Mẫu Chứng âm (nước cất hai lần xử lý với DEPC* khử trùng) DNA gene vi khuẩn GBS Amplicon tổng hợp nhân tạo (DNA nhân tạo) * Ct 27,4 ± 0,1 22,2 ± 0,3 DEPC: Diethyl pyrocarbonate Mồi mẫu dò hoạt động tốt Hai mẫu DNA chứng cho tín hiệu Ct xác định Mẫu chứng âm khơng có tín hiệu dương tính Tiếp tục tối ưu yếu tố khác (Bảng 1) Tối ưu hóa nồng độ MgCl2 Bảng cho thấy nồng độ MgCl2 tối ưu khoảng từ – mM Nồng độ mM MgCl2 chọn hiệu tương đương mà cần dùng với lượng Tối ưu hóa nồng độ mồi mẫu dị Tổ hợp 600 nM mồi GBS-F/R 200 nM mẫu dò GBS-P cho kết tốt (Bảng 4) Chọn tổ hợp cho thí nghiệm Bảng Giá trị Ct tối ưu hóa nhiệt độ lai mồi mẫu dò Mẫu (cps/rxn) 56oC Chứng âm 101 104 106 DNA GBS 26,1 ± 0,1 16,2 ± 0,4 29,3 Chứng âm 101 104 106 DNA GBS 30,4 ± 0,4 29,3 ± 0,1 32,0 58oC 60oC Tín hiệu FAM / GBS 25,8 ± 0,3 25,4 ± 0,1 16,0 ± 0,3 15,6 ± 0,1 28,4 27,8 Tín hiệu HEX/IC 29,7 ± 0,3 29,5 ± 0,3 28,8 ± 0,2 28,7 ± 9,2 37,2 ± 0,4 34,4 ± 0,4 30,2 29,3 62oC 64oC 66oC 25,9 ± 0,2 16,2 ± 0,2 28,7 27,3 ± 0,2 17,9 ± 0,3 - 22,4 ± 0,5 - 29,1 ± 0,1 28,7 ± 0,4 31,4 ± 0,3 29,5 28,9 ± 0,1 28,4 ± 0,4 28,8 ± 0,3 29,2 28,5 ± 0,1 27.9 ± 0,2 27,8 ± 0,2 28,3 * cps/rxn: sao/phản ứng; FAM: tín hiệu GBS; HEX: tín hiệu chứng nội Bảng Giá trị Ct tối ưu hóa nồng độ MgCl2 Mẫu (cps/rxn) mM Chứng âm 101 102 104 106 DNA GBS 37,9 ± 0,0 37,5 ± 1,6 26,8 ± 0,4 20,3 ± 1,1 31,5 Chứng âm 101 102 104 106 DNA GBS 31,5 ± 0,2 31,3 ± 0,5 31,3 ± 0,3 30,7 ± 0,4 30,8 mM mM Tín hiệu FAM / GBS 33,9 ± 1,0 32,0 ± 2,0 33,5 ± 0,2 32,2 ± 0,3 24,3 ± 0,3 24,5 ± 0,4 18,1 ± 0,2 17,9 ± 0,5 29,3 28,4 Tín hiệu HEX / IC 30,3 ± 0,4 29,8 ± 0,9 30,0 ± 0,3 30,0 ± 0,1 29,9 ± 0,7 29,2 ± 0,6 30,0 ± 0,2 30,1 ± 0,5 30,3 30,4 Chuyên Đề Điều Dưỡng - Kỹ Thuật Y Học mM mM 34,5 ± 1,1 32,4 ± 0,4 23,8 ± 0,5 17,4 ± 0,4 28,6 33,7 ± 0,8 32,1 ± 0,7 24,4 ± 0,2 18,0 ± 0,7 28,9 29,1 ± 0,5 29,3 ± 0,5 29,7 ± 0,4 30,4 ± 0,5 30,0 30,1 ± 0,3 30,5 ± 1,0 29,4 ± 0,1 29,9 ± 0,2 29,3 29 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số * 2021 Nghiên cứu Y học Bảng Giá trị Ct tối ưu hóa nồng độ mồi mẫu dò Mẫu (cps/rxn) 300/100 400/100 500/100 Chứng âm - - - 101 36,3 ± 0,2 35,2 ± 0,9 102 33,1 ± 0,5 33,3 ± 0,6 104 24,6 ± 0,1 106 18,5 ± 0,4 DNA GBS 31,0 ± 0,4 600/100 300/200 400/200 500/200 600/200 - - - - - 36,4 ± 0,7 35,7 ± 0,5 36,4 ± 1,2 35,1 ± 0,9 35,4 ± 0,2 35,7 ± 0,4 33,2 ± 0,1 32,8 ± 0,2 33,2 ± 0,3 32,9 ± 0,2 32,9 ± 0,6 32,7 ± 0,1 25,0 ± 0,0 24,6 ± 0,1 24,9 ± 0,2 24,9 ± 0,3 24,8 ± 0,0 24,1 ± 0,2 24,4 ± 0,3 18,3 ± 0,1 18,6 ± 0,3 18,1 ± 0,4 18,5 ± 0,1 18,4 ± 0,1 18,4 ± 0,3 17,8 ± 0,3 30,7 ± 0,2 30,7 ± 0,4 30,8 ± 0,2 31,1 ± 0,5 30,9 ± 0,1 