Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm probiotic đa chủng tại viện vi sinh vật và công nghệ sinh học đại học quốc gia hà nội

LỜI CAM ĐOAN Tôi- TUẤN HOÀNG VIỆT xin cam đoan nội dung luận văn với đề tài: “Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm probiotic đa chủng viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học- Đại học Quốc gia Hà Nội” công trình nghiên cứu sáng tạo thực dƣới hƣớng dẫn PGS.TS DƢƠNG VĂN HƠP Số liệu, kết trình bày luận văn hoàn toàn trung thực chƣa công bố công trình khoa học khác i LỜI CẢM ƠN Tôi Tuấn Hoàng Việt xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới PGS.TS DƢƠNG VĂN HỢP –Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học–Đại học Quốc gia Hà Nội hƣớng dẫn bảo tận tình suốt trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Tôi xin cảm ơn thầy cô thuộc Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm- Đại học Bách Khoa Hà Nội- dạy tận tình suốt trình theo học Bên cạnh ngƣời thân bạn bè động lực, nguồn động viên đặc biệt gia đình giúp đỡ nhiều suốt trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Chân thành! TUẤN HOÀNG VIỆT ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỞ ĐẦU Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 Vi sinh vật probiotic 1.1.1 Lịch sử probiotic .3 1.1.2 Định nghĩa probiotic 1.1.3 Lựa chọn chủng probiotic 1.1.4 Các chủng vi sinh vật dùng phổ biến probiotic .5 1.1.5 Công thức chế phẩm probiotic 1.2 Vai trò chế hoạt động probiotic .6 1.2.1 Vai trò probiotic 1.2.2 Cơ chế tác động 1.3 Các phƣơng pháp lên men vi sinh vật 1.3.1 Phân loại dựa vào tính chất canh trƣờng 1.3.1.1 Lên men chìm 1.3.1.2 Lên men bề mặt 10 1.3.1.3 Lên men xốp 11 1.3.2 Phân loại dựa vào cách nạp liệu thu hồi bán thành phẩm 12 1.3.2.1 Lên men theo mẻ 12 1.3.2.2 Lên men bán liên tục 12 1.3.2.3 Lên men liên tục 13 1.4 Môi trƣờng thông số lên men vi sinh vật chủ yếu 13 1.4.1 Môi trƣờng lên men vi sinh vật .13 1.4.2 Các thông số lên men vi sinh vật chủ yếu 15 1.5 Chất mang phát triển sinh khối vi sinh vật dạng bột 16 1.5.1 Chất mang .16 1.5.1.1 Polysaccarit 16 1.5.1.2 Đƣờng dẫn xuất đƣờng 17 1.5.1.3 Sữa gầy 18 1.5.2 Chất bổ trợ 18 1.5.2.1 Glutamat natri 18 1.5.2.2 Các chất chống oxy hóa 18 1.5.2.3 Sữa đậu nành len men 19 1.5.2.4 Glyxerol 19 1.6 Tình hình nghiên cứu sử dụng probiotic giới Việt nam 19 1.6.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất sử dụng chế phẩm probiotic giới 19 1.6.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất sử dụng chế phẩm probiotic Việt nam 20 1.7 Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học đại học Quốc Gia Hà Nội .21 iii Chƣơng 2: VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 1.1 Nguồn vi sinh vật 23 1.2 Hóa chất trang thiết bị sử dụng 23 1.2.1 Hóa chất 23 1.2.2 Máy móc dụng cụ 24 1.3 Môi trƣờng nghiên cứu 24 1.3.1 Môi trƣờng MRS (g/l): 24 1.3.2 Môi trƣờng LB (g/l): .25 2.1 Lựa chọn số thông số lên men chủ yếu 26 2.1.1 Kiểm tra pH thích hợp cho sinh trƣởng .26 2.1.2 Kiểm tra nhiệt độ thích hợp cho sinh trƣởng .26 2.1.3 Lựa chọn tỷ lệ chủng giống 26 2.1.4 Lựa chọn tốc độ khuấy thích hợp 27 2.1.5 Lựa chọn tốc độ sục khí thích hợp 27 2.1.6 Lựa chọn thời gian lên men 27 2.2 Xây dựng đƣờng chuẩn OD mật độ 27 2.3 Nghiên cứu xây dựng thông số