1. Trang chủ
  2. » Thể loại khác

Xây dựng quy trình khuếch đại và giải trình tự gen APC

7 81 0

Đang tải... (xem toàn văn)

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Định dạng
Số trang 7
Dung lượng 725,12 KB

Nội dung

Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu nhằm xây dựng quy trình khuếch đại toàn bộ 15 exon của gen APC bằng phản ứng PCR và giải trình tự gen APC. DNA được tách chiết từ máu ngoại vi của 15 người khỏe mạnh. Các exon của gen được khuếch đại bằng 29 cặp mồi, sản phẩm PCR sau đó được giải trình tự bằng máy tự động. Kết quả được phân tích bằng phần mềm chuyên dụng.

Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 4 * 2014 XÂY DỰNG QUY TRÌNH KHUẾCH ĐẠI VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN APC  Đồn Nam Khánh*, Nguyễn Ngọc Minh**, Lê Minh Khơi**, Nguyễn Trung Tín**, Đỗ Thị Thanh Thủy**,  Lê Thị Hương Lan***, Nguyễn Thị Băng Sương**  TĨM TẮT  Giới thiệu: Gen APC (adenomatous polyposis coli gene) là một gen ức chế khối u gồm 15 exon nằm tại vị  trí 5q21‐q22, sản phẩm dịch mã của gen là protein APC dài 2843 acid amin. Protein APC với vai trò chính là cơ  lập các hiệu ứng kích thích tăng trưởng của Beta‐catenin nhằm thúc đẩy sự chết theo chương trình của tế bào.  Người mang gen APC bị đột biến sẽ dẫn đến một số bệnh liên quan như bệnh đa polyp đại trực tràng, bệnh ung  thư hệ tiêu hóa, các tuyến, các cơ quan (não, gan, tuyến thượng thận, tuyến tụy, tuyến giáp,…) và một số bệnh  bẩm sinh khác.  Mục tiêu: Xây dựng quy trình khuếch đại tồn bộ 15 exon của gen APC bằng phản ứng PCR và giải trình  tự gen APC.   Đối tượng và phương pháp: DNA được tách chiết từ máu ngoại vi của 15 người khỏe mạnh. Các exon của  gen được khuếch đại bằng 29 cặp mồi, sản phẩm PCR sau đó được giải trình tự bằng máy tự động. Kết quả  được phân tích bằng phần mềm chun dụng.   Kết quả: Xây dựng thành cơng quy trình PCR khuếch đại 15 exon của gen APC với nhiệt độ bắt cặp tối ưu  là 59 C, độ nhạy của quy trình là 1 ng/ μL. Sản phẩm giải trình tự cho kết quả tương đồng với trình tự gen APC  chuẩn trên NCBI.  o Kết luận: Xây dựng thành cơng quy trình khuếch đại và giải trình tự tồn bộ gen APC.   Từ khóa: gen APC, khuếch đại gen, quy trình giải trình tự.  ABSTRACT  ESTABLISH PROTOCOL FOR AMPLIFICATION AND SEQUENCING APC GENE  Doan Nam Khanh, Nguyen Ngoc Minh, Le Minh Khoi, Nguyen Trung Tin, Do Thi Thanh Thuy,   Le Thi Huong Lan, Nguyen Thi Bang Suong * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ No 4 ‐ 2014: 100 ‐ 106  Introduction: APC (adenomatous polyposis coli) is a tumor suppressor gene. It contains 15 exons locating  at  5q21‐q22.  The  2843  amino‐acid  APC  protein  plays  an  important  role  in  regulating  the  Beta‐catein  growth  signal  factor  and  leads  cells  to  normal  apoptosis.  Mutations  in  APC  gene  cause  colorectal  polyposis  diseases,  cancer diseases in digestive system, in Endocrine System (pancreas, thyroid, adrenal gland) and cancer in other  organs (brain, liver,…).  Aim: Establish protocol to amplify all 15 exons of APC gene by PCR method, then identify all sequences of  APC gene.  Objects and Methods: DNA was extracted from peripheral blood of 15 healthy people. 15 exons of APC  gene were ampliflied by 29 pairs of primer, then sequenced by ABI system. Results were analysed by specialist  software.   