Đang tải... (xem toàn văn)
Sản xuất thử nghiệm thành công vacxin vô hoạt PRRS từ giống gốc PRRS được tuyển chọn. Vacxin vô hoạt PRRS nghiên cứu sản xuất ra đạt các tiêu chí về vô trùng, thuần khiết, an toàn và hiệu lực.
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ PHẠM VĂN SƠN NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG GỐC VÀ THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT VACXIN VƠ HOẠT PHỊNG HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TỪ CHỦNG VIRUS PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Bệnh lý học chữa bệnh vật ni Mã sớ : 9.64.01.02 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÀ NỘI, 2018 Cơng trình hồn thành tại: HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn khoa học: Phản biện 1: PGS TS Nguyễn Bá Hiên TS Nguyễn Văn Cảm GS.TS Nguyễn Quang Tuyên Trường Đại học Nông lâm, Đại học Thái Nguyên Phản biện 2: GS.TS Lê Thanh Hòa Viện Cơng nghệ sinh học Phản biện 3: PGS TS Phạm Công Hoạt Bộ Khoa học Công nghệ Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện, họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi 08h0 ngày 28 tháng 12 năm 2018 Có thể tìm hiểu Luận án thư viện: - Thư viện Quốc gia - Thư viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome – PRRS) hay bệnh tai xanh đặc trưng rối loạn sinh sản lợn nái vấn đề đường hô hấp lợn lợn trưởng thành (Meulenberg et al., 1993) Bệnh gây virus PRRS, thuộc Nidovirales, họ Arteriviridae, chi Arterivirus (Cavanagh, 1997) Virus PRRS nhóm thành hai kiểu gen, châu Âu (type 1) Bắc Mỹ (type 2), dấu hiệu lâm sàng nhiễm trùng giống nhau, chủng phân lập lại khác độc lực động vật nhiễm bệnh (Halbur et al., 1995b) khác đặc tính kháng nguyên, di truyền (Meng, 2000; Nelsen et al., 1999; Nelson et al., 1993) Dịch PRRS xuất hầu hết khu vực chăn nuôi lợn quy mô lớn khắp giới Tổn thất hàng năm cho ngành chăn nuôi lợn Hoa Kỳ PRRSV gây ước tính khoảng 664 triệu USD (Holtkamp et al., 2013) Đối với lợn nái, bệnh gây hậu nghiêm trọng như: lợn sơ sinh yếu ớt, giảm số sơ sinh sống sót/ổ, tình trạng bệnh âm ỉ, rối loạn sinh sản, động dục kéo dài, chậm động dục trở lại Đối với đực giống, số lượng tinh dịch giảm, chất lượng tinh dịch kém, ảnh hưởng đến tỷ lệ thụ thai chất lượng đàn (Pejsak et al., 1997) Kháng thể kháng PRRSV lần phát Việt Nam năm 1997 đàn lợn nhập từ Mỹ Từ năm 2007 đến nay, PRRS liên tục xảy bùng phát rộng khắp tỉnh thành nước gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi Tình hình PRRS ngày phức tạp đòi hỏi chủ động phòng chống dịch, phương pháp phòng PRRS hiệu sử dụng vacxin Tuy nhiên, đa dạng di truyền thay đổi kháng nguyên chủng PRRSV trở ngại lớn việc phát triển loại vacxin có hiệu để kiểm soát PRRS Các vacxin sống sử dụng phổ biến để kiểm sốt PRRS chúng có khả bảo vệ tốt so với vacxin vô hoạt vacxin tái tổ hợp (Charerntantanakul, 2012; Hu and Zhang, 2014; Kim et al., 2011; Zuckermann et al., 2007) Nhưng ngày có nhiều quan ngại an tồn việc sử dụng vacxin sống hồi phục nhanh chóng độc lực PRRSV trình chép lợn (Hu and Zhang, 2014; Mengeling et al., 2003; Pejsak et al., 1997) Hiện nay, trước tình hình nước ta phải tốn nhiều chi phí cho loại vacxin ngoại nhập mà hiệu phòng bệnh chưa mong muốn Nhằm chủ động nguồn cung cấp vacxin hiệu cao, an tồn giảm chi phí nhập vacxin, việc sản xuất vacxin vô hoạt từ chủng virus PRRS phân lập Việt Nam việc làm cần thiết có ý nghĩa thực tiễn cao Để sản xuất vacxin hiệu cần phải có chủng giống gốc đại diện cho chủng virus PRRS lưu hành Việt Nam, tiến hành nghiên cứu Với mục tiêu lựa chọn giống gốc, sản xuất vacxin vơ hoạt PRRS đạt tiêu chí an tồn, có hiệu lực cao để phòng bệnh cho lợn 1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 1.2.1 Mục tiêu chung Sản xuất vacxin vơ hoạt PRRS có hiệu từ chủng virus phân lập Việt Nam 1.2.2 Mục tiêu cụ thể Tuyển chọn chủng virus PRRS phân lập từ lợn mắc PRRS Việt Nam, sử dụng làm giống gốc phục vụ sản xuất thử nghiệm vacxin vô hoạt PRRS Sản xuất thử nghiệm thành công vacxin vô hoạt PRRS từ giống gốc PRRS tuyển chọn Vacxin vô hoạt PRRS nghiên cứu sản xuất đạt tiêu chí vơ trùng, khiết, an toàn hiệu lực 1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU 1.3.1 Đối tượng nghiên cứu Các chủng virus PRRS cường độc phân lập từ lợn mắc PRRSở Việt Nam 1.3.2 Phạm vi nghiên cứu Phạm vi không gian nghiên cứu: Các chủng virus PRRS phân lập từ lợn mắc PRRS thu thập tỉnh: Hà Nội, Thái Bình, Nam Định, Hưng n, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, TP Hồ Chí Minh, Tiền Giang, Cần Thơ Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ sinh học Thú y phòng thí nghiệm mơn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam Thời gian nghiên cứu: Nghiên cứu thực từ 2014-2017 1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI Đề tài lần tuyển chọn chủng virus PRRS phân lập Việt Nam để làm giống gốc sử dụng cho sản xuất vacxin vơ hoạt phòng PRRS cho lợn Giống gốc PRRS thẩm định quan thú y có thẩm quyền đạt tiêu chí vơ trùng, khiết, có hiệu giá cao, có khả kích thích miễn dịch tốt, kháng thể vacxin tạo trung hòa chủng virus PRRS lưu hành Việt Nam Đề tài luận án đưa quy trình phân lập, sàng lọc tuyển chọn giống gốc Trên sở này, áp dụng để tạo chủng Master seed thay chủng cũ khơng đáp ứng tính tương đồng kháng nguyên Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm thành công vacxin vô hoạt PRRS từ chủng virus thực địa, vacxin vô hoạt PRRS Việt Nam nghiên cứu sản xuất Quy trình sản xuất vacxin vơ hoạt PRRS chuyển giao để sản xuất vacxin phòng PRRS cho đàn lợn, giúp người chăn nuôi giảm thiệt hại kinh tế PRRS gây 1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.5.1 Ý nghĩa khoa học đề tài Những kỹ thuật, quy trình áp dụng đề tài góp phần nâng cao lực nghiên cứu cho người làm lĩnh vực thú y Các kết nghiên cứu phản ảnh đầy đủ đặc điểm sinh học, sinh học phân tử, đặc tính kháng nguyên tính sinh miễn dịch chủng virus PRRS lưu hành Việt Nam Cung cấp thông tin tham khảo, tham chiếu cho nhà khoa học nghiên cứu virus PRRS Việt Nam giới 