30,6 ± 0,3 30,6 ± 0,4 Tín hiệu FAM / GBS Tín hiệu HEX / IC Chứng âm - - - - - - - - 101 29,4 ± 0,7 29,4 ± 0,2 29,7 ± 0,5 29,8 ± 0,2 29,6 ± 0,3 29,1 ± 0,4 29,8 ± 0,4 28,8 ± 0,2 102 29,5 ± 0,3 29,5 ± 0,6 29,4 ± 0,7 29,8 ± 0,3 29,7 ± 0,1 29,3 ± 0,1 29,6 ± 0,2 29,2 ± 0,1 104 29,1 ± 0,2 29,1 ± 0,2 29,2 ± 0,3 29,0 ± 0,6 29,4 ± 0,4 30,0 ± 0,4 28,9 ± 0,2 28,8 ± 0,2 106 29,1 ± 0,2 29,6 ± 0,4 28,4 ± 0,4 29,5 ± 0,6 29,3 ± 0,2 29,4 ± 0,4 29,2 ± 0,2 29,2 ± 0,3 DNA GBS 29,2 ± 0,4 30,0 ± 0,2 29,6 ± 0,5 29,0 ± 1,0 29,6 ± 0,2 29,9 ± 0,8 29,7 ± 0,2 29,5 ± 0,6 Tối ưu hóa nồng độ enzyme Bảng Giá trị Ct tối ưu hóa nồng độ enzyme Mẫu (cps/rxn) 1U 1,5U 2U Tín hiệu FAM / GBS Chứng âm 101 34,4 ± 0,4 34,0 ± 0,1 34,3 ± 0,7 102 33,1 ± 0,3 32,7 ± 0,2 32,4 ± 0,2 104 24,4 ± 0,2 24,5 ± 0,2 24,2 ± 0,3 106 18,8 ± 0,2 18,4 ± 0,1 18,3 ± 0,2 DNA GBS 30,7 ± 0,2 30,3 ± 0,1 30,2 ± 0,1 Tín hiệu HEX / IC Chứng âm 101 29,2 ± 0,2 29,2 ± 0,2 29,2 ± 0,6 102 29,4 ± 0,5 29,3 ± 0,4 29,0 ± 0,2 104 29,2 ± 0,0 29,1 ± 0,2 29,5 ± 0,2 106 29,4 ± 0,3 29,2 ± 0,3 29,1 ± 0,4 DNA GBS 29,6 ± 0,1 29,3 ± 0,1 29,3 ± 0,2 Nồng độ enzyme 1,5U - 2U cho kết tốt 1U Nồng độ 1,5 U enzyme phản ứng chọn cho hiệu tương đương nồng độ 2U tốn (Bảng 5) Đánh giá hiệu tối ưu phản ứng real-time PCR Bảng Giá trị Ct đánh giá hiệu tối ưu Mẫu Tín hiệu FAM/GBS Cơ Tín hiệu HEX/Chứng nội Cơ Tối ưu Tối ưu Chứng âm E1 cps/rxn 38,8 ± 0,1 33,1 ± 0,4 24,3 ± 0,3 24,3 ± 0,3 E2 cps/rxn 34,3 ± 0,3 29,8 ± 0,2 24,3 ± 0,4 23,8 ± 0,3 E4 cps/rxn 24,9 ± 0,3 23,2 ± 0,4 24,1 ± 0,2 23,5 ± 0,1 30 Tín hiệu HEX/Chứng Tín hiệu FAM/GBS nội Mẫu Cơ Tối ưu Cơ Tối ưu E6 cps/rxn 19,4 ± 0,2 18,5 ± 0,3 24,1 ± 0,4 23,4 ± 0,1 DNA GBS 34,3 ± 0,3 29,6 ± 0,3 24,4 ± 0,5 23,6 ± 0,1 Thành phần phản ứng real-time PCR tối ưu cho kết tốt hẳn thành phần phản ứng bản, đặc biệt mẫu nồng độ thấp (Bảng 6) Tối ưu hóa phương pháp tách chiết Phương pháp cột Bảng cho kết tốt hơn, thời gian hồn thành quy trình tách chiết từ 25 – 35 phút/mẫu Phương pháp nhiệt có thời gian tách chiết ngắn hơn, từ 15 – 17 phút/mẫu, thiết bị thao tác đơn giản, chi phí cao Tuy nhiên, chất lượng tách chiết phương pháp nhiệt khơng phương pháp cột Phương pháp tủa có thời gian hồn thành lâu nhất, trung bình 75 phút/mẫu Để đảm bảo thời gian chất lượng quy trình chẩn đốn GBS, phương pháp cột chọn để sử dụng Khảo sát động học phản ứng real-time PCR Quy trình hoạt động tốt nồng độ tác nhân đích (GBS) từ 101 – 109 sao/phản ứng Thơng số chuẩn quy trình xác định E=100,8%; hệ số góc (slope)= -3,304 R2=0,997 Như vậy, quy trình có hiệu suất nhân cao giá trị R2 tốt (Hình 1), đáp ứng tiêu chí kỹ thuật phản ứng