nuôi cấy nồi lên men 75l 28 2.4 Lên men bán liên tục với chủng Bacillus subtilis 30 2.5 Nghiên cứu thiết lập chất mang thích hợp cho chủng vi sinh vật 31 2.5.1 Xây dựng công thức chất mang cho chủng Bacillus subtilis 31 2.5.1 Xây dựng công thức chất mang cho chủng Lactobacillus acidophilus 32 2.6 Nghiên cứu điều kiện bảo quản sản phẩm tối ƣu 33 2.7 Nghiên cứu công thức phối trộn sản phẩm đa chủng 33 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Lựa chọn vài thông số lên men .34 3.1.1 Chủng Bacillus subtilis 34 3.1.1.1 Dải pH thích hợp cho sinh trƣởng 34 3.1.1.2 Dải nhiệt độ thích hợp cho sinh trƣởng 35 3.1.1.3 Thời gian lên men thích hợp 36 3.1.1.4 Tốc độ khuấy thích hợp cho chủng Bacillus subtilis 36 3.1.1.5 Tốc độ sục khí 37 3.1.1.6 Tỷ lệ chủng giống 37 3.1.2 Chủng Lactobacillus acidopilus .38 3.1.2.1 Dải pH thích hợp cho sinh trƣởng chủng L.acidophilus 38 3.1.2.2 Dải nhiệt độ thích hợp cho chủng Lactobacillus acidophilus 39 3.1.2.3 Thời gian lên men thích hợp chủng Lactobacillus acidophilus 39 3.1.2.4 Tốc độ khuấy thích hợp cho chủng Lactobacillus acidophilus 40 3.1.2.5 Tỷ lệ chủng giống 40 3.2 Xây dựng thông số nuôi cấy nồi lên men 75 lít 41 3.2.1 Thông số nuôi cấy nồi lên men 75 lít chủng Bacillus subtilis 41 3.2.2 Lên men bán liên tục với chủng Bacillus subtilis 42 3.2.3 Thông số nuôi cấy nồi lên men 75 lít chủng Lactobacillus acidophilus 43 iv 3.3 Lựa chọn công thức chất mang thích hợp cho chủng vi sinh vật .44 3.3.1 Công thức chất mang cho chủng Bacillus subtilis 44 3.3.1.1 Công thức 44 3.3.1.2 Công thức 45 3.3.1.3 Công thức đối chứng 46 3.3.1.4 Công thức đối chứng 47 3.3.1.5 Công thức đối chứng 48 3.3.1.5 Sản phẩm Việt Nam 49 3.3.2 Công thức chất mang cho chủng Lactobacillus acidophilus 50 3.3.2.1 Công thức 51 3.3.2.2 Công thức 52 3.3.2.3 Công thức đối chứng 54 3.3.2.4 Công thức đối chứng 55 3.3.2.5 Công thức đối chứng 56 3.3.2.6 Sản phẩm Đan Mạch 57 3.3.2.7 Sản phẩm Việt Nam 58 3.3.2.8 So sánh tính ổn định sản phẩm luận văn sản phẩm thƣơng mại lƣu hành thị trƣờng 59 3.4 Nghiên cứu điều kiện bảo quản sản phẩm tối ƣu 60 3.5 Công thức phối trộn sản phẩm đa chủng 63 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .65 TÀI LIỆU THAM KHẢO .67 PHỤ LỤC 70 v DANH MỤC HÌNH VẼ Hình Minh hoạ chế tác động probiotic .8 Hình 2: Quy trình nuôi cấy nồi lên men 75 lít 28 Hình 3: Các bƣớc pha loãng dung dịch huyền phù vi sinh vật .30 Hình 4: Sơ đồ mô tả phƣơng pháp lên men bán liên tục (Fed-batch cultivation) (A) liên tục (Continuous cultivation) (B) 31 Hình 5: Thời gian lên men chủng Bacillus subtilis .36 Hình 6: Kết thử nghiệm tốc độ khuấy cho chủng Bacillus subtilis .36 Hình : Kết thử nghiệm tốc độ sục khí chủng Bacillus subtilis 37 Hình 8: Tỷ lệ chủng giốngcho chủng Bacillus subtilis .37 Hình 9: Thời gian lên men chủng Lactobacillus acidophilus 40 Hình 10: Kết thử nghiệm tốc độ khuấy cho chủng Lactobacillus acidophilus .40 Hình 11: Tỷ lệ chủng giốngcho chủng Lactobacillus acidophilus 41 Hình 12: Kết lên men chủng Bacillus subtilis nồi lên men 75 lít 42 Hình 13: Thử nghiệm lên men bán liên tục .43 Hình 14: Đƣờng cong sinh trƣởng chủng Lactobacillus acidophilus nồi lên men 75 lít 43 Hình 15: Kết kiểm tra mật độ chủng B.subtilis công thức 45 Hình 16: Kết kiểm tra mật độ chủng B.subtilis công