1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài Giống gốc tuyển chọn chủng virus PRRS đại diện cho chủng virus lưu hành Việt Nam sử dụng để sản xuất kháng thể đơn dòng, đa dòng, phục vụ sản xuất kháng thể trị bệnh kháng thể chẩn đốn bệnh Giống gốc sử dụng để sản xuất kháng nguyên chế tạo Kít ELISA chẩn đốn bệnh, Kít phát nhanh bệnh, góp phần vào cơng phòng chống PRRS cho tồn ngành chăn nuôi Đề tài nghiên cứu sản xuất thành công vacxin vô hoạt PRRS đạt tiêu vô trùng, khiết, an toàn hiệu lực, sở quan trọng để ứng dụng nghiên cứu sản xuất loại vacxin virus khác giúp nâng cao lực sản xuất vacxin vật nuôi ngành Thú y nước nhà, hạn chế nhập vacxin Vacxin vô hoạt PRRS chuyển giao sản xuất quy mơ cơng nghiệp, tạo vacxin có hiệu rẻ so với vacxin nhập ngoại thị trường, góp phần khống chế dịch bệnh, giảm thiệt hại cho ngành chăn nuôi PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 LỊCH SỬ VÀ TÌNH HÌNH DỊCH PRRS Ở LỢN 2.1.1 Lịch sử tình hình dịch PRRS lợn giới Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn ghi nhận lần Mỹ vào năm 1987 với tên "bệnh bí hiểm" (Mystery swine disease) tính tự nhiên khó hiểu bệnh nguyên Hội nghị quốc tế bệnh tổ chức St Paul, Minnesota trí dùng tên PRRS Tổ chức Thú y giới cơng nhận thức gọi "Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn" (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome-PRRS), nguyên bệnh gọi virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus PRRSV) 2.1.2 Lịch sử tình hình dịch PRRS lợn Việt Nam Lần lịch sử vào năm 1997, kháng thể kháng PRRSV phát đàn lợn nhập từ Mỹ vào tỉnh miền Nam Kết kiểm tra thấy, 10/51 lợn giống nhập có huyết dương tính với PRRS Tồn số lợn xử lý vào thời gian Tuy nhiên, năm tiếp theo, nghiên cứu bệnh trại lợn giống tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ lợn có huyết dương tính với bệnh khác từ 1,3% 68,29% (Cục Thú y, 2008) 2.2 CĂN BỆNH 2.2.1 Cấu trúc virus PRRS Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp (PRRSV) thuộc chi Arterivirus, họ Arteriviridae, Nidovirales Hạt virus thường có hình oval với đường kính xấp xỉ 60nm bề mặt có gai cấu tạo từ phức hợp protein màng Virus PRRS virus sợi đơn dương với kích thước phân tử 15,1- 15,5 kb (Dokland, 2010) Genome virus PRRS có kích thước khoảng 15kb, gồm 10 khung đọc mở ORF (open reading frames): ORF1a, ORF1b, ORF2, ORF2b, ORF3, ORF4, ORF5, ORF5a, ORF6, ORF7 mã hóa cho protein cấu trúc phi cấu trúc 2.2.2 Phân loại virus PRRS Hiện nay, PRRSV xác lập với kiểu gen kiểu gen có nguồn gốc từ châu Âu (EU) kiểu gen có nguồn gốc từ Bắc Mỹ (NA) Việc so sánh chuỗi gen cho thấy khác biệt di truyền quan trọng nhóm 2.2.3 Khả gây bệnh sức đề kháng virus PRRS Về mặt độc lực, người ta thấy PRRSV tồn dạng: ▪ Dạng cổ điển: có độc lực thấp, dạng lợn mắc bệnh tỷ lệ chết thấp, từ 1% - 5% tổng đàn ▪ Dạng biến thể độc lực cao: gây nhiễm chết nhiều lợn 2.3 TRUYỀN NHIỄM HỌC 2.3.1 Loài vật mắc bệnh Lợn lứa tuổi, người động vật khác không mắc bệnh, nhiên loài thuỷ cầm chân màng, vịt trời (Mallard duck) lại mẫn cảm với virus 2.3.2 Chất chứa mầm bệnh q trình truyền lây Virus có dịch mũi, nước bọt, phân, nước tiểu lợn ốm, mang trùng phát tán môi trường Tinh dịch lợn đực giống xác định nguồn phát tán mầm bệnh 2.3.3 Cơ chế sinh bệnh, phương thức truyền lây đáp ứng miễn dịch 2.3.3.1 Cơ chế sinh bệnh Virus có lực cao với đại thực bào, đặc biệt đại thực bào phế nang Vì vậy, virus nhân lên đại thực bào, sau giết chết đại thực bào Có tới 40% đại thực bào bị phá hủy PRRSV loại bỏ phần lớn chế bảo vệ thể, cho phép vi khuẩn, virus khác tăng sinh gây hại 2.3.3.2 Phương thức truyền lây Bệnh lây lan trực tiếp thông qua tiếp xúc lợn ốm, lợn mang trùng với lợn khoẻ lây gián tiếp qua nhân tố trung gian bị nhiễm virus như: dụng cụ, thiết bị chăn nuôi; phương tiện vận chuyển; lồi trùng; lồi có vú khác gia cầm (Tô Long Thành, 2007) 2.3.3.3 Đáp ứng miễn dịch Về khả bảo hộ chéo type PRRSV vacxin với type PRRSV khác nhiều ý kiến chưa thống Kovacs and Schagemann (2003) báo cáo vacxin sống Ingelvac- PRRS MLV (chủng Bắc Mỹ) có khả bảo hộ chéo cơng cường độc virus PRRS chủng châu Âu Tài liệu hướng dẫn sử dụng vacxin JXA1R (Ngô Thanh Long, 2011) cho biết, vacxin (chứa virus Bắc Mỹ biến đổi) có khả bảo hộ lợn phòng PRRS chủng Bắc Mỹ cổ điển gây 2.4 TRIỆU CHỨNG VÀ BỆNH TÍCH 2.4.1 Triệu chứng lâm sàng Triệu chứng lâm sàng lợn mắc PRRS thay đổi phụ thuộc vào chủng virus, trạng thái miễn dịch đàn, điều kiện quản lý chăm sóc Thời gian nung bệnh từ 3-5 ngày Các dấu hiệu bỏ ăn, sốt, xanh da Các triệu chứng tùy thuộc vào tuổi lợn giai đoạn mang thai (Tơ Long Thành, 2007) 2.4.2 Bệnh tích Bệnh tích biến đổi chủ yếu phổi Thuỳ phổi bị bệnh màu đỏ xám, có mủ đặc (nhục hố) Bề mặt cắt ngang thuỳ phổi lồi ra, khô xuất nốt loét quan nội tạng (Lê Văn Năm, 2007) 2.5 CHẨN ĐOÁN VÀ PHỊNG TRỊ BỆNH 2.5.1 Chẩn đốn 2.5.1.1 Chẩn đốn lâm sàng Chẩn đốn lâm sàng dựa vào hai nhóm triệu chứng: + Triệu chứng đường sinh sản: Trong giai đoạn đầu ổ dịch thấy tượng sảy thai cuối thời kỳ mang thai, lợn nái đẻ non, thai yếu, thai chết lưu thai gỗ, lợn đẻ yếu, lợn chết trước cai sữa + Triệu chứng đường hơ hấp: Lợn có triệu chứng viêm phổi lây lan nhanh đàn 2.5.1.2 Chẩn đốn phòng thí nghiệm + Phân lập virus số tế bào: Tế bào phế nang lợn, tế bào MA- 104, CL 2621, CRL-17171, MARC-145 + Phương pháp bệnh lý miễn dịch + Phương pháp huỳnh quang gián tiếp phát kháng nguyên + Phương pháp nhân gen (PCR) + Phương pháp lai phân tử chỗ (institu hybridization) - Giải trình tự gen NSP2 ORF5 PRRSV - Gây bệnh thực nghiệm: Sử dụng lợn 21 ngày tuổi đàn; khơng mang PRRSV (PRRSV-Ag) khơng có kháng thể PRRSV (PRRSV-Ab); tiêm 0,5 ml/con; nhỏ mũi ml/con 2.5.2 Các biện pháp phòng trị bệnh 2.5.2.1 Điều trị PRRS Hiện chưa có thuốc đặc trị với PRRS, để làm giảm thiệt hại bệnh, chủ yếu theo hướng nâng cao sức đề kháng cho vật nuôi, chữa triệu chứng lâm sàng, giảm nhẹ tập trung vào điều trị bệnh kế phát 2.5.2.2 Một số chế phẩm vacxin PRRS dùng để phòng bệnh Hiện nay, Việt Nam có loại vacxin PRRS phép lưu hành 2.6 GIỐNG GỐC TRONG SẢN XUẤT VACXIN 2.6.1 