Nghiên cứu tạo giống gốc và thử nghiệm sản xuất vacxin vô hoạt phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn từ chủng virus phân lập tại việt nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ PHẠM VĂN SƠN NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG GỐC VÀ THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT VACXIN VƠ HOẠT PHỊNG HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TỪ CHỦNG VIRUS PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Bệnh lý học chữa bệnh vật nuôi Mã số: 64 01 02 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Bá Hiên TS Nguyễn Văn Cảm NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các kết nghiên cứu trình bày luận án trung thực, khách quan chưa dùng bảo vệ để lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận án cảm ơn thơng tin trích dẫn luận án rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Tác giả luận án Phạm Văn Sơn i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án, tác giả nhận giúp đỡ tạo điều kiện nhiều người, sau lời cảm ơn chân thành tác giả: Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Bá Hiên TS Nguyễn Văn Cảm, người trực tiếp hướng dẫn suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận án Nhờ có hướng dẫn nhiệt tình ý kiến đóng góp quý báu thầy mà luận án tơi hồn thành Tơi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Quản lý đào tạo, Ban Chủ nhiệm khoa Thú y, Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Phịng Thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ sinh học Thú y, tồn thể thầy, giáo cán Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, trang bị cho kiến thức q báu giúp đỡ tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu Trân trọng cảm ơn nhóm nhà Khoa học nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu công nghệ sản xuất vacxin vơ hoạt phịng Hội chứng rối loạn sinh sản hơ hấp lợn” Thuộc chương trình KC-04 PGS.TS Nguyễn Bá Hiên chủ nhiệm tạo điều kiện cho tham gia nhiều công đoạn nghiên cứu cho phép sử dụng số kết nghiên cứu luận án Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp quan mà công tác tạo điều kiện thời gian, động viên, chia sẻ vật chất, tinh thần, giúp đỡ trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận án Hà Nội, ngày tháng Tác giả luận án Phạm Văn Sơn ii năm 2018 MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vii Danh mục bảng ix Danh mục hình xi Trích yếu luận án xiii Thesis abstract xv Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu chung 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.3.1 Đối tượng nghiên cứu 1.3.2 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Những đóng góp đề tài 1.5 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài 1.5.1 Ý nghĩa khoa học đề tài 1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Lịch sử tình hình dịch prrs lợn 2.1.1 Lịch sử tình hình dịch PRRS lợn giới 2.1.2 Lịch sử tình hình dịch PRRS lợn Việt Nam 2.2 Căn bệnh 14 2.2.1 Cấu trúc virus PRRS 14 2.2.2 Phân loại virus PRRS 17 2.2.3 Khả gây bệnh sức đề kháng virus PRRS 18 2.3 Truyền nhiễm học 19 2.3.1 Loài vật mắc bệnh 19 iii 2.3.2 Chất chứa mầm bệnh trình truyền lây 19 2.3.3 Cơ chế sinh bệnh, phương thức truyền lây đáp ứng miễn dịch 20 2.4 Triệu chứng bệnh tích 22 2.4.1 Triệu chứng lâm sàng 22 2.4.2 Bệnh tích 23 2.5 Chẩn đốn phịng trị bệnh 23 2.5.1 Chẩn đoán 23 2.5.2 Các biện pháp phòng trị bệnh 25 2.6 Giống gốc sản xuất vacxin 26 2.6.1 Định nghĩa 26 2.6.2 Cách chế tạo giống gốc 27 2.6.3 Cách quản lý giống gốc 27 2.6.4 Các phương pháp bảo quản giống gốc PRRSV phòng thí nghiệm 28 2.7 Nghiên cứu sản xuất vacxin phòng PRRS 30 2.7.1 Sản xuất vacxin phương pháp vô hoạt virus 30 2.7.2 Sản xuất vacxin phương pháp nhược độc virus môi trường tế bào 31 2.7.3 Phương pháp sản xuất vacxin hệ 32 Phần Nội dung, vật liệu phƣơng pháp nghiên cứu 36 3.1 Địa điểm nghiên cứu 36 3.2 Thời gian nghiên cứu 36 3.3 Vật liệu nghiên cứu 36 3.4 Nội dung nghiên cứu 36 3.4.1 Nghiên cứu biến đổi bệnh lý lợn ổ dịch PRRS thu thập mẫu 36 3.4.2 Phân lập tuyển chọn chủng giống gốc PRRSV 36 3.4.3 Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vacxin vô hoạt nhũ dầu phòng PRRS 37 3.5 Phương pháp nghiên cứu 37 3.5.1 Phương pháp mổ khám 37 3.5.2 Phương pháp RT - PCR 37 3.5.3 Phương pháp làm tiêu vi thể 40 3.5.4 