real-tim PCR dùng cho chẩn đoán Chuyên Đề Điều Dưỡng - Kỹ Thuật Y Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số * 2021 Nghiên cứu Y học Bảng Giá trị Ct tối ưu hóa phương pháp tách chiết Mẫu S1 S2 S3 S4 S5 Tủa 36,2 ± 1,9 33,0 ± 0,8 15,5 ± 0,5 16,4 ± 0,6 22,0 ± 0,7 Tín hiệu FAM / GBS Cột 35,4 ± 0,6 32,9 ± 0,5 14,6 ± 0,3 15,1 ± 0,3 23,7 ± 0,5 Nhiệt 35,2 ± 1,1 35,3 ± 0,8 16,9 ± 0,4 17,0 ± 0,4 28,3 ± 1,4 Tủa 27,6 ± 1,2 25,0 ± 0,9 23,7 ± 0,9 24,7 ± 1,1 27,3 ± 0,9 Tín hiệu HEX / Chứng nội Cột 25,7 ± 1,2 23,1 ± 1,0 22,3 ± 1,1 23,1 ± 0,9 25,5 ± 1,1 Nhiệt 28,4 ± 1,0 25,8 ± 0,9 24,9 ± 0,9 25,1 ± 0,9 27,8 ± 1,1 Hình Kết khảo sát động học phản ứng real-time PCR Hình trái đường cong nhân nồng độ mẫu chuẩn Hình phải đường chuẩn trùng chuyển dạ, tình trạng nhiễm khuẩn BÀN LUẬN thay đổi suốt q trình mang GBS tác nhân gây bệnh nhiễm khuẩn quan thai(6) trọng người, đặc biệt nguy hiểm đối Vì ý nghĩa quan trọng việc phát với trẻ sơ sinh dẫn tới nhiễm trùng GBS phòng ngừa nhiễm khuẩn sơ sinh máu, viêm màng não tử vong(6) Chính thế, sớm trẻ, đặc biệt nhiễm trùng máu viêm chẩn đoán sớm nhanh GBS thai phụ giúp màng não, nhiều phương pháp phát nhanh bác sĩ có biện pháp can thiệp phù hợp sử GBS phát triển Phương pháp nhuộm dụng kháng sinh dự phòng cho thai phụ để hạn Gram khơng có nhiều ý nghĩa độ nhạy độ chế nhiễm khuẩn sơ sinh sớm biến chứng đặc hiệu nguy hiểm trẻ Hiện nay, tiêu chuẩn vàng để phát GBS phương pháp nuôi cấy(7) Từ năm 2002, trung tâm phịng ngừa kiểm sốt dịch bệnh Hoa Kỳ (CDC) đề nghị phương pháp nuôi cấy thường quy cho tất phụ nữ mang thai có tuần thai từ 35 đến 37 Phương pháp có độ nhạy đặc hiệu phù hợp để phát nhiễm khuẩn GBS thai phụ với nhiều mức độ khác nhau; nhiên, thời gian trả kết thường không sớm 48 Chính vậy, phương pháp ni cấy không phù hợp cần phát GBS thai phụ vào giai đoạn chuyển Hơn nữa, phát GBS tuần thứ 35 – 37 thai kỳ khơng đồng nghĩa với tình trạng thai phụ mang vi Đối với phương pháp nuôi cấy, số môi trường đặc biệt cho phép phát nhanh GBS phản ứng sinh màu Tuy nhiên, số chủng GBS lại thiếu khả sinh sắc tố, nên phát môi trường Tương tự, độ nhạy phản ứng ngưng kết latex (latex agglutination test) kỹ thuật miễn dịch hay sắc ký miễn dịch (immunochromatography)(8) dùng để phát GBS trực tiếp từ mẫu lâm sàng không đủ nhạy ổn định, so sánh với phương pháp nuôi cấy tiêu chuẩn vàng Chúng thường cho kết rõ ràng trường hợp thai phụ bị nhiễm khuẩn nặng Sàng lọc GBS phương Chuyên Đề Điều Dưỡng - Kỹ Thuật Y Học 31 Nghiên cứu Y học pháp MALDI-TOF MS khuyến cáo để tránh trường hợp dương tính giả(9) Tuy nhiên, để sử dụng phương pháp