Định nghĩa Giống gốc (Master seed - MS) lượng virrus cụ thể đủ lớn mà khiết, an tồn tính kháng nguyên hệ sau thử nghiệm, chứng minh dùng làm giống để chế tạo vacxin 2.6.2 Cách chế tạo giống gốc Việc chế tạo giống gốc tùy thuộc vào loại virus, cách quản lý quốc gia, phương pháp chế tạo vacxin sáng tạo nhà khoa học Về lý thuyết, virus dùng để chế tạo giống gốc 2.6.3 Cách quản lý giống gốc Các nước phương Tây đầu việc đưa khái niệm giống gốc quản lý giống gốc Việc bắt nguồn từ phương pháp quản lý sở hữu tư nhân kéo theo việc đăng ký quyền Nói cách khác, việc sản xuất vacxin hãng tư nhân họ đòi hỏi nhà nước bảo hộ quyền cho họ 2.6.4 Các phương pháp bảo quản giống gốc PRRSV phòng thí nghiệm 2.6.4.1 Phương pháp cấy chuyển virus PRRS liên tục tế bào MARC-145 Virus PRRS thích hợp phát triển tế bào MARC-145, sau cấy chuyển bảo quản nhiệt độ thích hợp Phương pháp lặp lại thời hạn định, thường áp dụng trường hợp dùng liên tục virus PRRS để nghiên cứu làm thí nghiệm (thường cấy chuyển đời sau chuyển thành giống sản xuất - working seed) 2.6.4.2 Phương pháp đông khô virus Đây phương pháp phổ biến có hiệu cao cho bảo quản đối tượng vi sinh vật khác có virus PRRS 2.6.4.3 Phương pháp đông khô dịch thể trực tiếp Phương pháp nhanh thuận lợi cho đợt bảo quản số lượng mẫu lớn Thông thường theo phương pháp này, virus bảo quản từ 10-20 năm 2.6.4.4 Phương pháp bảo quản lạnh sâu Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu virus bảo quản môi trường dịch thể nhiệt độ lạnh sâu (-196°C -> -80°C) 2.7 NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VACXIN PHÒNG PRRS 2.7.1 Sản xuất vacxin phương pháp vô hoạt virus Vacxin vơ hoạt thường sử dụng nhằm phòng chống bệnh tai xanh đàn lợn nái, trại lợn chưa xuất bệnh tai xanh Việc sản xuất vacxin vô hoạt thực cách phân lập nuôi cấy chủng PRRSV thực địa môi trường tế bào tiến hành vô hoạt chúng số chất vô hoạt BEI, formaline β propiolactone 2.7.2 Sản xuất vacxin phương pháp nhược độc virus môi trường tế bào Về nguyên lý chung, để tạo chủng virus PRRS nhược độc dùng làm vacxin, chủng virus PRRS cường độc cấy truyền nhiều đời môi trường tế bào Cụ thể, để làm chủng virus PRRS cường độc thành chủng virus PRRS nhược độc, công ty Boehringer–Ingelheim Corp cấy truyền 37 đời, công ty Hippra Corp cấy truyền 20 đời 2.7.3 Phương pháp sản xuất vacxin hệ Vacxin DNA, sử dụng khung đọc mở, từ ORF1 ORF7 để chế tạo vacxin Vacxin đơn vị (subunit): dùng protein virus để chế vacxin, ví dụ dùng GP5 Vacxin peptide tổng hợp: GP5.Vacxin vector: dùng nhiều loại virus, vi khuẩn làm vector tái tổ hợp Tất vacxin thử nghiệm không cho kết vượt trội nào, chưa đạt mục tiêu phòng bệnh vacxin PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Phòng thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ sinh học Thú y, phòng thí nghiệm môn Vi sinh vật truyền nhiễm, Khu nuôi động vật thí nghiệm - Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam Thời gian nghiên cứu từ năm 2014 đến năm 2017 3.2 ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu Lợn nghi mắc PRRS, chủng virus PRRS cường độc phân lập từ lợn mắc PRRS Việt Nam 3.2.2 Vật liệu nghiên cứu Máy móc, thiết bị sử dụng đề tài : Box an toàn sinh học Cấp II (Esco), tủ ấm CO2 (Memmert), kính hiển vi soi ngược (Leica), máy PCR (Biorad), máy giải trình tự gen (Backman Counter), máy điện di, máy votex (IKa), máy ly tâm (eppendorf), tủ -80oC (Sanyo), máy đồng hóa tạo nhũ, hệ thống Bioreactor, máy lọc tiếp tuyến, máy đọc ELISA (Bioteck), kính hiển vi thường (Zeiss) Dụng cụ: Pipet (Eppendorf), đầu típ loại (Corning), bình ni cấy tế bào T25, T75, T225 (Corning), màng lọc (corning), khay 96 (Corning), ống eppendorf, ống ly tâm 15ml, 50ml (corning), bơm tiêm, găng tay, trang Hóa chất: mơi trường ni cấy tế bào DMEM (Gibco), tế bào dòng MARC-145, kít tách chiết RNA, DNA (Qiagen), Kít PCR/RT-PCR (Invitrogen), kít Realtime - PCR (Invitrogen), kít giải trình tự gen (Backman Counter), Kít ELISA (Idexx), hóa chất cho ni cấy tế bào, hóa chất cho kỹ thuật IPMA, hóa chất vơ hoạt virus (Merk), nhũ dầu (Seppic) 3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Nghiên cứu biến đổi bệnh lý lợn ổ dịch PRRS thu thập mẫu - Phân lập tuyển chọn chủng giống gốc PRRSV - Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vacxin vơ hoạt nhũ dầu phòng PRRS 3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1 Phương pháp mổ khám Trong nghiên cứu này, trình mổ khám thực theo TCVN 8402:2010 3.4.2 Phương pháp RT – PCR Quy trình tách chiết RNA virus dùng KIT hãng Qiagen Sản phẩm phản ứng RT - PCR kiểm tra phương pháp điện di Kết thúc điện di, gel lấy nhuộm Ethidium bromide SYBR green khoảng đến phút Sau nhuộm gel chuyển vào máy phát tia UV để quan sát kết điện di Vị trí đoạn DNA phát vệt sáng tương ứng thuốc nhuộm, chụp ảnh lưu kết 3.4.3 Phương pháp làm tiêu vi thể Từ mẫu bệnh phẩm có biến đổi đại thể, lấy mẫu ngâm formol trung tính 10% để làm tiêu vi thể Cần tiến hành làm tiêu để xác định bệnh tích vi thể chủ yếu bệnh Phương pháp làm tiêu vi thể theo quy trình tẩm đúc parafin, nhuộm Haematoxilin - Eosin (HE) Bộ môn Bệnh lý Thú y 3.4.4 Phương pháp nuôi cấy tế bào Tế bào MARC-145 nuôi cấy môi trường đầy đủ DMEM, 10% FBS 3.4.5 Phương pháp nhân virus PRRS Tiến hành nhân virus tế bào MARC-145 tế bào nuôi cấy bình ni T25 có độ che phủ đáy bình 60 - 70% Loại bỏ môi trường nuôi cấy cũ rửa tế bào lần PBS1X Bổ sung 0,5ml virus gốc/T25 Ủ virus tế bào 1h 370C Sau ủ loại bỏ dịch ủ bổ sung ml mơi trường trì DMEM 2% FBS Nuôi virus tủ ấm 370C, 5% CO2, quan sát biến đổi bệnh tích tế bào MARC-145 kính hiển vi soi ngược sau 24h, 48h, 60h, 72h Thu virus bệnh tích tế bào đạt 80% 3.4.6 Phương pháp xác định hiệu giá virus TCID50 xác định theo phương pháp Spearman Kaber Lg TCID50 = (Xo + d/2) - d × (∑ri/n) Trong đó: Xo lg bậc pha loãng virus cao d: lg bậc pha loãng ri: số giếng tế bào âm tính bậc pha lỗng n: số giếng tế bào gây nhiễm bậc pha loãng 3.4.7 Phương pháp xác định quy luật sinh trưởng virus Tế bào MARC-145 chuẩn bị vào khay 96 giếng (5×104 tế bào/giếng) ni mô