thức 46 Hình 17: Kết kiểm tra mật độ chủng B.subtilis công thức ĐC 47 Hình 18: Kết kiểm tra mật độ chủng B.subtilis công thức ĐC 48 Hình 19: Kết kiểm tra mật độ chủng B.subtilis công thức ĐC 48 Hình 20: Kết kiểm tra mật độ Bacillus subtilis sản phẩm VN so với sản phẩm luận văn 50 Hình 21 Kết kiểm tra mật độ chủng L acidophilus công thức lần 51 Hình 22: Kết kiểm tra mật độ L acidophilus công thức lần 52 Hình 23: Kết kiểm tra mật độ Lactobacillus acidophilus công thức lần 53 Hình 24: Kết kiểm tra mật độ Lactobacillus acidophilus công thức lần .53 Hình 25: Kết kiểm tra mật độ Lactobacillus acidophilus .54 vi công thức đối chứng lần 54 Hình 26: Kết kiểm tra mật độ Lactobacillus acidophilus công thức 55 đối chứng lần 55 Hình 27: Kết kiểm tra mật độ Lactobacillus acidophilus .56 công thức đối chứng 56 Hình 28: Kết kiểm tra mật độ Lactobacillus acidophilus .56 công thức đối chứng 56 Hình 29: Kết kiểm tra mật độ Lactobacillus acidophilus sản phẩm Đan Mạch 57 Hình 30: Kết kiểm tra mật độ Lactobacillus acidophilus sản phẩm Việt Nam .59 Hình 31: So sánh tính ổn định sản phẩm luận văn sản phẩm 60 thƣơng mại 60 Hình 32: So sánh tính ổn định sản phẩm công thức chất mang tƣơng ứng điều kiện ngăn đá tủ lạnh ( -20 °C) 61 Hình 33: So sánh tính ổn định sản phẩm công thức chất mang tƣơng ứng điều kiện ngăn mát tủ lạnh ( - ° C) 62 Hình 34: So sánh tính ổn định sản phẩm công thức chất mang tƣơng ứng điều kiện nhiệt độ phòng 63 vii DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1: Tóm tắt chế tác động chủ yếu chủng probiotic lên vật chủ Bảng 2: Tóm tắt số thông tin vài sản phẩm probiotic có mặt thị trƣờng 21 Bảng 3: Hóa chất sử dụng .23 Bảng 4: Trang thiết bị dụng cụ .24 Bảng 5: Môi trƣờng nhân chủng, nuôi cấy cấy đếm (môi trƣờng MRS) 25 Bảng 6: Môi trƣờng nhân chủng, nuôi cấy cấy đếm (môi trƣờng LB) 25 Bảng 7: Các công thức chất cho chủng Bacillus subtilis 32 Bảng 8: Các công thức chất cho chủng Lactobacillus acidophilus 33 Bảng 9: Kết thử nghiệm nuôi Bacillus subtilis bình tam giác 34 Bảng 10: Kết thử nghiệm nuôi Bacillus subtilis nhiệt độ khác 35 Bảng 11: Kết thử nghiệm nuôi Lactobacillus acidophilus bình 38 tam giác pH môi trƣờng khác 38 Bảng 12: Kết thử nghiệm nuôi Lactobacillus acidophilus nhiệt độ 39 Bảng 13: Kết kiểm tra mật độ Bacillus subtilis công thức 44 Bảng 14: Kết kiểm tra mật độ Bacillus subtilis công thức 45 Bảng 15: Kết kiểm tra mật độ Bacillus subtilis công thức ĐC .46 Bảng 16: Kết kiểm tra mật độ Bacillus subtilis công thức ĐC .47 Bảng 17: Kết kiểm tra mật độ Bacillus subtilis công thức ĐC .48 Bảng 18: Kết kiểm tra mật độ Bacillus subtilis sản phẩm VN .49 Bảng 19: Kết kiểm tra mật độ Lactobacillus acidophilus công thức 51 Bảng20: Kết kiểm tra mật độ Lactobacillus acidophilus công thức 52 Bảng 21: Kết kiểm tra mật độ L acidophilus công thức đối chứng 54 Bảng 22: Kết kiểm tra mật độ L acidophilus công thức đối chứng 55 Bảng 23: Kết kiểm tra mật độ L.acidophilus công thức đối chứng 56 Bảng 24: Kết kiểm tra mật độ Lactobacillus acidophilus sản phẩm Đan Mạch 57 Bảng 25: Kết kiểm tra mật độ Lactobacillus acidophilus sản phẩm Việt viii Nam .58 Bảng 26: Kết kiểm tra mật độ L.acidophilus sản phẩm luận văn sản phẩm thƣơng mại .59 Bảng 27: So sánh tính ổn định sản phẩm công thức chất mang tƣơng ứng