cho chẩn đoán, khuẩn lạc cần chuẩn bị, nên thời gian từ 1-2 ngày Hơn nữa, hệ thống MALDI-TOF MS chi phí cao nên khó có sẵn phòng xét nghiệm Polymerase Chain Reaction (PCR) trở thành phương pháp sử dụng phổ biến chẩn đốn phân tử, có độ nhạy độ đặc hiệu cao, phổ biến phòng xét nghiệm(10) Nếu mẫu bệnh phẩm diện lượng nhỏ tế bào vi khuẩn, khó phát phương pháp thông thường soi nhuộm (Gram) tế bào chí khơng thể ni cấy thành cơng, phương pháp PCR cho kết dương tính, nguyên lý phương pháp nhân vùng gene đặc trưng - có tác nhân cần phát mẫu lên thật nhiều thông qua phản ứng xúc tác enzyem polymerase (chịu nhiệt) – enzyme tổng hợp DNA trong tế bào Giả sử mẫu ban đầu có tế bào GBS, phát soi nhuộm hay ni cấy thơng thường, với PCR real-time PCR, sau phản ứng kết thúc, có hàng tỉ vùng gene đặc trưng GBS nhân mẫu Với số lượng lớn thế, chúng dễ dàng phát phương pháp thơng thường điện di, hóa phát quang tín hiệu huỳnh quang Khi có tín hiệu nhân đặc trưng diện phản ứng PCR, có nghĩa mẫu bệnh phẩm ban đầu có vật liệu di truyền đặc trưng vi khuẩn GBS Điều ngầm hiểu có diện GBS mẫu bệnh phẩm thu thập từ bệnh nhân, hay nói cách khác, bệnh nhân bị nhiễm GBS Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số * 2021 trình nhiệt phản ứng real-time PCR tối ưu với thành phần khác phản ứng enzyme DNA polymerase, MgCl2 nồng độ mồi / mẫu đò đặc hiệu GBS chứng nội kiểm soát phản ứng Quy trình real-time PCR sau tối ưu có khoảng hoạt động rộng, ổn định với nồng độ vi khuẩn GBS từ 101 – 109 sao/phản ứng Hệ thống realtime PCR đạt thông số chuẩn quy trình chẩn đốn phân tử kiểu định lượng hiệu suất phản ứng (E), hệ số góc (slope) hệ số tương quan (R2) 100,8%; -3,304 0,997 Điều quan trọng quy trình khơng phải điện di phân tích kết quy trình PCR truyền thống khác, hạn chế tối đa nguy ngoại nhiễm trình thao tác Trên giới, nhiều quy trình real-time PCR phát triển để phát GBS Tùy theo loại hóa chất thiết bị sử dụng mà thành phần phản ứng chu trình nhiệt tối ưu khác Dù vậy, quy trình tuân thủ nguyên lý phản ứng PCR – tức nhân vật liệu di truyền Tuy nhiên, quy trình sử dụng phương pháp phát tín hiệu nhân khác (PCR điện di(11), real-time PCR(11,12,13), real-time LAMP(14)) nhắm vào vùng gene khác vi khuẩn GBS (cfb(5), sip(12,13), fbsB(14), dltR(15), scpB(16), C protein gene(17)) Do vậy, giá trị chẩn đốn quy trình khác cần đánh giá trước sử dụng thực tế Đối với quy trình này, giá trị chẩn đốn (tính đặc hiệu độ nhạy lâm sàng) đánh giá chi tiết nghiên cứu khác KẾT LUẬN Trong nghiên cứu này, tối ưu quy trình real-time PCR giúp phát trực tiếp GBS từ mẫu dịch phết âm đạo – trực tràng thai phụ vòng sau lấy mẫu Thời gian thực quy trình rút ngắn phương pháp tách chiết DNA GBS chu Tóm lại, quy trình real-time PCR cải tiến tối ưu bước nhằm phát GBS nhanh với tổng thời gian thực Quy trình sử dụng để phát GBS sàng lọc trước sinh thai phụ, đặc biệt giai đoạn chuyển dạ, nhằm phòng ngừa 32 Chuyên Đề Điều Dưỡng - Kỹ Thuật Y Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số * 2021 Nghiên cứu Y học nhiễm khuẩn sơ sinh sớm trẻ sơ sinh TÀI LIỆU THAM KHẢO Salimnia H, Robinson-Dunn B, Gundel A, Campbell A, Mitchell R, Taylor M, and Fairfax M R (2019) Suggested Modifications To Improve the Sensitivity and Specificity of the 2010 CDC-Recommended Routine Streptococcus agalactiae Screening Culture for Pregnant Women J Clin Microbiol, 57(8):e00446-19 Filkins L, Hauser J R, Robinson-Dunn B, Tibbetts R, Boyanton B L, Revell P (2020) American Society for Microbiology Provides 2020 Guidelines for Detection and Identification of Group B Streptococcus J Clin Microbiol, 59(1):e01230-20 ACOG Committee Opinion, Number 797 ((2020) Prevention of Group B Streptococcal Early-Onset Disease in Obstet Gynecol, 35(2):e51-e72 Bộ Y Tế (2020) Hướng dẫn chuyên môn kỹ thuật sàng lọc, chẩn đoán, điều trị trước sinh sơ sinh Quyết định 1807/QĐ-BYT ngày 21/4/2020 Diaz MH, Waller JL, Napoliello RA, Islam MS, Wolff BJ, Burken DJ, Holden RL, Srinivasan V, Arvay M, McGee L, Oberste MS, Whitney C G, Schrag SJ, Winchell JM, Saha SK (2013) Optimization of Multiple Pathogen Detection Using the TaqMan Array Card: Application for a Population-Based Study of Neonatal Infection PLoS ONE, 8(6):e66183 Bergeron MG, Ke D, Menard C, Picard FJ, Gagnon M, Bernier M, Ouellette M, Roy PH, Marcoux S, Fraser WD (2000) Rapid detection of group B streptococci in pregnant women at delivery N Engl J Med, 343(3):175-9 ACOG Committee Opinion No 485 (2011) Prevention of early-onset group B streptococcal disease in newborns Obstet Gynecol, 117(4):1019-1027 Takayama Y, Matsui H, Adachi Y, Nihonyanagi S, Wada T, Mochizuki J, Unno N, Hanaki H (2017) Detection of Streptococcus agalactiae by immunochromatography with group B streptococcus-specific surface immunogenic protein in pregnant women J Infect Chemother, 23(10):678-682 Suwantarat N, Grundy M, Rubin M, Harris R, Miller JA, Romagnoli M, Hanlon A, Tekle T, Ellis BC, Witter FR, Carroll KC (2015) Recognition of Streptococcus pseudoporcinus Colonization in Women as a Consequence of Using MatrixAssisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Chuyên Đề Điều Dưỡng - Kỹ Thuật Y Học 10 11 12 13 14 15 16 17 Spectrometry for Group