Phương pháp nuôi cấy tế bào 41 3.5.5 Phương pháp nhân virus PRRS 42 3.5.6 Phương pháp xác định hiệu giá virus 43 iv 3.5.7 Phương pháp xác định quy luật sinh trưởng virus 43 3.5.8 Phương pháp giải trình tự gen 43 3.5.9 Phương pháp tinh chế kháng nguyên virus định lượng protein 45 3.5.10 Phương pháp gây tối miễn dịch chuột 45 3.5.11 Phương pháp trung hòa virus (phương pháp virus cố định huyết pha loãng) 46 3.5.12 Phương pháp IPMA 46 3.5.13 Phương pháp kiểm tra vô trùng giống PRRS (master seed working seed) 47 3.5.14 Phương pháp kiểm tra khiết giống (master seed workingseed) kỹ thuật PCR/RT-PCR 49 3.5.15 Phương pháp nuôi cấy tế bào MARC-145 hệ thống Bioreactor 49 3.5.16 Phương pháp cô đặc virus PRRS lọc tiếp tuyến 50 3.5.17 Phương pháp vô hoạt virus 51 3.5.18 Phương pháp kiểm tra sau vô hoạt 51 3.5.19 Phương pháp nhũ hóa vacxin 51 3.5.20 Phương pháp kiểm tra tiêu khiết vacxin 51 3.5.21 Kiểm tra tiêu an toàn 52 3.5.22 Phương pháp kiểm tra tiêu hiệu lực vacxin 52 3.5.23 Phương pháp Realtime RT-PCR 53 3.5.24 Phương pháp ELISA 54 3.5.25 Phương pháp thống kê, xử lý số liệu 55 Phần Kết thảo luận 56 4.1 Nghiên cứu số biểu bệnh lý lợn mắc PRRS 56 4.1.1 Thu thập mẫu bệnh phẩm 56 4.1.2 Chẩn đoán PRRS phương pháp RT-PCR 57 4.1.3 Nghiên cứu biến đổi bệnh lý đại thể 59 4.1.4 Nghiên cứu biến đổi bệnh lý vi thể 61 4.2 Phân lập tuyển chọn chủng giống gốc PRRS 64 4.2.1 Phân lập virus PRRS môi trường tế bào MARC-145 64 4.2.2 Nghiên cứu ổn định số đặc tính sinh học chủng virus PRRS phân lập Việt Nam 70 4.2.3 Đặc tính sinh học phân tử chủng virus PRRS 78 v 4.2.4 Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch động vật thí nghiệm với chủng virus PRRS nghiên cứu 97 4.2.5 Sản xuất giống gốc 101 4.3 Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vacxin vơ hoạt nhũ dầu phịng PRRS 106 4.3.1 Nhân giống sản xuất (Working seed) vacxin 106 4.3.2 Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vacxin vô hoạt PRRS 108 4.3.3 Nghiên cứu kiểm nghiệm vacxin vô hoạt PRRS 114 Phần Kết luận kiến nghị 122 5.1 Kết luận 122 5.2 Kiến nghị 122 Danh mục cơng trình cơng bố có liên quan đến luận án 123 Tài liệu tham khảo 124 Phụ lục 135 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Viết đầy đủ BEI Binary Ethylenimine CSF Classical swine fever CPE Cytophathogenic Effect DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium DMSO Dimethyl sulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EMCV Encephalomyocarditis virus ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay FBS Fetal Bovine Serum GP Glyco protein HE Haematoxylin – Eosin IFA Immunofluorescence assay IHC Immuno Histochemistry IPMA Immunoperoxidase monolayer Assay KKT Kháng kháng thể MLV Modifier Live Vacine MOI Multiplicity Of Infection MSD Mystery Swine Disease NSP Non structural protein OD Optical Density OIE Office International des Epizooties ORF Open Reading Frame PAM Porcine Alveolar Macrophage PBS Photphat Buffer Saline PCR Polymerase Chain Reaction PCV2 Porcine circovirus type PEDV Porcine epidemic diarrhea virus PEARS Porcine Epidemic Abortion and Respiratory Syndrome vii viii Chữ viết tắt Viết đầy đủ PPV Porcine parvovirus PPLO Pleuropneumonia-like organism PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus PRV Porcine Pseudorabies virus RNA Ribonucleic acid RT- PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction SIRD Swine Infertility and Respiratory Disease SIV Swine Influenza Virus S/P Sample/Positive SP Structural protein TAE Tris-acetate-EDTA TCID50 50% Tissue Culture Infective Dose TGE Transmissible gastroenteritis TMB 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine TPB Triptose phosphas broth ... chủng giống gốc đại diện cho chủng virus PRRS lưu hành Việt Nam, việc tiến hành thực nghiên cứu tạo giống gốc thử nghiệm sản xuất vacxin vơ hoạt phịng hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn từ. .. Việt Nam sử dụng làm giống gốc phục vụ sản xuất thử nghiệm vacxin vô hoạt PRRS Sản xuất thử nghiệm thành công vacxin vô hoạt PRRS từ giống gốc PRRS tuyển chọn Vacxin vô hoạt PRRS nghiên cứu sản. .. Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm thành công vacxin vô hoạt PRRS từ chủng virus thực địa, vacxin vô hoạt PRRS Việt Nam nghiên cứu sản xuất Quy trình sản xuất vacxin vơ hoạt PRRS chuyển giao để sản