tả Virus PRRS gây nhiễm lên tế bào MOI 0,01 Sau ủ, để virus bám vào tế bào, huyễn dịch chứa virus hút bỏ môi trường nuôi dưỡng rửa lần với 0,5ml PBS Sau đó, dung dịch nuôi dưỡng thiết yếu bổ sung vào môi trường ni cấy 100µl/giếng Virus thu từ dịch phần tế bào thời điểm 24, 48, 60, 72, 84, 96 sau gây nhiễm virus Tiến hành xác định hiệu giá ống virus thu để định lượng virus Đường biểu biễn nhân lên virus xây dựng có biến log TCID50 thời điểm thu virus 3.4.22 Phương pháp kiểm tra tiêu hiệu lực vacxin Theo TCVN8684:2011 3.4.23 Phương pháp Realtime RT-PCR Thực phản ứng Realtime RT-PCR theo TCVN 8400-21:2014 3.4.24 Phương pháp ELISA - Các bước tiến hành theo hướng dẫn Kit Đọc kết quả: Kết quả: SP ≥ 0,4: Dương tính SP < 0,4: Âm tính 3.4.25 Xử lý số liệu Phân tích xác nhận chuỗi gen thu thơng qua chương trình Blast Ngân hàng gen (GenBank) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) Xác định tương đồng nucleotide phân đoạn gen thu nghiên cứu phần mềm Bioedit Version 7.2.5 Xác định nguồn gốc phát sinh chủng loại sở trình tự gen chủng virus thu nhận phần mềm MEGA Version 6.0 Các số liệu xử lý phần mềm Excel 2010 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ BIỂU HIỆN BỆNH LÝ CỦA LỢN MẮC PRRS 4.1.1 Kết thu thập mẫu bệnh phẩm Để phục vụ việc tuyển chọn virus PRRS làm giống sản xuất vacxin, tiến hành thu thập mẫu lợn nghi mắc PRRS từ thực địa Kết thu 57 lợn nghi mắc PRRS Kết cho thấy nhóm lợn nghiên cứu biểu triệu chứng sốt cao, bỏ ăn, thân ửng đỏ, tiêu chảy, tai thâm tím, chảy nước mũi 4.1.2 Kết chẩn đốn PRRS phương pháp RT-PCR Từ 57 lợn thu thập, để khẳng định xác lợn mắc PRRS sử dụng kỹ thuật RT- PCR Kết chẩn đốn PRRS kỹ thuật RT - PCR trình bày bảng 4.1 Bảng 4.1 Kết phản ứng RT-PCR chẩn đoán PRRS TT Nhóm lợn Lợn theo mẹ Lợn sau cai sữa Lợn choai Nái mang thai Nái nuôi Tổng số Số lượng (con) Dương tính (con) Tỉ lệ dương tính (%) 13 10 11 15 57 07 06 06 05 09 33 53,8 60,0 54,5 62,5 60,0 57,9 11 Kết bảng 4.1 cho thấy, có 33 mẫu lợn thu thập địa phương dương tính với virus PRRS, chiếm tỷ lệ 57,9 %; mẫu dương tính phân bố đối tượng lợn 4.1.3 Kết nghiên cứu biến đổi bệnh lý đại thể Bằng phương pháp mổ khám toàn diện mẫu lợn thu thập, mô tả ghi chép chi tiết trường hợp, so sánh với kết chẩn đoán RT-PCR, tất trường hợp dương tính với PRRS có dấu hiệu bệnh tích điển hình giống khí quan Kết trình bày bảng 4.2 Bảng 4.2 Bệnh tích đại thể phổi lợn mắc PRRS Số Số có Tỉ lệ theo dõi biểu (%) Viêm màng phổi 33 18 54,5 Phổi xuất huyết 33 33 100,0 Viêm phổi hóa mủ 33 16 48,5 Phổi hoại tử 33 6,1 Phổi nhục hóa 33 6,1 Mặt cắt phổi nhớt 33 26 78,8 Phổi tụ máu 33 21 63,6 Phù phổi 33 15,2 Phổi có hạt khác thường 33 39,4 10 Hạch phổi có bệnh tích 33 33 0,0 Phổi xuất huyết tạo đám, mảng loang lổ, hình dạng phổi bẹp áp sát vào khung sườn, rìa phổi có dịch nhầy đặc giống đờm, mặt cắt phổi có mủ, nhiều lợn bệnh có bệnh tích viêm phổi dính sườn STT Bệnh tích 4.1.4 Kết nghiên cứu biến đổi bệnh lý vi thể Nghiên cứu biến đổi vi thể, nhuộm đọc tiêu kính hiển vi, thu kết trình bày bảng 4.3 Bảng 4.3 Bệnh tích vi thể phổi, hạch phổi hạch amidan lợn mắc PRRS Phổi Hạch phổi Hạch amidan Số Số Số Số Số Số mẫu mẫu mẫu Bệnh tích mẫu Tỷ lệ mẫu Tỷ lệ mẫu Tỷ lệ có có có nghiên (%) nghiên (%) nghiên (%) biểu biểu biểu cứu cứu cứu hiện Sung huyết 33 33 100,0 33 33 100,0 33 15 45,5 Xuất huyết 33 33 100,0 33 33 100,0 33 13 39,4 Thâm nhiễm tế bào viêm 33 32 97,0 33 12 36,4 33 6,1 Thoái hóa tế bào 33 13 39,4 33 10 30,3 33 15 45,5 Huyết khối lòng mạch 33 30 90,9 33 9,1 33 0,0 Qua bảng 4.3 cho thấy bệnh lý vi thể phổi, hạch phổi rõ ràng 100% tiêu đọc thấy sung huyết xuất huyết Các phế nang chứa đầy dịch rỉ viêm Sự thâm nhiễm tế bào viêm phổi có tỷ lệ cao 12 4.2 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG GIỐNG GỐC PRRS 4.2.1 Kết phân lập virus PRRS môi trường tế bào MARC-145 4.2.1.1 Kết xác định khả gây bệnh tích tế bào chủng virus PRRS phân lập Sử dụng dòng tế bào MARC-145 mơi trường ni cấy DMEM cho phân lập virus PRRS, tiến hành phân lập toàn mẫu phổi hạch phổi mẫu dương tính với virus PRRS xác định phương pháp RT-PCR Kết phân lập virus PRRS trình bày bảng 4.4 Bảng 4.4 Kết phân lập virus PRRS môi trường tế bào MARC-145 Địa phương phân lập Số lượng chủng virus phân lập Hà Nội Hưng Yên Thái Bình Nam Định Ninh Bình Thanh Hố Nghệ An TP Hồ Chí Minh Tiền Giang Cần Thơ Tổng 33 Như vậy, từ ca bệnh dương tính với PRRS, chúng tơi phân lập virus PRRS gây bệnh tương ứng Cùng với việc phân lập virus PRRS, theo dõi ghi chép thời điểm xuất bệnh tích tế bào thời điểm tế bào bị virus phá hủy hoàn toàn Kết khả gây bệnh tích tế bào chủng virus PRRS phân lập trình bày bảng 4.5 STT 10 Bảng 4.5 Khả gây bệnh tích tế bào chủng virus PRRS phân lập TT Thời gian Xuất Tế bào bị bệnh tích phá hủy tế bào hồn tồn Kí hiệu chủng virus phân lập 008HN, 012HY, 049HY 122NĐ, 010TB, 012NA, 052TH, 042TP, 072TG, 082CT 011HN, 032TB, 113HY 046NB, 42TH, 048CT, 48h 96h 092CT 48h 108h 023NĐ, 135TP 016HN, 041HN, 063HN, 092NĐ, 063NB, 031TH, 60h 96h 061TH, 101TH, 115HY 60h 108h 022HN, 055NĐ, 083TH162NA, 102NA Qua bảng kết bảng 4.5 thấy rằng, virus gây bệnh tích tế bào sớm 48h sau gây nhiễm bệnh tích tế bào xuất muộn 60h sau gây 48h 84h 13 nhiễm virus Tế bào bị phá hủy hoàn toàn sau 84h đến 108h sau gây nhiễm tùy thuộc vào chủng virus 4.2.1.2 Kết xác định hiệu giá chủng virus PRRS phân lập Sau trình phân lập virus ban đầu, chúng tơi tiến hành nghiên cứu hồ sơ thu mẫu (theo vùng địa lý khác thời điểm thu mẫu khác nhau), triệu chứng ca bệnh, biến đổi đại thể, biến đổi vi thể điển hình, khả nhân lên môi trường tế bào, sơ lựa chọn 20 chủng virus PRRS phân lập đại diện khác để tiến hành xác định hiệu giá virus Tiến hành xác định hiệu giá virus (TCID50) chủng PRRS phân lập theo phương pháp trình bày phần II Kết thể bảng 4.6 Bảng 4.6 Kết xác định hiệu giá chủng PRRSV phân lập TT Chủng virus Hiệu giá virus TCID50/ml 041HN 6,67 ×103 011HN 1,44 ×104 008HN 3,16 × 105 022HN 6,67 ×102 049HY 1,26 × 106 012HY 6,67 × 105 010TB 3,16 × 106 032TB 3,16 ×104 092NĐ 3,16 ×104 