điều kiện ngăn đá tủ lạnh ( -20 ° C) 60 Bảng 28: So sánh tính ổn định sản phẩm công thức chất mang tƣơng ứng điều kiện ngăn mát tủ lạnh ( - ° C) 61 Bảng 29: So sánh tính ổn định sản phẩm công thức chất mang tƣơng ứng điều kiện nhiệt độ phòng 62 Bảng 30: Bảng tổng hợp kết kiểm nghiệm đa chủng 64 ix MỞ ĐẦU Trong dinh dƣỡng động vật, việc tăng cƣờng sức khỏe hệ thống tiêu hóa vật nuôi thông qua tác động tới hệ vi sinh sinh đƣờng ruột đƣợc coi giải pháp hữu hiệu Hệ vi sinh vật đƣờng ruột vật nuôi phong phú chủng loại số lƣợng, điều nguyên nhân chủ yếu dẫn đến rối loạn chuyển hóa hấp thu Bởi vậy, viêc sử dụng biện pháp kỹ thuật thông qua thức ăn nuôi dƣỡng nhằm tạo nên cân tối ƣu loài vi sinh vật đƣờng ruột theo hƣớng có lợi cho vật chủ hƣớng nghiên cứu đƣợc nhà nghiên cứu nƣớc quan tâm Có nhiều biện pháp để cải thiện quan hệ cân nhóm vi khuẩn có lợi có hại đƣờng tiêu hóa gia súc, gia cầm Biện pháp cổ điển đƣợc ứng dụng rộng rãi từ năm 1950 kỷ trƣớc sử dụng kháng sinh liều thấp Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh thức ăn chăn nuoi ngày bị hạn chế( kể từ ngày 01 tháng 01 năm 2006, nƣớc thuộc EU cấm hoàn toàn việc sử dụng kháng sinh thức ăn chăn nuôi- Hector Cervanter, 2006), nên nhu cầu tìm giải pháp thay kháng sinh ngày trở nên cấp bách Một giải pháp hữu hiệu probiotic Probiotic- theo Fuller (1992) [21]- chất bổ sung vi sinh vật sống hữu ích thức ăn nhằm cải thiện cân hệ vi sinh vật đƣờng ruột theo hƣớng có lợi cho vật chủ Nhu cầu sinh khối vi sinh vật probiotic nƣớc không dùng sản xuất thức ăn chăn nuôi lợn, gà, nuôi trồng thủy hải sản mà đƣợc dùng sản xuất thực phẩm chức dƣới dạng men tiêu hóa Cho dù chƣa có số thống kê xác giá trị thực tế nhƣng ƣớc tính giá trị 1% thức ăn chăn nuôi số đến hàng chục triệu USD Thực tế phần lớn sản phẩm probiotic đƣợc nhập từ nƣớc khu vực ( Thái Lan, Hàn Quốc, Trung Quốc, Ấn độ) nƣớc phát triển nhƣ Mỹ, Anh, Pháp, Bỉ Các nghiên cứu nƣớc đƣợc thực trƣờng Viện thông qua đề tài khoa học đƣa đƣợc kết lựa chọn chủng giống vi sinh vật, xây dựng quy trình lên men thí nghiệm bƣớc đầu thử nghiệm đánh giá hiệu sử Phần trăm mật độ (%) 120 100 80 Công thức Công thức 60 Công thức 40 20 0 10 17 19 23 Thời gian (tuần) Hình 32: So sánh tính ổn định sản phẩm công thức chất mang tương ứng điều kiện ngăn đá tủ lạnh ( -20 °C) Dựa vào kết ta thấy điều kiện bảo quản khoảng -20ºC mật độ tế bào vi khuẩn đƣợc trì tƣơng đối ổn định công thức chất mang Đặc biệt công thức 2, điều kiện -20ºC mật độ tế bào vi khuẩn đƣợc trì ổn định nhất, công thức mật độ tế bào vi khuẩn có giảm nhƣng không đáng kể Bảng 28: So sánh tính ổn định sản phẩm công thức chất mang tƣơng ứng điều kiện ngăn mát tủ lạnh ( - ° C) Đơn vị: Mật độ ( x 108 CFU/g) Thời gian Công thức Công thức Công thức 596 1340 300 184 1070 77 130 974 40 55 974 38 10 20.5 836 17 24 769 1.5 19 24 490 0.5 23 18 303 0.01 61 Phần trăm mật độ (%) 120 100 80 Công thức Công thức 60 Công thưc 40 20 0 10 17 19 23 Thời gian (tuần) Hình 33: So sánh tính ổn định sản phẩm công thức chất mang tương ứng điều kiện ngăn mát tủ lạnh ( - ° C) Nhƣ vậy, điều kiện 4-8ºC mật độ tế bào vi khuẩn có giảm nhƣng giảm nhanh điều kiện -20ºC chậm so với điều kiện nhiệt độ phòng Công thức công thức có mật độ tế bào vi khuẩn đƣợc trì ổn định so với công thức lại