Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu nhằm xây dựng quy trình khuếch đại toàn bộ 15 exon của gen APC bằng phản ứng PCR và giải trình tự gen APC. DNA được tách chiết từ máu ngoại vi của 15 người khỏe mạnh. Các exon của gen được khuếch đại bằng 29 cặp mồi, sản phẩm PCR sau đó được giải trình tự bằng máy tự động. Kết quả được phân tích bằng phần mềm chuyên dụng.
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 4 * 2014 XÂY DỰNG QUY TRÌNH KHUẾCH ĐẠI VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN APC Đồn Nam Khánh*, Nguyễn Ngọc Minh**, Lê Minh Khơi**, Nguyễn Trung Tín**, Đỗ Thị Thanh Thủy**, Lê Thị Hương Lan***, Nguyễn Thị Băng Sương** TĨM TẮT Giới thiệu: Gen APC (adenomatous polyposis coli gene) là một gen ức chế khối u gồm 15 exon nằm tại vị trí 5q21‐q22, sản phẩm dịch mã của gen là protein APC dài 2843 acid amin. Protein APC với vai trò chính là cơ lập các hiệu ứng kích thích tăng trưởng của Beta‐catenin nhằm thúc đẩy sự chết theo chương trình của tế bào. Người mang gen APC bị đột biến sẽ dẫn đến một số bệnh liên quan như bệnh đa polyp đại trực tràng, bệnh ung thư hệ tiêu hóa, các tuyến, các cơ quan (não, gan, tuyến thượng thận, tuyến tụy, tuyến giáp,…) và một số bệnh bẩm sinh khác. Mục tiêu: Xây dựng quy trình khuếch đại tồn bộ 15 exon của gen APC bằng phản ứng PCR và giải trình tự gen APC. Đối tượng và phương pháp: DNA được tách chiết từ máu ngoại vi của 15 người khỏe mạnh. Các exon của gen được khuếch đại bằng 29 cặp mồi, sản phẩm PCR sau đó được giải trình tự bằng máy tự động. Kết quả được phân tích bằng phần mềm chun dụng. Kết quả: Xây dựng thành cơng quy trình PCR khuếch đại 15 exon của gen APC với nhiệt độ bắt cặp tối ưu là 59 C, độ nhạy của quy trình là 1 ng/ μL. Sản phẩm giải trình tự cho kết quả tương đồng với trình tự gen APC chuẩn trên NCBI. o Kết luận: Xây dựng thành cơng quy trình khuếch đại và giải trình tự tồn bộ gen APC. Từ khóa: gen APC, khuếch đại gen, quy trình giải trình tự. ABSTRACT ESTABLISH PROTOCOL FOR AMPLIFICATION AND SEQUENCING APC GENE Doan Nam Khanh, Nguyen Ngoc Minh, Le Minh Khoi, Nguyen Trung Tin, Do Thi Thanh Thuy, Le Thi Huong Lan, Nguyen Thi Bang Suong * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ No 4 ‐ 2014: 100 ‐ 106 Introduction: APC (adenomatous polyposis coli) is a tumor suppressor gene. It contains 15 exons locating at 5q21‐q22. The 2843 amino‐acid APC protein plays an important role in regulating the Beta‐catein growth signal factor and leads cells to normal apoptosis. Mutations in APC gene cause colorectal polyposis diseases, cancer diseases in digestive system, in Endocrine System (pancreas, thyroid, adrenal gland) and cancer in other organs (brain, liver,…). Aim: Establish protocol to amplify all 15 exons of APC gene by PCR method, then identify all sequences of APC gene. Objects and Methods: DNA was extracted from peripheral blood of 15 healthy people. 