10 122NĐ 1,44 × 105 11 052TH 6,67 × 105 12 031TH 6,67 ×104 13 061TH 3,16 ×103 14 042TH 1,44 ×102 15 012NA 1,96 × 106 16 162NA 6,67×104 17 102NA 1,44 ×102 18 042TP 1,44 × 105 19 072TG 6,67 × 105 20 082CT 3,16 × 104 Kết xác định hiệu giá chủng virus PRRS nghiên cứu cho thấy, chủng virus PRRS phân lập có hiệu giá TCID50 giao động từ 102 đến 106 Trong đó, hiệu giá thấp chủng virus 102NA TCID50 đạt 1,44 × 102 cao chủng virus 010TB TCID50 đạt 3,16 × 106 4.2.1.3 Kết xác định quy luật nhân lên môi trường nuôi cấy chủng virus PRRS phân lập Chúng chọn 10 chủng virus PRRS có hiệu giá tương đối cao, có khả phát triển nhân lên tốt môi trường tế bào MARC-145 để tiếp tục nghiên 14 cứu quy luật nhân lên Kết chủng virus PRRS lựa chọn nghiên cứu quy luật phát triển, nhân lên trình bày bảng 4.7 Nghiên cứu quy luật nhân lên 10 chủng virus PRRS thấy rằng, nhân lên virus môi trường nuôi cấy q trình liên tục Trong có thời điểm virus có hàm lượng thấp, có thời điểm virus đạt hàm lượng cao Có thể chia quy luật nhân lên virus PRRS môi trường nuôi cấy thành pha phát triển Pha một, virus bắt đầu xâm nhập nhân lên tế bào cảm thụ gây bệnh tích tế bào tế bào bị phá hủy 80%, lúc hiệu giá virus đạt cao (đỉnh sinh trưởng virus), pha thường 24h sau gây nhiễm kéo dài đến 60h 72h sau gây nhiễm Pha hai, virus phá hủy gần 100% tế bào cảm thụ giải phóng mơi trường, lúc hiệu giá virus bắt đầu giảm, pha thường 84h đến 96h sau gây nhiễm Cụ thể 10 chủng virus nghiên cứu đạt hiệu giá cao 72h sau gây nhiễm, sau giảm dần Bảng 4.7 Các chủng virus PRRS lựa chọn nghiên cứu quy luật nhân lên TT Chủng virus Hiệu giá virus TCID50/ml 008HN 3,16 × 105 049HY 1,26 × 106 012HY 6,67 × 105 010TB 3,16 × 106 122NĐ 1,44 × 105 052TH 6,67 × 105 012NA 1,96 × 106 042TP 1,44 × 105 072TG 6,67 × 105 10 082CT 3,16 × 105 4.2.2 Kết nghiên cứu ổn định số đặc tính sinh học chủng virus PRRS phân lập Việt Nam 4.2.2.1 Kết xác định khả gây bệnh tích tế bào theo thời gian chủng virus PRRS phân lập Việt Nam qua đời cấy chuyển Từ lô virus gốc (P0 - Pasage 0), cấy chuyển qua đời liên tiếp tế bào MARC-145 So sánh khả nhân lên đời P0 P5 cho thấy, trình xâm nhập, nhân lên hủy hoại tế bào cảm thụ chủng virus PRRS nghiên cứu tương đối giống đồng Virus bắt đầu hủy hoại tế bào thời điểm 48 sau gây nhiễm đạt mức độ phá hủy cao 72 sau gây nhiễm, sau 84 gây nhiễm tế bào cảm thụ bị phá hủy hồn tồn Tỉ lệ tế bào bị phá hủy thời điểm 48h, 72h 84h 10 chủng virus nghiên cứu khác không đáng kể (chệnh lệch 5%) 4.2.2.2 Kết xác định hiệu giá virus chủng virus PRRS phân lập Việt Nam qua đời cấy chuyển Các chủng virus PRRS lựa chọn nghiên cứu tiến hành xác định hiệu giá qua đời cấy chuyển Kết xác định hiệu giá virus trình bày bảng 4.8 15 Qua bảng kết thấy hiệu giá chủng virus nghiên cứu cao đạt từ 1,26 × 105TCID 50/ml đến 7,12 × 106TCID 50/ml tương đối ổn định đời cấy chuyển Cụ thể, hiệu giá cao chủng virus 010TB đạt 3,16 × 106 TCID 50/ml, hiệu giá thấp chủng 112NĐ đạt 1,44 × 105 TCID 50/ml Các chủng virus nghiên cứu có hiệu giá virus không thay đổi nhiều (không giảm Lg) qua đời cấy chuyển P1 P5, đặc tính quan trọng giống gốc để đảm bảo trình nhân giống sản xuất, hàm lượng virus giữ nguyên qua lô giống khác Trong 10 chủng virus nghiên cứu, chủng virus 010TB, 012NA, 049HY có hiệu giá 3,16 × 106; 1,96 × 106; 2,26 × 106 TCID 50/ml, chủng virus có hiệu giá cao so với chủng lại có tiềm làm giống gốc cho sản xuất vacxin Bảng 4.8 Hiệu giá chủng virus PRRS nghiên cứu qua đời cấy chuyển Hiệu giá (TCID50/ml) P0 P1 P2 P3 P4 P5 5 5 052TH 6,67 × 10 7,11 × 10 5,40 × 10 6,67 × 10 1,26 × 10 6,67 × 105 010TB 3,16 × 106 5,03 × 106 3,33 × 106 3,03× 106 4,0 × 106 7,12 × 106 082CT 3,16 × 105 3,03 × 105 3,33 × 105 2,25 × 105 3,16 × 105 3,16 × 105 012NA 1,96 × 106 1,26 × 106 2,25 × 106 3,16 × 106 3,33 × 106 3,03 × 106 049HY 1,26 × 106 3,16 × 106 1,26 × 106 3,0 × 106 3,33× 106 3,16 × 106 012HY 6,67 × 105 7,11 × 105 5,40 × 105 9,60 × 105 5,40 × 105 6,67 × 105 008HN 3,16 × 105 3,03 × 105 2,25 × 105 5,40 × 105 3,03× 105 6,67 × 105 122NĐ 1,44 × 105 1,26 × 105 3,03 × 105 2,25 × 105 5,40 × 105 1,44 × 105 072TG 6,67 × 105 5,40 × 105 7,11 × 105 9,60 × 105 6,67 × 105 3,16 × 105 042TP 1,44 × 105 2,25 × 105 1,36 × 105 1,26 × 105 3,03 × 105 3,16 × 105 4.2.2.3 Kết xác định quy luật nhân lên môi trường nuôi cấy chủng virus PRRS phân lập Việt Nam qua đời cấy chuyển Virus Trên sở kết nghiên cứu đặc tính sinh học qua đời cấy chuyển 10 chủng virus tuyển chọn, kết đồ thị sinh trưởng chủng virus 052TH, 010TB, 012NA, 049HY, 008HN đại diện kết xác định hiệu giá virus qua đời cấy chuyển, lựa chọn chủng virus đại diện để tiếp tục nghiên cứu ổn định tính di truyền tính đại diện di truyền cho chủng virus PRRS cường độc phân lập Việt Nam Đồng thời, gửi thẩm định chủng giống chủng virus Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc Thú y TW Kết lựa chọn chủng virus nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử trình bày bảng 4.9 Bảng 4.9 Kết lựa chọn chủng virus PRRS để nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử Kí hiệu chủng virus phân lập 010 TB 012NA 049HY Kí hiệu chủng virus đăng kí KTY-PRRS-01 KTY-PRRS-02 KTY-PRRS-03 Khả nhân lên môi trường tế bào Tốt, ổn định Tốt, ổn định Tốt, ổn định 16 Hiệu giá virus (TCID50/ml) 3,16 × 106 1,96 × 106 1,26 × 106 4.2.3 Kết nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử chủng virus PRRS 4.2.3.1 Kết giải trình tự gen ORF5 so sánh trình tự nucleotide, axit amin chủng virus PRRS nghiên cứu Sau phân tích, chúng tơi thu tồn trình tự nucleotide đoạn cần nghiên cứu, đoạn ORF5 có độ dài 603bp, đoạn ORF7 có độ dài 372bp So sánh trình tự nucleotide gen ORF5 chủng nghiên cứu so sánh với chủng virus PRRS tham chiếu ngân hàng gen thấy rằng, ba chủng virus có mức độ tương đồng nucleotide gen ORF5 từ 98,1% đến 99,0% So sánh với số chủng virus PRRS Trung Quốc công bố ngân hàng gen từ năm 2006 đến 2015 cho thấy tương đồng nucleotide đạt 97,8% đến 99,5% Kết so sánh thành phần axit amin gen ORF5 chủng virus nghiên cứu (bảng 4.18) cho thấy tương đồng axit amin chủng