điều kiện bảo quản Bảng 29: So sánh tính ổn định sản phẩm công thức chất mang tƣơng ứng điều kiện nhiệt độ phòng Đơn vị: Mật độ ( x 108 CFU/g) Thời gian Công thức Công thức Công thức ( tuần) lần lần lần 596 1340 300 20 682 18 583 1.5 3.6 200 10 201 0.03 17 0.02 112 0.005 19 0.0164 23 0.009 25 0.006 0.005 27 0.006 62 Phần trăm mật độ (%) 120 100 80 Công thức Công thức 60 Công thưc 40 20 0 10 17 19 23 Thời gian (tuần) Hình 34: So sánh tính ổn định sản phẩm công thức chất mang tương ứng điều kiện nhiệt độ phòng Nhìn vào hình ta thấy điều kiện bảo quản nhiệt độ phòng mật độ tế bào vi khuẩn giảm mạnh thời gian bảo quản, đặc biệt giảm nhanh công thức số 1, công thức mật độ tế bào có giảm nhƣng giảm chậm 3.5 Công thức phối trộn sản phẩm đa chủng Các đơn chủng với mật độ cao (1011 cfu/g) đƣợc phối trộn với nhau, đồng thời bổ sung thêm chất ( đƣờng glucose khan, đƣờng lactose…) nhằm đƣa mật độ sản phẩm đa chủng tới mật độ yêu cầu ( thông thƣờng từ 109 tới 1010 cfu/g) Hệ số an toàn đƣợc sử dụng khị phối trộn 1:0.7 nhằm đảm bảo mật độ lý thuyết mật độ thực tế kiểm tra Sản phẩm đa chủng cuối đƣợc gửi kiểm tra trung tâm kiểm nghiệm uy tín có chức kiểm nghiệm vi sinh vật 63 Bảng 30: Bảng tổng hợp kết kiểm nghiệm đa chủng STT Tên mẫu Thực kiểm 1x108-109 cfu/g 2,5x109 cfu/g Probiotics -Lactobacillusacidophilus 1x108-109 cfu/g 3,7x108 cfu/g -Streptococcus faecalis 1x108-109 cfu/g 1,6x109 cfu/g -Saccharomyces boulardii 1x108-109 cfu/g 2,4x108 cfu/g Chế phẩm - Bacillus subtilis ≥108-109 cfu/g 2,5x109 cfu/g Probiotics -Lactobacillusacidophilus ≥108-109 cfu/g 2,7x108 cfu/g -Streptococcus faecalis ≥108-109 cfu/g 1,2x109 cfu/g -Saccharomyces boulardii ≥108-109 cfu/g 2,5x108 cfu/g Chế phẩm - Bacillus subtilis ≥1011 cfu/kg ≥7,5x1011 cfu/kg Probiotics -Lactobacillusacidophilus ≥1011 cfu/kg ≥1,5x1011 cfu/kg -Streptococcus faecalis ≥1011 cfu/kg ≥6x1011 cfu/kg -Saccharomyces boulardii ≥1011 cfu/kg ≥3x1011 cfu/kg đa chủng Trên bao bì Chế phẩm - Bacillus subtilis đa chủng Tiêu chuẩn đa chủng Bảng biểu thị kết kiểm tra mật độ sản phẩm đa chủng đƣợc sử dụng làm nguyên liệu đầu vào cho sản phẩm thực phẩm chức (men tiêu hóa) Sản phẩm đa chủng gồm chủng: B.subtilis, L.acidophilus, Streptococcus faecalis Sacharomyces boulardii Đây sản phẩm dạng nguyên liệu viện vi sinh vật Công nghệ Sinh học- Đại học QGHN, có chủng luận văn B.subtilis L.acidophilus Sản phẩm đa chủng đƣợc gửi kiểm nghiệm viện trung tâm có chức kiểm nghiệm nƣớc, kết thu đƣợc mật độ đơn chủng thực kiểm đạt vƣợt mật độ lý thuyết 64 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Trong trình nghiên cứu đề tài viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh hoc-đại học Quốc Gia Hà Nội, xác lập đƣợc thông số nuôi cấy chủng vi sinh vật Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus: Thông số nuôi cấy Bacillus subtilis: - Nhiệt độ nuôi cấy : 35 – 37oC khoảng nhiệt độ thích hợp cho chủng giống - Tốc độ khuấy: 100 v/p sau – tiếng sau cấp giống tăng khấy lên 120 – 150 v/p thu sản phẩm - Lƣu lƣợng khí: 10 – 30 l/p - Thời gian thu sinh khối: 22 – 26 - pH môi trƣờng nuôi cấy dao động: 5.8 – 7.0 - Tỉ lệ chủng giống: 1.5 – 3% theo thể tích - OD chủng giống: 2.0 – 2.8 (5x109-1x1010 cfu/ml theo mật độ) Thông số nuôi cấy Lactobacillus acidophilus: - Nhiệt độ nuôi cấy : 35 – 37oC khoảng nhiệt độ thích hợp cho chủng giống - Tốc độ khuấy: 100 v/p giữ nguyên suốt trình lên men - Thời gian thu sinh khối: 24 – 30 - pH môi trƣờng nuôi cấy dao động: 6.5 – 7.0 - Tỉ lệ chủng giống: 1.5 – 3% theo thể tích - OD chủng giống: 1.5-1.8 ( tƣơng đƣơng 8x109- 1x1010 cfu/ml) Tiến hành lên men thu sinh khối bào tử với chủng Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus thiết bị lên men 75 lít Lƣợng sinh khối chủng Bacillus subtilis sau lên men đạt 3-5x 1010 cfu/ml, tỷ lệ bào tử đạt 95% Lƣợng sinh khối sau lên men chủng Lactobacillus acidophilus đạt 3-5x 1010cfu/ml Kết lên men bán liên tục với chủng Bacillus subtilis cho thấy sau 24h lên men, lƣợng sinh khối đạt 1.1x 1011 cfu/ml, tăng 100% so với lên men theo mẻ 65 Tìm hiểu đƣợc chất mang thích hợp cho chủng vi sinh vật nghiên cứu:  Đối với chủng Bacillus subtilis công thức số với thành phần gồm tinh bột tan (50%) đƣờng lactose (50%) đảm bảo khả sống sau đông khô ≥80% Tỷ lệ sống với điều kiện bảo quản 4- 80C thời gian tháng ≥ 80%  Đối với chủng Lactobacillus acidophilus công thức số với thành phần gồm tinh bột tan (30%) ,đƣờng lactose (40%) bột sữa gầy (30%) đảm bảo khả sống sau đông khô ≥ 50% Tỷ lệ sống với điều kiện bảo quản 4- 80C thời gian tháng ≥ 80% KIẾN NGHỊ Mong muốn đƣợc nghiên cứu thêm công thức chất mang khác với thành phần tối ƣu để đƣa công thức chất mang thích hợp giúp cho việc tạo chế phẩm mật độ vi sinh vật sống đƣợc trì ổn định tốt điều kiện bảo quản lạnh 4-8ºC mà kéo dài tuổi thọ tính định nhiệt độ phòng (≤ 25oC) thuận tiện cho trình vận chuyển nhƣ đạt đƣợc giá trị kinh tế cao Tiến hành nghiên cứu để đƣa vào sản phẩm probiotic đa chủng thêm nhiều chủng hữu ích phục vụ nhu cầu ngành chăn nuôi Thử nghiệm sản phẩm probiotic đa chủng dạng dịch 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn La Anh, Đinh Mỹ Hằng, Vũ Quỳnh Hƣơng, Nguyễn Hƣơng Giang, Nguyễn Thị Lộc (2003), “Đặc điểm chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum có ứng dụng công nghệ sản xuất nƣớc CVAS”, Tuyển tập báo cáo Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc năm 2003, pp 159-161 Lê Thanh Bình, Phạm Thị Ngọc Lan, Yoshimi Benno (1999), “Tác dụng tăng trƣởng gia cầm chế phẩm vi sinh vật PRO 99”, Tuyển tập báo cáo Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc năm 1999, pp 139-144 Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lƣơng, Đoàn Xuân Mƣợn, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học NXB khoa học kỹ thuật, tập 1,2 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2010), Vi sinh vật học, Nxb Giáo dục Việt Nam Nguyễn Thành Đạt (2007), Cơ sở sinh học vi sinh vật, Nxb Đại học Sƣ Phạm Nguyễn Thị Hồng Hà, Lê Thiên Minh, Nguyễn Thuỳ Châu (2003), “Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic probiotic”, Tuyển tập báo cáo Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc năm 2003, pp 251-255 Mai Thị Hằng, Đinh Thị Kim Nhung, Vƣơng Trọng Hào (2001), Thực hành vi sinh vật,NXB Đại học Sƣ phạm Lê Tấn Hƣng, Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phƣợng, Trƣơng Thị Hồng Vân., Võ Minh Sơn (2003), “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic BIO II kết thử nghiệm ao nuôi tôm”, Tuyển tập báo cáo Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc năm 2003, pp 75-79 Phạm Thị Ngọc Lan, Lê Thanh Bình (2003), “Đặc điểm phân loại chủng Lactobacillus probiotic CH123 CH126 phân lập từ đƣờng ruột gà”, Tuyển tập báo cáo Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc năm 2003, pp 101-105 10 Võ Thị Thứ, Lã Thị Nga, Trƣơng Ba Hùng, Nguyễn Minh Dƣơng, Nguyễn Liêu Ba (2003), “Nghiên cứu tạo chế phẩm BIOCHE đánh giá tác dụng chế 67 phẩm đến môi trƣờng nƣớc nuôi tôm cá”, Tuyển tập báo cáo Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc năm 2003, pp 119-122 11 Trần Quốc Việt, Bùi Thị Thu Huyền, Dƣơng Văn Hợp, Vũ Thành Lâm (2007), “Nghiên cứu thông số kỹ thuật sản xuất probiotic dạng lỏng dạng bột dùng chăn nuôi”, Báo cáo khoa học năm 2007 – Phần thức ăn dinh dưỡng vật nuôi, pp 204 – 214 TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI 12 Arturo A., Mario Rosa M., and Maria A M., (2006), “Probiotic for animal nutrition in the European Union”, Regulation and safety assessments, 45, pp 91-95 13 Apajalahti J.H.A, L.K Sarkilabti, B.R.E Maki, J.P Heikkinen, P.H Nurminen and W.E Holben (1998), “Effective recovery of bacteria DNA and percentguanine-plus-cytosin-based analysis of community structure in the gastrointestinal tract of broiler chickens”, Appl Environ Microbiol, 64, pp 4084 - 4088 14 Conway P L (1994), “Function and regulation of gastrointestinal microbiota of the pig” In: Proceedings of the VIth International Symposium on Digestive Physiology in Pigs EAAP Publication no 80 Edited by Souffrant, W.B., Hagemeister, H pp 231-240 15 Czerucka D and Rampal P (2002), “Experimental effects of Saccharomyces boulardii on diarrheal pathogens”, Microbes and infection, 4, pp 733-739 16 Dugas B., Mercenier A., Lenoir – Wijnkoop I., Arnaud C., Dugas N and Postaire E (1999), “Immunity and prebiotics”, Immunology Today, 20, pp 387-390 17 FAO/WHO (2001), “Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria”, Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria Argentina October 2001 18 FAO/WHO (2002), Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food, Joint FAO/WHO Working Group Report on Drafting Guidelines for the Evaluation of 68 Probiotics in Food London, Ontario, Canada, April 30 and May 1, 2002 19 Fonty G, Jouany J.P, Forano E and Gouet P (1995), Cited by Didier Jans 2005, Probiotic in animal nutrition, pp 2-20 20 Fuller R (1989), “Probiotics in man and animals” J Appl Bacteriol, 66, pp 65–78 21 Fuller R (1992), “History and development of probiotics”, In: R Fuller (Ed.) Probiotics: The Scientific Basis pp 1−8 Chapman & Hall, London 22 Patterson J.A and Burkholder K.M (2003), “Application of prebiotics and probiotics in poultry production”, J Animal Science, 82, pp 627-631 23 Steiner T (2006), Managing Gut Health, First published 2006 Nottingham University Press, Nottingham, UK, pp 45-56 24 Vahjen W., Glaser V and Simon O (1998), “Influence of xylanase supplemented feed on the development of selected bacterial groups in the intestinal tract of broiler chicks”, J Agr Sci., 130, pp 489-500 WEBSITE 25 http://www.anabio.com.vn/vn/san-pham-va-dich-vu/bacillus-subtilis-hu58 26 http://anhduongjsc.com.vn/index.php/tin-tuc/368-sy-thng-hoa-say-thang-hoasay-dong-kho-sy-thc-phm-sy-mit-sy-xoai-sy-thm-da-sy-kt-ong-freeze-drying 27 