15 exons of APC gene were ampliflied by 29 pairs of primer, then sequenced by ABI system. Results were analysed by specialist software. Results: PCR method for amplifying 15 exons of APC gene was optimized with annealing temperature at 59 C and protocol has sensitivity of 1 ng /μL. Sequencing products are identical to standard sequence database of APC gene from NCBI genbank. o * Khoa Sinh học, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh, ** Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh, *** Khoa Hóa sinh, Bệnh viện Đa bp 598 bp 594 bp 597 bp 586 bp 519 bp 582 bp 598 bp 600 bp 586 bp 579 bp 551 bp 585 bp 598 bp Kết quả chuẩn hóa phản ứng PCR Nhiệt độ bắt cặp mồi Nhiệt độ bắt cặp mồi được khảo sát nằm trong khoảng 55oC ‐ 61oC. Khảo sát nhằm xác định nhiệt độ tối ưu cho mồi bắt cặp đặc hiệu lên DNA mạch khuôn. Các mức nhiệt độ cách nhau 2oC để đảm bảo ý nghĩa của các nghiệm thức khảo sát. Khảo sát được tiến hành lặp lại 3 lần ở tất cả các cặp mồi. Do kết quả khảo sát ở tất cả các cặp mồi đều khá tương đồng nên chúng tôi chỉ đưa ra kết quả của cặp mồi khuếch đại exon 15‐A trong khảo sát. Cả 4 mức nhiệt độ gắn mồi khảo sát đều cho vạch điện di có kích thước đúng với kích 103 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 4 * 2014 Nghiên cứu Y học thước được khuếch đại của cặp mồi exon 15‐A và phản ứng PCR khơng có sản phẩm phụ cho thấy các mồi đạt độ đặc hiệu cao ở cả bốn nhiệt độ (Hình 1). 55oC;(2) Sản phẩm PCR ở nhiệt độ bắt cặp 57oC;(3) Sản phẩm PCR ở nhiệt độ bắt cặp 59 oC;(4) Sản phẩm PCR ở nhiệt độ bắt cặp 61 oC;(‐) Chứng âm. Độ nhạy của quy trình Độ nhạy của quy trình được xác định với nồng độ DNA giảm dần từ 50ng/μl đến 0,1 ng/μl. Phản ứng PCR thực hiện ở nhiệt độ 59oC. Tất cả các thí nghiệm đều được lặp lại ba lần. Theo kết quả điện di, bắt đầu từ nồng độ DNA khuôn 5 ng/μL trở xuống, sản phẩm PCR cho vạch điện di mờ dần. Ở nồng độ DNA 0,5 ng/μL và 0,1 ng/μL khơng thấy vạch điện di của sản phẩm PCR. Kết quả cho thấy quy trình có độ nhạy đạt 1 ng/μl. Hình 1: Kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp của mồi exon 15‐A ở các mức nhiệt độ khác nhau. (T) Thang chuẩn 1kb plus;(1) Sản phẩm PCR ở nhiệt độ bắt cặp A B Hình 2: Kết quả khảo sát độ nhạy của quy trình PCR khuếch đại gen exon 15‐A ở các nồng độ DNA khác nhau. Hình A: (1) 0,1 ng/μL; (2) 0,5 ng/μL; (3) 1 ng/μL; (4) 2 ng/μL; (5) 3 ng/μL. Hình B: (1) 1 ng/μL; (2) 2 ng/μL; (3) 3 ng/μL; (4) 4 ng/μL; (5) 5 ng/μL; (6) 10 ng/μL; (7) 15 ng/μL; (8) 20 ng/μL; (9) 30 ng/μL; (10) 40 ng/μL; (11) 50 ng/μL. (T) Thang chuẩn; (‐) Chứng âm. ng/ μL. Nhiệt độ bắt cặp dùng cho phản ứng Kết quả chạy điện di sản phẩm bằng phản ứng oC. PCR là 59 PCR đã chuẩn hóa. Tiến hành khuếch đại tồn bộ các exon bằng phản ứng PCR với nồng độ DNA sử dụng là 50 104 A Phương pháp PCR đã được chuẩn hóa và cho kết quả khuếch đại tốt, sản phẩm PCR khi điện di đậm, sáng rõ, đúng kích thước và khơng có sản phẩm phụ. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 4 * 2014 (T) (-) (1) (2) (3) (4) (5) Nghiên cứu Y học (6) (7) (8) (9) Hình 3: Sản phẩm khuếch đại của exon 1 đến 9 với quy trình PCR đã chuẩn hóa. Thí nghiệm được lập lại 3 lần. (T) Thang; (‐) Chứng âm; (1)‐(9) Sản phẩm khuếch đại exon 1 đến 9. em dưới 5 tuổi cũng là một hệ quả nguy hiểm ở Kết quả giải trình tự gen APC ở người bình các bệnh nhân có đột biến gen APC với tỷ lệ mắc thường khỏe mạnh. bệnh khoảng 1,5 %(2). Hầu hết các đột biến là đột biến nhỏ xảy ra trên 1 exon, nằm rải rác ở tất cả 15 exon của gen. Các đột biến này thường tạo bộ ba kết thúc (stop codon), làm q trình dịch mã kết thúc sớm và tổng hợp nên protein bị cắt cụt, làm mất chức năng ức chế sự tăng sinh tế bào của protein APC. Nghiên cứu của Powell và cộng sự năm 1992 cho thấy đột biến gen APC gây ra 63% các ca ung thư tuyến(6). Vì vậy, đề tài thật sự có ý nghĩa trong việc chẩn đốn sớm các Hình 4: Kết quả giải trình tự exon 15‐F gen APC của đột biến dòng mầm ở gen, giúp người mang đột mẫu 01 bằng cả hai mồi xi (F) và mồi ngược (R), biến có thể chủ động thăm khám định kì và điều tìm thấy SNP (rs42427) tại c.5034. trị tích cực các bệnh liên quan ở giai đoạn đầu. Các exon được giải trình tự bằng cả mồi xi Trong nghiên cứu này, chúng tơi đã thiết kế và mồi ngược. Kết quả giải trình tự được phân 29 cặp mồi đặc hiệu, do exon 15 có kích thước tích bằng phần mềm CLC Main Workbench 5. 6574 bp lớn hơn rất nhiều so với các exon còn lại (có chiều dài 78‐379 bp), chúng tơi đã quyết định Nhận xét: Tất cả 15 người bình thường tham dùng 15 cặp mồi khuếch đại exon 15 thành 15 gia nghiên cứu đều tìm thấy các SNP đã được amplicon có kích thước từ 500 đến 600 bp nhằm cơng bố và khơng làm thay đổi acid amin. đồng bộ hóa q trình giải trình tự. Các mồi BÀN LUẬN được thiết kế bằng phần mềm LightScanner Protein APC điều hòa q trình phosphoryl Primer Design, kiểm tra bằng phần mềm hóa và ubiquitin hóa beta‐catenin(7), qua đó điều SNPCheck3, OligoAnalyzer 3.1 và cơng cụ hòa q trình phân chia, biệt hóa và sự chết theo Primer‐BLAST của NCBI. Kết quả kiểm tra các chương trình của tế bào. Đột biến dòng mầm thơng số: tỷ lệ GC (% GC), các số liệu về nhiệt độ trong gene sẽ làm mất chức năng protein APC, biến tính mồi (Tm), chiều dài mồi, các giá trị ΔG dẫn đến sự phân chia khơng kiểm sốt của các tế của các cấu trúc thứ đều đạt u cầu(4). Đa số các bào, tình trạng dễ tiến triển thành các dạng ung mồi khơng có SNP hoặc có SNP ở vị trí khơng thư đường tiêu hóa(2). Đặc biệt, ung thư gan ở trẻ ảnh hưởng đến khả năng bắt cặp của mồi lên 105 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 4 * 2014 Nghiên cứu Y học mạch khn. Kết quả Primer‐BLAST trên NCBI cho thấy các mồi có tính đặc hiệu cao. Kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp đều cho vạch điện di đặc hiệu, có kích thước khuếch đại đúng và khơng có sản phẩm phụ. Nhiệt độ càng cao, tính đặc hiệu của phản ứng PCR càng cao. Tuy nhiên, do các mồi được thiết kế có nhiệt độ nóng chảy trung bình khoảng 60‐61oC, vì vậy chúng tôi không lựa chọn nhiệt độ gắn mồi ở 61oC nhằm hạn chế khả năng mồi bị nóng chảy và làm giảm hiệu suất phản ứng PCR. Do đó, chúng tơi lựa chọn nhiệt độ gắn mồi 59 oC cho quy trình chuẩn nhằm đạt hiệu suất PCR cao nhất và hạn chế các sản phẩm phụ. Quy trình sau khi chuẩn hóa cho sản phẩm PCR có độ đặc