Results: PCR method for amplifying 15 exons of APC gene was optimized with annealing temperature at  59 C and protocol has sensitivity of 1 ng /μL. Sequencing products are identical to standard sequence database of  APC gene from NCBI genbank.   o * Khoa Sinh học, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh,   ** Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh,  *** Khoa Hóa sinh, Bệnh viện Đa bp 598 bp 594 bp 597 bp 586 bp 519 bp 582 bp 598 bp 600 bp 586 bp 579 bp 551 bp 585 bp 598 bp Kết quả chuẩn hóa phản ứng PCR  Nhiệt độ bắt cặp mồi  Nhiệt  độ  bắt  cặp  mồi  được  khảo  sát  nằm  trong  khoảng  55oC  ‐  61oC.  Khảo  sát  nhằm  xác  định nhiệt độ tối ưu cho mồi bắt cặp đặc hiệu lên  DNA mạch khuôn. Các mức nhiệt độ cách nhau  2oC  để  đảm  bảo  ý  nghĩa  của  các  nghiệm  thức  khảo sát. Khảo sát được tiến hành lặp lại 3 lần ở  tất cả các cặp mồi. Do kết quả khảo sát ở tất cả  các cặp mồi đều khá tương đồng nên chúng tôi  chỉ đưa ra kết quả của cặp mồi khuếch đại exon  15‐A trong khảo sát.   Cả  4  mức  nhiệt  độ  gắn  mồi  khảo  sát  đều  cho  vạch  điện  di  có  kích  thước  đúng  với  kích  103 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 4 * 2014 Nghiên cứu Y học  thước được khuếch đại của cặp mồi exon 15‐A  và phản ứng PCR khơng có sản phẩm phụ cho  thấy các mồi đạt độ đặc hiệu cao ở cả bốn nhiệt  độ (Hình 1).   55oC;(2) Sản phẩm PCR ở nhiệt độ bắt cặp 57oC;(3)  Sản phẩm PCR ở nhiệt độ bắt cặp 59 oC;(4) Sản phẩm  PCR ở nhiệt độ bắt cặp 61 oC;(‐) Chứng âm.  Độ nhạy của quy trình  Độ  nhạy  của  quy  trình  được  xác  định  với  nồng  độ  DNA  giảm  dần  từ  50ng/μl  đến  0,1  ng/μl. Phản ứng PCR thực hiện ở nhiệt độ 59oC.  Tất cả các thí nghiệm đều được lặp lại ba lần.  Theo  kết  quả  điện  di,  bắt  đầu  từ  nồng  độ  DNA khuôn 5 ng/μL trở xuống, sản phẩm PCR  cho  vạch  điện  di  mờ  dần.  Ở  nồng  độ  DNA  0,5  ng/μL và 0,1 ng/μL khơng thấy vạch điện di của  sản phẩm PCR. Kết quả cho thấy quy trình có độ  nhạy đạt 1 ng/μl.      Hình 1: Kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp của mồi  exon 15‐A ở các mức nhiệt độ khác nhau. (T) Thang  chuẩn 1kb plus;(1) Sản phẩm PCR ở nhiệt độ bắt cặp  A B   Hình 2: Kết quả khảo sát độ nhạy của quy trình PCR khuếch đại gen exon 15‐A ở các nồng độ DNA khác nhau.  Hình A: (1) 0,1 ng/μL; (2) 0,5 ng/μL; (3) 1 ng/μL; (4) 2 ng/μL; (5) 3 ng/μL. Hình B: (1) 1 ng/μL; (2) 2 ng/μL;  (3) 3 ng/μL; (4) 4 ng/μL; (5) 5 ng/μL; (6) 10 ng/μL; (7) 15 ng/μL; (8) 20 ng/μL; (9) 30 ng/μL; (10) 40 ng/μL;  (11) 50 ng/μL. (T) Thang chuẩn; (‐) Chứng âm.  ng/  μL.  Nhiệt  độ  bắt  cặp  dùng  cho  phản  ứng  Kết quả chạy điện di sản phẩm bằng phản ứng  oC.   PCR là 59 PCR đã chuẩn hóa.  Tiến hành khuếch đại tồn bộ các exon bằng  phản ứng PCR với nồng độ DNA sử dụng là 50  104 A Phương  pháp  PCR  đã  được  chuẩn  hóa  và  cho  kết  quả  khuếch  đại  tốt,  sản  phẩm  PCR  khi  điện di đậm, sáng rõ, đúng kích thước và khơng  có sản phẩm phụ.  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 4 * 2014 (T) (-) (1) (2) (3) (4) (5) Nghiên cứu Y học (6) (7) (8) (9)   Hình 3: Sản phẩm khuếch đại của exon 1 đến 9 với quy trình PCR đã chuẩn hóa. Thí nghiệm được lập lại 3 lần.  (T) Thang; (‐) Chứng âm; (1)‐(9) Sản phẩm khuếch đại exon 1 đến 9.  