virus nghiên cứu đạt từ 96,4% đến 97,5% Trong KTY-PRRS-02 KTY-PRRS-03 tương đồng với cao 97,5% điều phù hợp với tương đồng nucleotide gen ORF5 chủng Hai chủng virus KTY-PRRS-01 KTY-PRRS-03 tương đồng thấp với đạt 96,4% So sánh thành phần axit amin gen ORF5 chủng nghiên cứu với số chủng virus PRRS Việt Nam công bố ngân hàng gen từ năm 2007 đến 2015 thấy tương đồng axit amin đạt từ 94,2% đến 98,4% So sánh với số chủng virus PRRS Trung Quốc công bố ngân hàng gen từ năm 2006 đến 2015 thấy tương đồng axit amin đạt từ 95,8% đến 99,5% 4.2.3.2 Kết giải trình tự gen ORF7 so sánh trình tự nucleotide, axit amin chủng virus PRRS nghiên cứu Kết so sánh trình tự nucleotide gen ORF7 chủng virus PRRS nghiên cứu thấy tỉ lệ tương đồng dao động từ 99,1% đến 99,6% Trong KTY-PRRS02 KTY-PRRS-03 tương đồng cao (99,6%) thấp KTY-PRRS-01 KTY-PRRS-02, KTY-PRRS-03 (99,1%) So sánh với chủng tham chiếu Việt Nam ngân hàng gen giới thấy mức độ tương đồng nucleotide gen ORF7 đạt 98,9% đến 99,7% So sánh với chủng tham chiếu Trung Quốc ngân hàng gen giới thấy mức độ tương đồng nucleotide gen ORF7 đạt 98,7% đến 100% Kết so sánh tương đồng axit amin cho thấy khơng có sai khác thành phần axit amin đoạn gen ORF7 chủng virus nghiên cứu, tương đồng axit amin gen ORF7 chủng virus nghiên cứu đạt 100% So sánh tương đồng axit amin gen ORF7 với số chủng tham chiếu Việt Nam Trung Quốc ngân hàng gen không thấy sai khác thành phần axit amin đoạn gen 4.2.3.3 Kết dựng phát sinh loài chủng virus PRRS nghiên cứu Dựa trình tự gen ORF5 ORF7, phát sinh loài tương ứng xây dựng cách độc lập Tất chủng virus PRRS nghiên cứu đặt phân tích sơ đồ phả hệ (cây phân nhánh) với chủng virus khác giới 17 để thấy mối quan hệ di truyền chủng với Kết dựng phát sinh lồi thể hình 4.1 4.3 93 45 JQ860367/Vietnam/2009/DN42 JQ860362/Vietnam/2008/DN444 KF735060 HPPRRS (Thailand 2010) 49 JQ860387/Vietnam/2012/DT7 10 KTY-PRRS-01 42 39 70 KF698647/Lao/2011/NA/LAO/L142 FJ895329/China/2009/SX2009 HQ832108/China/2008/AHXD 57 KM244763/Vietnam/2013/MN1 60 57 KC263035/China/2011/HD-11 FJ394029/Vietnam/2007/07QN 21 51 EF635006 HUN4 (China 2007) EU864233/China/2006/TP EF112445 JXA1 (China 2006) 53 20 KP998478/China/2015/FJZH KTY-PRRS-03 54 42 KT208323/China/2015/2015-GDHY KF699846/Vietnam/2013/HUA/HP1 40 KT208348/China/2014/gdsg-2014-gp5 75 JX144912/China/2012/YC1201 90 47 71 JQ955657/China/2013/GX1001 AB856283/Vietnam/2011/HUA-Viet.labPRRS1 97 86 LC105643/Vietnam/2015/BN10 62 HM214915/China/2010/GX09-32 KTY-PRRS-02 JQ860379/Vietnam/2010/HCM.CC3 DQ176019 MN184A (USA 2006) U66394 PRRS (USA 1997) 43 PRRSV ATCC VR-2332 (U87392 NA) 81 AF159149 MLV RespPRRS/Repro (USA 2000) 98 PRRSV BCL-PS 100 (GU187014 Singapore) 84 AF066183 Ingelvac PRRS MLV (USA 2005) DQ345725 VP-046 (Spain 2009) M96262 Lelystad virus (Netherlands 1991) 100 (Ghi chú: chủng virus nghiên cứu, chủng virus vacxin Trung Quốc, châu Âu) chủng Bắc Mỹ, Chủng Hình 4.1 Cây phả hệ dựa trình tự gen ORF5 54 57 KTY-PRRS-01 KP771770.China.2015 KM695199.Vietnam.2015 81 JQ663568.China.2012 42 57 KF735060.Thailand.2015 LC192549.Vietnam.2016 38 KTY-PRRS-02 KM659203.JXA1 58 70 KX815433.China.2017 45 GQ475526.China.2013 12 16 KU842720.Vietnam.2014 67 JN626287.China.2016 KTY-PRRS-03 DQ176021.VR2332 M96262.Lelystad (Ghi chú: chủng virus nghiên cứu, chủng virus vacxin Trung Quốc, chủng Bắc Mỹ, châu Âu) Chủng Hình 4.2 Cây phả hệ dựa trình tự gen ORF7 Cây phát sinh lồi hình 4.1 cho thấy, chủng virus PRRS nghiên cứu nằm nhóm phát sinh lớn khác nhau, KTY-PRRS-02 làm thành nhóm chủng lại KTY-PRRS-01 KTY-PRRS-03 làm thành nhóm Đồng thời chủng độc lực cao Trung Quốc (JXA1) nằm nhóm với chủng KTY-PRRS-01 KTYPRRS-03 Các chủng virus nghiên cứu thuộc nhánh chủng Bắc Mỹ (VR-2332), khơng có chủng virus nghiên cứu nằm nhánh phát sinh với chủng Châu Âu (Lelystad) Cây phát sinh lồi hình 4.2 cho thấy chủng virus nghiên cứu thuộc nhánh phát sinh chủng Bắc Mỹ (VR-2332) nhánh phát sinh với chủng độc lực cao Trung Quốc Như vậy, qua việc so sánh mức độ tương đồng nucleotide axit amin chủng virus PRRS phân lập, dựng phát sinh loài phản ánh mối quan hệ di truyền chủng virus PRRS nghiên cứu ta thấy 18 chủng virus PRRS phân lập Việt Nam có mối quan hệ gen gần gũi với gần với chủng PRRSV phân lập Trung Quốc 4.2.3.4 Kết xác định ổn định số đặc tính sinh học phân tử chủng chủng virus PRRS nghiên cứu qua đời cấy chuyển Ở đời cấy chuyển, hai đoạn gen ORF5 ORF7 giải trình tự Kết so sánh trình tự nucleotide đời cấy chuyển cho thấy, đời cấy chuyển liên tục, chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02, KTY-PRRS-03 sai khác hay biến đổi trình tự nucleotide đoạn ORF5 ORF7 4.2.4 Kết nghiên cứu đáp ứng miễn dịch động vật thí nghiệm với chủng virus PRRS nghiên cứu 4.2.4.1 Kết tinh chế kháng nguyên virus PRRS Từ chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02, KTY-PRRS-03 lựa chọn nhân lên môi trường tế bào MARC-145 với số lượng lớn, tiến hành tinh chế kháng nguyên Kết thu kháng nguyên tinh khiết chủng virus Bảng 4.10 Kết tinh chế kháng nguyên chủng virus PRRS nghiên cứu Kháng nguyên virus chế từ chủng virus KTY - PRRS - 01 KTY - PRRS - 02 KTY - PRRS - 03 Nồng độ KN lần (mg/ml) 1 0,5 Nồng độ KN lần (mg/ml) 0,5 0,5 Nồng độ KN lần (mg/ml) 1,2 0,5 Các kháng nguyên tinh chế có hàm lượng tương đối cao ổn định qua lần tinh chế khác Kháng nguyên sau tinh chế sử dụng cho nghiên cứu đáp ứng miễn dịch chuột lang kiểm tra miễn dịch chéo chủng virus PRRS 4.2.4.2 Kết gây tối miễn dịch cho chuột lang kháng nguyên PRRSV tinh chế Gây tối miễn dịch cho chuột lang kháng nguyên PRRS tinh chế Kết cho thấy chuột lang có kháng thể kháng virus PRRS, đạt tỷ lệ cao bảng 4.11 Bảng 4.11 Kết phản ứng IPMA kiểm tra kháng thể kháng PRRSV thời điểm 14 ngày sau tiêm kháng nguyên PRRS cho chuột Stt Động vật TN Lơ thí nghiệm Chuột lang Lơ CL1 (n=10) Lô CL2 (n=10) Lô CL3 (n=10) Kết kháng thể dương tính 10/10 10/10 10/10 Tỷ lệ (%) 100 100 100 Kết luận Đạt yêu cầu Đạt yêu cầu Đạt yêu cầu Các mẫu huyết có chứa kháng thể kháng PRRSV tất lơ thí nghiệm bảo quản -200C để dùng cho