B Streptococcus Identification J Clin Microbiol, 53(12):3926-30 Verani JR, McGee L, Schrag SJ (2010) Prevention of perinatal group B streptococcal disease revised guidelines from CDC MMWR Recomm Rep, 59(RR-10):1-36 Ke D, Menard C, Picard FJ, Boissinot M, Ouellette M, Roy PH, Bergeron MG (2000) Development of conventional and realtime PCR assays for the rapid detection of group B streptococci Clin Chem, 46(3):324-31 Khatami A, Randis TM, Chamby A, Hooven TA, Gegick M, Suzman E, A'Hearn-Thomas B, Steenhoff AP, and Ratner AJ (2018) Improving the Sensitivity of Real-time PCR Detection of Group B Streptococcus Using Consensus Sequence-Derived Oligonucleotides Open Forum Infect Dis, 5(7):164 Escobar DF, Diaz-Dinamarca DA, Hernandez CF, Soto DA, Manzo RA, Alarcon PI, Pinto CH, Bastias DN, Oberg-Bravo CN, Rojas R, Illanes SE, Kalergis AM, Vasquez AE (2020) Development and analytical validation of real-time PCR for the detection of Streptococcus agalactiae in pregnant women BMC Pregnancy Childbirth, 20(1):352 Guo XG, Zhuang YR, Wen JZ, Xie TA, Liu YL, Zhu GD, Xia Y (2019) Evaluation of the real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification assay for the detection of Streptococcus agalactiae Biosci Rep, 39(5):BSR20190383 Meehan M, Cafferkey M, Corcoran S, Foran A, Hapnes N, LeBlanc D, McGuinness C, Nusgen U, O'Sullivan N, Cunney R, Drew R (2015) Real-time polymerase chain reaction and culture in the diagnosis of invasive group B streptococcal disease in infants: a retrospective study Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 34(12):2413-20 Dmitriev A, Suvorov A, Shen AD, Yang YH (2004) Clinical diagnosis of group B streptococci by scpB gene based PCR Indian J Med Res, 119:233-6 Mawn JA, Simpson AJ, Heard SR (1993) Detection of the C protein gene among group B streptococci using PCR J Clin Pathol, 46(7):633-6 Ngày nhận báo: 15/07/2021 Ngày nhận phản biện nhận xét báo: 10/09/2021 Ngày báo đăng: 15/10/2021 33 ... quy trình real-time PCR chưa đáp ứng yêu cầu thời gian tình thai phụ vào chuyển Vì thế, chúng tơi cải tiến tối ưu quy trình real-time PCR mới, để trả kết chẩn đốn GBS vòng giờ, nhằm giúp b? ?c... phân tử - Cơ sở 2, b? ??nh viện Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Mục tiêu Tối ưu quy trình multiplex real-time PCR sử dụng mẫu dò Taq-Man để phát nhanh GBS Tiêu chuẩn chọn Thai phụ có tuổi thai ≥37 tuần... tiếp GBS từ mẫu dịch phết âm đạo – trực tràng thai phụ vòng sau lấy mẫu Thời gian thực quy trình rút ngắn phương pháp tách chiết DNA GBS chu Tóm lại, quy trình real-time PCR cải tiến tối ưu b? ?ớc