em dưới 5 tuổi cũng là một hệ quả nguy hiểm ở  Kết  quả  giải  trình  tự  gen  APC  ở  người  bình  các bệnh nhân có đột biến gen APC với tỷ lệ mắc  thường khỏe mạnh.  bệnh khoảng 1,5 %(2). Hầu hết các đột biến là đột  biến nhỏ xảy ra trên 1 exon, nằm rải rác ở tất cả  15 exon của gen. Các đột biến này thường tạo bộ  ba kết thúc (stop codon), làm q trình dịch mã  kết thúc sớm và tổng hợp nên protein bị cắt cụt,  làm  mất  chức  năng  ức  chế  sự  tăng  sinh  tế  bào  của  protein  APC.  Nghiên  cứu  của  Powell  và  cộng  sự  năm  1992  cho  thấy  đột  biến  gen  APC  gây ra 63% các ca ung thư tuyến(6). Vì vậy, đề tài    thật sự có ý nghĩa trong việc chẩn đốn sớm các  Hình 4: Kết quả giải trình tự exon 15‐F gen APC của  đột biến dòng mầm ở gen, giúp người mang đột  mẫu 01 bằng cả hai mồi xi (F) và mồi ngược (R),  biến có thể chủ động thăm khám định kì và điều  tìm thấy SNP (rs42427) tại c.5034.  trị tích cực các bệnh liên quan ở giai đoạn đầu.  Các exon được giải trình tự bằng cả mồi xi  Trong nghiên cứu này, chúng tơi đã thiết kế  và  mồi ngược.  Kết  quả giải trình  tự  được  phân  29  cặp  mồi  đặc  hiệu,  do  exon  15  có  kích  thước  tích bằng phần mềm CLC Main Workbench 5.  6574 bp lớn hơn rất nhiều so với các exon còn lại  (có chiều dài 78‐379 bp), chúng tơi đã quyết định  Nhận xét: Tất cả 15 người bình thường tham  dùng  15  cặp  mồi  khuếch  đại  exon  15  thành  15  gia  nghiên  cứu  đều  tìm  thấy  các  SNP  đã  được  amplicon có kích thước từ 500 đến 600 bp nhằm  cơng bố và khơng làm thay đổi acid amin.  đồng  bộ  hóa  q  trình  giải  trình  tự.  Các  mồi  BÀN LUẬN  được  thiết  kế  bằng  phần  mềm  LightScanner  Protein APC điều hòa q trình phosphoryl  Primer  Design,  kiểm  tra  bằng  phần  mềm  hóa và ubiquitin hóa beta‐catenin(7), qua đó điều  SNPCheck3,  OligoAnalyzer  3.1  và  cơng  cụ  hòa q trình phân chia, biệt hóa và sự chết theo  Primer‐BLAST  của  NCBI.  Kết  quả  kiểm  tra  các  chương  trình  của  tế  bào.  Đột  biến  dòng  mầm  thơng số: tỷ lệ GC (% GC), các số liệu về nhiệt độ  trong  gene sẽ  làm  mất  chức  năng  protein  APC,  biến tính mồi (Tm), chiều dài mồi, các giá trị ΔG  dẫn đến sự phân chia khơng kiểm sốt của các tế  của các cấu trúc thứ đều đạt u cầu(4). Đa số các  bào, tình trạng dễ tiến triển thành các dạng ung  mồi  khơng  có  SNP  hoặc  có  SNP  ở  vị  trí  khơng  thư đường tiêu hóa(2). Đặc biệt, ung thư gan ở trẻ  ảnh  hưởng  đến  khả  năng  bắt  cặp  của  mồi  lên  105 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 4 * 2014 Nghiên cứu Y học  mạch khn. Kết quả Primer‐BLAST trên NCBI  cho thấy các mồi có tính đặc hiệu cao.   Kết  quả  khảo sát nhiệt độ  bắt  cặp  đều  cho  vạch điện  di  đặc  hiệu,  có  kích  thước  khuếch  đại  đúng  và  khơng có sản phẩm phụ. Nhiệt độ càng cao, tính  đặc hiệu của phản ứng PCR càng cao. Tuy nhiên,  do các mồi được thiết kế có nhiệt độ nóng chảy  trung  bình  khoảng  60‐61oC,  vì  vậy  chúng  tôi  không  lựa  chọn  nhiệt  độ  gắn  mồi  ở  61oC  nhằm  hạn chế khả năng mồi bị nóng chảy và làm giảm  hiệu  suất  phản  ứng  PCR.  Do  đó,  chúng  tơi  lựa  chọn nhiệt độ gắn mồi 59 oC cho quy trình chuẩn  nhằm đạt hiệu suất PCR cao nhất và hạn chế các  sản phẩm phụ. Quy trình sau khi chuẩn hóa cho  sản  phẩm  PCR  có  độ  đặc  hiệu  cao,  đúng  kích  thước và khơng có sản phẩm phụ. Độ nhạy quy  trình cao (nồng độ DNA thấp nhất là 1 ng/μL),  cũng  như  với  nồng  độ  DNA  khuôn  trên  10  ng/μL sẽ cho kết quả khuếch đại ổn định, vạch  điện di đậm màu và dễ kết luận.  