hiệu cao, đúng kích thước và khơng có sản phẩm phụ. Độ nhạy quy trình cao (nồng độ DNA thấp nhất là 1 ng/μL), cũng như với nồng độ DNA khuôn trên 10 ng/μL sẽ cho kết quả khuếch đại ổn định, vạch điện di đậm màu và dễ kết luận. Kết quả giải trình tự được so sánh với trình tự gen APC chuẩn trên NCBI bằng phần mềm CLC Main Workbench 5 để kiểm tra sự tương đồng, qua đó phản ánh độ đặc hiệu của mồi thiết kế và điều kiện phản ứng PCR đã được tối ưu hóa. Kết quả giải trình tự 15 mẫu DNA đều xuất hiện các SNP đã được xác định và công bố trên thế giới. Các SNP phần lớn nằm trên exon 15 và không làm thay đổi acid amin trong chuỗi protein. Sau khi xây dựng thành cơng quy trình khuếch đại và giải trình tự tồn bộ gen APC, mục tiêu của các nghiên cứu tiếp theo cần hướng đến là ứng dụng quy trình trên nhằm xác định 106 các đột biến gen APC trên bệnh nhân ung thư đường tiêu hóa và gia đình người bệnh nhằm sớm phát hiện gen bệnh, cũng như đưa ra các chiến lược điều trị, tư vấn cần thiết cho người mang gen bệnh. KẾT LUẬN Nghiên cứu đã thiết kế thành cơng bộ mồi, chuẩn hóa và xây dựng thành cơng quy trình giải trình tự gen APC. Kết quả của nghiên cứu có tính ứng dụng cao nhằm xác định đột biến gen APC và xây dựng bản đồ gen đột biến ở cộng đồng người Việt Nam. TÀI LIỆU THAM KHẢO Benchabane H, Ahmed Y (2009). The adenomatous polyposis coli tumor suppressor and Wnt signaling in the regulation of apoptosis. Adv Exp Med Biol. 656:75‐84. Half E, Bercovich D and Rozen P (2009). Familial adenomatous polyposis. Orphanet J Rare Dis, 4: 22. Leppert M, Dobbs M, Scambler P, O’Connell P, NakamuraY, Stauffer D, Woodward S, Burt R, Hughes J, Gardner E (1987). The gene for familial polyposis coli maps to the long arm of chromosome 5. Science, 238(4832):1411‐3. OligoArchitectTM Online Glossary of Parameters. Plawski A, Slomski R (2009). APC gene mutations causing familial adenomatous polyposis in Polish patients. J Appl Genet, 49(4): 407–414. Powell SM, Zilz N, Beazer‐Barclay Y, Bryan TM, Hamilton SR, Thibodeau SN, Vogelstein B, Kinzler KW (1992). APC mutations occur early during colorectal tumorigenesis. Nature 359: 235‐237. Yang J, Zhang W, Evans PM, Chen X, He X, Liu C (2006). Adenomatous polyposis coli (APC) differentially regulates beta‐catenin phosphorylation and ubiquitination in colon cancer cells. J. Biol. Chem. 281: 17751‐17757. Ngày nhận bài báo: 03/08/2014 Ngày phản biện đánh giá bài báo: 10/08/2014 Ngày bài báo được đăng: 30/08/2014 ... lớn nằm trên exon 15 và không làm thay đổi acid amin trong chuỗi protein. Sau khi xây dựng thành cơng quy trình khuếch đại và giải trình tự tồn bộ gen APC, mục tiêu của các nghiên cứu tiếp theo cần hướng ... thiết cho người mang gen bệnh. KẾT LUẬN Nghiên cứu đã thiết kế thành cơng bộ mồi, chuẩn hóa và xây dựng thành cơng quy trình giải trình tự gen APC. Kết quả của nghiên cứu có ... (T) Thang; (‐) Chứng âm; (1)‐(9) Sản phẩm khuếch đại exon 1 đến 9. em dưới 5 tuổi cũng là một hệ quả nguy hiểm ở Kết quả giải trình tự gen APC ở người bình các bệnh nhân có đột biến gen APC với tỷ lệ mắc