việc đánh giá tương đồng kháng nguyên 19 4.2.4.3 Kết nghiên cứu tương đồng kháng nguyên chủng virus PRRS phân lập Việt Nam Sau kiểm tra hàm lượng kháng thể, sử dụng phản ứng trung hòa để đánh giá tương đồng kháng nguyên chủng virus PRRS nghiên cứu Kết trình bày bảng 4.12 Bảng 4.12 Phản ứng trung hòa xác định tương đồng kháng nguyên chủng virus PRRS nghiên cứu KN virus KTY - PRRS - 01 KTY- PRRS - 02 KTY – PRRS - 03 KTY - PRRS - 01 +++ +++ ++ KTY - PRRS - 02 ++ +++ + KTY - PRRS - 03 ++ ++ +++ Kháng thể Nghiên cứu tương đồng kháng nguyên chủng virus PRRS rằng, virus KTY-PRRS-01 chủng có triển vọng cho nghiên cứu sản xuất vacxin vơ hoạt PRRS kháng thể tạo từ chủng virus có khả trung hòa virus rộng rãi chủng nghiên cứu 4.2.5 Sản xuất giống gốc 4.2.5.1 Kết kiểm tra tiêu vô trùng giống gốc Giống gốc PRRS mẫu nuôi cấy mơi trường dinh dưỡng thích hợp, theo dõi 14 ngày không thấy vi sinh vật phát triển Cụ thể, môi trường thạch thường, nước thịt gan yếm khí, thạch máu: sau ngày theo dõi khơng có khuẩn lạc mọc Trong mơi trường nước thịt, qua ngày theo dõi không đục Trên môi trường thạch nấm, qua 14 ngày theo dõi khơng có nấm mọc Như vậy, giống gốc PRRS đảm bảo tiêu vô trùng sử dụng để nhân giống sản xuất phục vụ sản xuất vacxin vô hoạt PRRS 4.2.5.2 Kết kiểm tra tiêu khiết giống gốc Kiểm tra phương pháp PCR/RT-PCR cho thấy, chủng giống gốc có diện virus PRRS, khơng có mặt virus ngoại lai khác, chứng tỏ giống gốc không bị tạp nhiễm Như vậy, giống gốc PRRS đạt yêu cầu độ vô trùng, khiết, bước đầu phép sử dụng để nhân giống sản xuất phục vụ sản xuất vacxin vô hoạt PRRS 4.3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM VACXIN VÔ HOẠT NHŨ DẦU PHÒNG PRRS 4.3.1 Kết nhân giống sản xuất (Working seed) vacxin 4.3.1.1 Kết nhân giống sản xuất virus vacxin môi trường tế bào Từ lô giống gốc, lấy ống giống gốc để nhân giống sản xuất Kết nhân giống sản xuất vacxin PRRS lơ, lơ lít Huyễn dịch virus lấy mẫu kiểm tra vô trùng chuẩn độ hiệu giá virus Khi tiêu kiểm tra đạt yêu 20 cầu, mẻ huyễn dịch virus đồng lên thành lô huyễn dịch để phục vụ cho mục đích sản xuất thử nghiệm vacxin vơ hoạt PRRS 4.3.1.2 Kiểm tra vô trùng khiết giống sản xuất Tiến hành tương tự kiểm tra tiêu vô trùng với giống gốc, cấy giống sản xuất môi trường kiểm tra, theo dõi ngày (riêng môi trường nấm theo dõi 14 ngày) Kết cho thấy, lô giống sản xuất hồn tồn khơng bị nhiễm loại vi khuẩn hiếu khí, yếm khí nấm Như lơ giống sản xuất PRRS đạt tiêu vô trùng khiết Giống sản xuất sau kiểm tra vô trùng, khiết phần sử dụng để sản xuất vacxin, phần bảo quản để sử dụng cho nghiên cứu ổn định giống sau thời gian bảo quản điều kiện bảo quản khác 4.3.2 Kết nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vacxin vơ hoạt PRRS 4.3.2.1 Nghiên cứu q trình cô đặc virus kháng nguyên máy lọc tiếp tuyến Từ lít giống sản xuất, chúng tơi tiến hành cô đặc virus máy lọc tiếp tuyến Hỗn hợp virus cô đặc sau lọc, thu 1,5 lít virus vacxin Bảng 4.13 Hiệu giá virus sau cô đặc phương pháp lọc tiếp tuyến Virus vacxin Trước cô đặc Sau cô đặc Đánh giá Hiệu giá virus (TCID50/ml) 3,03 × 106 4,0 × 107 Đạt yêu cầu Kết xác định hiệu giá virus vacxin sau cô đặc cho thấy, hàm lượng virus tăng lg so với trước cô đặc TCID50 đạt 4,0 × 107/ml, đạt yêu cầu cho sản xuất vacxin vơ hoạt PRRS 4.3.2.2 Nghiên cứu q trình vơ hoạt virus vacxin Tiến hành thí nghiệm xác định nồng độ formalin sử dụng để vô hoạt vacxin ở, nồng độ thử nghiệm 0,04%, 0,03%, 0,02% thời gian ủ vô hoạt 24 Kết trình bày bảng 4.14 Bảng 4.14 Kết xác định nồng độ formalin sử dụng vô hoạt virus vacxinPRRS Nồng độ formalin 0,04 % 0,03% 0,02% Kết vô hoạt Không đạt Đạt Không đạt Qua bảng kết xác định nồng độ formalin thích hợp cho vơ hoạt chúng tơi thấy nồng độ 0,03% thích hợp cho vô hoạt virus PRRS Tiến hành vô hoạt tồn lơ vacxin nồng độ formalin trên, sau sản phẩm gây nhiễm mơi trường tế bào MARC-145 để kiểm tra kết trình vô hoạt virus Kết thu hỗn hợp sau vơ hoạt formalin, virus bị vơ hoạt hồn toàn 4.3.2.3 Kết nghiên cứu lựa chọn chất bổ trợ cho sản xuất vacxin vô hoạt PRRS Lựa chọn chất bổ trợ dầu khoáng, keo phèn alhydrogel Kết kiểm tra kháng thể kháng PRRSV sau tiêm vacxin với chất bổ trợ khác trình bày bảng 4.15 21 Bảng 4.15 Kết kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng PRRSV lợn sau tiêm vacxin sử dụng chất bổ trợ khác Lơ Thí nghiệm DK1 DK2 DK3 DK4 DK5 DKtb KP1 KP2 KP3 KP4 KP5 KPtb AG1 AG2 AG3 AG4 AG5 AGtb ĐC1 ĐC2 ĐC3 ĐCtb ngày 0,02 0,03 0,01 0,03 0,01 0,02 0,02 0,04 0,05 0,03 0,04 0,04 0,02 0,03 0,03 0,02 0,03 0,03 0,01 0,03 0,02 0,02 ngày 0,11 0,23 0,27 0,21 0,20 0,20 0,08 0,10 0,07 0,08 0,06 0,08 0,07 0,05 0,08 0,06 0,07 0,07 0,02 0,03 0,02 0,03 Giá trị S/P 14 ngày 21 ngày 28 ngày 0,72 0,96 1,14 0,84 1,37 1,41 1,16 1,51 1,62 0,93 1,27 1,38 0,92 1,29 1,38 0,91 1,28 1,39 0,47 0,74 0,79 0,48 0,82 0,84 0,45 0,85 0,87 0,47 0,81 0,85 0,46 0,80 0,81 0,47 0,80 0,83 0,38 0,43 0,44 0,35 0,40 0,42 0,33 0,45 0,46 0,36 0,45 0,45 0,32 0,41 0,43 0,35 0,43 0,44 0,02 0,03 0,03 0,02 0,04 0,03 0,01 0,02 0,03 0,02 0,03 0,03 Ghi : S/P ≥ 0,4 dương tính 35 ngày 1,38 1,52 1,68 1,47 1,61 1,53 0,84 0,92 0,93 0,92 0,87 0,90 0,46 0,43 0,47 0,46 0,45 0,45 0,02 0,04 0,02 0,03 42 ngày 1,51 1,62 1,71 1,54 1,68 1,61 0,92 0,94 0,95 0,96 0,94 0,94 0,45 0,45 0,47 0,47 0,46 0,46 0,04 0,04 0,03 0,04 S/P < 0,4 âm tính DK: Dầu khoáng ; KP: Keo phèn; AG: Alhydrogel ; tb: Trung bình Kết nghiên cứu sử dụng chất bổ trợ khác cho thấy, lô đối chứng khơng có kháng thể kháng virus PRRS với giá trị S/P < 0,4, điều chứng tỏ q trình thử nghiệm, khơng có xâm nhập lưu hành virus PRRS tự nhiên đàn lợn thí nghiệm Trong đó, hàm lượng kháng thể lơ sử dụng chất bổ trợ dầu khống lô sử dụng chất bổ trợ keo phèn đạt dương tính sau 14 ngày tiêm Riêng lơ thí nghiệm sử dụng chất bổ trợ Alhydrogel, đáp ứng miễn dịch chậm so với lơ thí nghiệm trên, cụ thể đến ngày 21 sau tiêm vacxin có kháng thể dương tính Khi sử dụng dầu khoáng làm chất bổ trợ cho hàm lượng kháng thể cao so với lô sử dụng chất bổ trợ keo phèn alhydrogel Chúng nhận thấy, sử dụng chất bổ trợ dầu khoáng hay keo phèn có tính an tồn cao giúp lợn sản sinh kháng thể đặc hiệu với virus PRRS Tuy vậy, chất bổ trợ dầu khoáng cho đáp ứng miễn dịch cao Vì vậy, định lựa chọn chất bổ trợ dầu khoáng để sản xuất vacxin vơ hoạt PRRS Tiến hành nhũ hóa vacxin với dầu khống theo tỉ lệ 1: Sau lô vacxin kiểm tra cảm quan tiêu như: độ nhớt, tách 22 nước, phân lớp, chuyển màu phương pháp ly tâm để kiểm tra tính ổn định dùng phương pháp đo tốc độ chảy vacxin để kiểm tra độ nhớt Đồng thời, theo dõi tính ổn định nhũ dầu thời gian bảo quản cho thấy, vacxin khơng có tượng chuyển màu, không tách pha nước, không phân lớp Kết nhũ hóa vacxin kiểm tra sau nhũ hóa trình bày bảng 4.16 Bảng 4.16 Kết kiểm tra cảm quan lơ nhũ hố Lơ vacxin Tính ổn định Chuyển màu Tách pha nước Phân lớp L1 +++ - - - L2 +++ - - - L3 +++ - - - Chú thích : +++ : Tốt ; ++ : Bình thường ; + Kém ; - Không quan sát thấy Qua bảng 4.16, chúng tơi nhận thấy tiêu tính ổn định, chuyển màu, tách pha nước, phân lớp đạt yêu cầu tất lơ vacxin nhũ hố Như vậy, q trình nhũ hóa vacxin đạt u cầu 4.3.3 Kết nghiên cứu kiểm nghiệm vacxin vô hoạt PRRS 4.3.3.1 Kết kiểm tra vô trùng khiết vacxin vô hoạt PRRS Kiểm tra tiêu vô trùng vacxin vô hoạt PRRS Kết kiểm tra vô trùng áp dụng theo TCVN 8684:2011 Đến ngày thứ 14, tất môi trường thử nghiệm suốt, mầu sắc môi trường không đổi, chứng tỏ lô vacxin mà sản xuất đạt tiêu chuẩn vô trùng Kiểm tra tiêu khiết vacxin vô hoạt PRRS Kết kiểm tra virus ngoại lai cho kết âm tính phương pháp PCR RT-PCR Như thành phần môi trường lô vacxin vô hoạt PRRS không bị tạp nhiễm thành phần khác từ môi trường bên vi khuẩn, nấm mốc, Mycoplasma virus ngoại lai Do đó, lơ vacxin mà chúng tơi sản xuất đạt tiêu chuẩn vô trùng, khiết 4.3.3.2 Kết kiểm tra tiêu an toàn vacxin vơ hoạt PRRS Kết kiểm tra an tồn thấy rằng, liều tiêm gấp lần vacxin vô hoạt PRRS, lợn thí nghiệm sống khoẻ mạnh, ăn uống bình thường, khơng có phản ứng cục bộ, khơng sốt Như vậy, vacxin vô hoạt PRRS đạt tiêu an toàn 4.3.3.3 Kết kiểm tra tiêu hiệu lực vacxin vô hoạt PRRS Vacxin vô hoạt PRRS kiểm nghiệm tiêu hiệu lực theo TCVN868513:2014 phương pháp trọng tài Qua kết bảng 4.17, lợn thí nghiệm lơ vacxin khơng có biểu bệnh lý, lợn khoẻ mạnh, ăn uống bình thường, chứng tỏ kháng thể kháng PRRSV có máu lợn thí nghiệm tiêm vacxin vơ hoạt PRRS đủ khả bảo hộ cho đàn lợn Ngược lại lô đối chứng tất lợn ốm nặng (với biểu lâm sàng: bỏ ăn, sốt cao, ỉa chảy…) lợn bị chết, mổ khám thấy có biến đổi bệnh tích đặc trưng PRRS 23 Bảng 4.17 Kết đánh giá công cường độc Stt Lô Nhóm TN Đ/C Lơ TN Đ/C TN Lơ Đ/C Triệu chứng lâm sàng Lợn ăn uống bình thường, có biểu mệt mỏi trở lại bình thường sau 24h Lợn sốt cao, chảy nước mũi, ho, sưng mí mắt Lợn sau cơng cường độc 12h có phản xạ chậm chạp, sốt nhẹ (39,5oC), 24h sau hoạt động bình thường Lợn sốt cao, bỏ ăn, vận động, ho Lợn sốt nhẹ (39oC), ăn uống bình thường Lợn bỏ ăn, sốt cao (40 - 41,5oC), mệt mỏi, vận động, da mẩn đỏ vùng da mỏng, khó thở (một chết có biểu lâm sàng đặc trưng PRRS) PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN 1) Đề tài xác định 33 ca bệnh dương tính với PRRSV 57 ca bệnh thu thập Bệnh tích đại thể lợn mắc PRRS bao gồm biến đổi chủ yếu phổi, hạch lympho với tượng viêm, xuất huyết Bệnh tích vi thể phổi, hạch phổi rõ ràng, 100% tiêu đọc thấy xuất huyết, thâm nhiễm tế bào viêm, phế nang chứa đầy dịch rỉ viêm 2) Phân lập 33 chủng PRRSV từ mẫu bệnh phẩm tuyển chọn 03 chủng virus PRRS KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02, KTY-PRRS-03 Khảo sát đặc tính sinh học chủng virus cho thấy: Các chủng virus thích ứng mơi trường tế bào MARC-145, ổn định đặc tính sinh học sinh học phân tử sau đời cấy chuyển Trong chủng virus tuyển chọn, chủng KTY-PRRS-01 đạt tiêu chí tốt nhất, dùng làm giống gốc để nghiên cứu sản xuất vacxin vô hoạt 3) Sản xuất lô giống gốc PRRSV với số lượng lít, sau chia nhỏ vào ampoul đông khô để bảo quản, tiến hành kiểm tra tiêu vô trùng, khiết, đạt yêu cầu tiêu chuẩn giống gốc dùng để sản xuất vacxin 4) Sản xuất thử nghiệm lô vacxin PRRS vô hoạt nhũ dầu từ chủng giống gốc Đã nghiên cứu quy trình kiểm nghiệm vacxin sử dụng quy trình để kiểm nghiệm lơ vacxin sản xuất thử nghiệm, cho thấy vacxin an tồn, vơ trùng có hiệu lực tốt 5.2 KIẾN NGHỊ Nghiên cứu thêm độ dài miễn dịch vacxin vô hoạt PRRS để làm sở lựa chọn thời điểm tái chủng thích hợp Thu thập chủng virus PRRS lưu hành việt Nam qua nhiều năm so sánh với chủng gốc để đánh giá biến động di truyền virus PRRS làm sở đánh giá hiệu lực vacxin 24 DANH MỤC CƠNG TRÌNH Đà CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Hữu Nam, Bùi Trần Anh Đào, Trần Quốc Tuấn Phạm Văn Sơn (2014) Nghiên cứu khả gây bệnh thực nghiệm lợn virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp (PRRS) chủng BN-10 phân lập Việt Nam Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y Tập XXI Số 5:5-13 Phạm Văn Sơn, Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Bá Hiên Nguyễn Hữu Nam (2015) Nghiên cứu lựa chọn chất bổ trợ để sản xuất vacxin vơ hoạt phòng hội chứng rối loạn sinh sản hơ hấp lợn Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y Tập XXII Số 7:5-12 Phạm Văn Sơn, Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Văn Cảm Nguyễn Bá Hiên (2017) Nghiên cứu ổn định số đặc tính sinh học sinh học phân tử chủng virus KTY-PRRS-01 phân lập Việt Nam Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam Tập 15 Số 2: 188-197 ... Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm thành công vacxin vô hoạt PRRS từ chủng virus thực địa, vacxin vô hoạt PRRS Việt Nam nghiên cứu sản xuất Quy trình sản xuất vacxin vơ hoạt PRRS chuyển giao để sản. .. virus phân lập Việt Nam 1.2.2 Mục tiêu cụ thể Tuyển chọn chủng virus PRRS phân lập từ lợn mắc PRRS Việt Nam, sử dụng làm giống gốc phục vụ sản xuất thử nghiệm vacxin vô hoạt PRRS Sản xuất thử nghiệm. .. nhân giống sản xuất (Working seed) vacxin 4.3.1.1 Kết nhân giống sản xuất virus vacxin môi trường tế bào Từ lô giống gốc, lấy ống giống gốc để nhân giống sản xuất Kết nhân giống sản xuất vacxin