Kết quả giải trình tự được so sánh với trình  tự gen APC chuẩn trên NCBI bằng phần mềm  CLC Main Workbench 5 để kiểm tra sự tương  đồng,  qua  đó  phản  ánh  độ  đặc  hiệu  của  mồi  thiết  kế  và  điều  kiện  phản  ứng  PCR  đã  được  tối ưu hóa. Kết quả giải trình tự 15 mẫu DNA  đều  xuất  hiện  các  SNP  đã  được  xác  định  và  công  bố  trên  thế  giới.  Các  SNP  phần  lớn  nằm  trên exon 15 và không làm thay đổi acid amin  trong chuỗi protein.   Sau  khi  xây  dựng  thành  cơng  quy  trình  khuếch  đại  và  giải  trình  tự  tồn  bộ  gen  APC,  mục tiêu của các nghiên cứu tiếp theo cần hướng  đến  là  ứng dụng  quy  trình  trên  nhằm  xác  định    106 các  đột  biến  gen  APC  trên  bệnh  nhân  ung  thư  đường  tiêu  hóa  và  gia  đình  người  bệnh  nhằm  sớm  phát  hiện  gen  bệnh,  cũng  như  đưa  ra  các  chiến  lược  điều  trị,  tư  vấn  cần  thiết  cho  người  mang gen bệnh.    KẾT LUẬN  Nghiên  cứu  đã  thiết  kế  thành  cơng  bộ  mồi,  chuẩn  hóa  và  xây  dựng  thành  cơng  quy  trình  giải trình tự gen APC. Kết quả của nghiên cứu có  tính ứng dụng cao nhằm xác định đột biến gen  APC  và  xây  dựng  bản  đồ  gen  đột  biến  ở  cộng  đồng người Việt Nam.  TÀI LIỆU THAM KHẢO  Benchabane H, Ahmed Y (2009). The adenomatous polyposis  coli tumor suppressor and Wnt signaling in the regulation of  apoptosis. Adv Exp Med Biol. 656:75‐84.     Half  E,  Bercovich  D  and  Rozen  P  (2009).  Familial  adenomatous polyposis. Orphanet J Rare Dis, 4: 22.   Leppert M, Dobbs M, Scambler P, O’Connell P, NakamuraY,  Stauffer D, Woodward S, Burt R, Hughes J, Gardner E (1987).  The gene for familial polyposis coli maps to the long arm of  chromosome 5. Science, 238(4832):1411‐3.  OligoArchitectTM Online Glossary of Parameters.    Plawski  A,  Slomski  R  (2009).  APC  gene  mutations  causing  familial  adenomatous  polyposis  in  Polish  patients.  J  Appl  Genet, 49(4): 407–414.   Powell SM, Zilz N, Beazer‐Barclay Y, Bryan TM, Hamilton SR,  Thibodeau  SN,  Vogelstein  B,  Kinzler  KW  (1992).  APC  mutations occur early during colorectal tumorigenesis. Nature  359: 235‐237.  Yang  J,  Zhang  W,  Evans  PM,  Chen  X,  He  X,  Liu  C  (2006). Adenomatous  polyposis  coli  (APC)  differentially  regulates beta‐catenin phosphorylation and ubiquitination in  colon cancer cells. J. Biol. Chem. 281: 17751‐17757.      Ngày nhận bài báo:       03/08/2014  Ngày phản biện đánh giá bài báo:   10/08/2014  Ngày bài báo được đăng:       30/08/2014  ... lớn  nằm  trên exon 15 và không làm thay đổi acid amin  trong chuỗi protein.   Sau  khi  xây dựng thành  cơng  quy trình khuếch đại và giải trình tự tồn  bộ  gen APC,   mục tiêu của các nghiên cứu tiếp theo cần hướng ... thiết  cho  người  mang gen bệnh.    KẾT LUẬN  Nghiên  cứu  đã  thiết  kế  thành  cơng  bộ  mồi,  chuẩn  hóa  và xây dựng thành  cơng  quy trình giải trình tự gen APC.  Kết quả của nghiên cứu có ... (T) Thang; (‐) Chứng âm; (1)‐(9) Sản phẩm khuếch đại exon 1 đến 9.  em dưới 5 tuổi cũng là một hệ quả nguy hiểm ở  Kết  quả  giải trình tự gen APC ở  người  bình  các bệnh nhân có đột biến gen APC với tỷ lệ mắc 

Ngày đăng: 23/01/2020, 07:32

TÀI LIỆU CÙNG NGƯỜI DÙNG

TÀI LIỆU LIÊN QUAN