http://vi.wikipedia.org/wiki/Probiotic 28 http://vi.wikipedia.org/wiki/Lactobacillus_acidophilus 69 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Hồ sơ chủng VTCCB- 880 VTCCB- 871 Chủng VTCCB-880 - Ký hiệu khác: Bi - Tên loài: Bacillus subtilis - Nguồn gốc phân lập: Chế phẩm Bỉ + Môi trƣờng: Thạch thƣờng + Thời gian: năm 2008 - Bảo quản: + Thời gian: tháng năm 2008 + Phƣơng pháp: Lạnh sâu - 86 oC, nitơ đông khô - Điều kiện nuôi cấy: + Môi trƣờng: Thạch thƣờng + pH7 + Nhiệt độ: 30oC + Điều kiện sống: Hiếu khí - Hình thái: + Khuẩn lạc: Sau - ngày nuôi cấy đĩa thạch môi trƣờng thạch thƣờng, khuẩn lạc tròn, bề mặt xù xì, bóng, màu trắng, kích thƣớc 0.4 - 1.4 mm + Tế bào: Tế bào nuôi cấy môi trƣờng thạch thƣờng sau ngày có dạng que, kích thƣớc (1 - 1.5) × (0.2 - 0.3)µm 70 Khuẩn lạc chủng VTCC - B – 880 Tế bào bào tử chủng VTCC - B – 880 - Trình tự gen mã hóa cho rARN 16S CCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAG CGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTA ACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGG GGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGT GGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGG TGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGG TGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGG CAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACG CCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGA AGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAG AAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGG CAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCT TAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAA CTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCG GTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCT CTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGG ATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTA 71 GGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCC TGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCC CGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAAC CTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCT TCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGT GAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAgTTGC CAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGG AAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACA CACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAA GCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGA CTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTG AATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTT GTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAG GTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGA AgGTGCGGCTGGaTCACCTCCTTT Chủng VTCCB-871 - Ký hiệu khác: LTY3 - Tên loài: Lactobacillus acidophilus - Nguồn gốc phân lập: Sữa chua + Môi trƣờng: MRS + Thời gian: năm 2008 - Bảo quản: + Thời gian: tháng năm 2008 + Phƣơng pháp: Lạnh sâu - 86 oC, nitơ đông khô - Điều kiện nuôi cấy: + Môi trƣờng: MRS + pH7 + Nhiệt độ: 37oC 72 + Điều kiện sống: Hiếu khí kỵ khí tùy tiện - Hình thái: + Khuẩn lạc: Sau 2-4 ngày nuôi cấy đĩa thạch môi trƣờng MRS, khuẩn lạc tròn, nhỏ, bóng, lồi, màu trắng sữa, kích thƣớc 0.5-1mm + Tế bào: Tế bào nuôi cấy môi trƣờng MRS sau ngày có dạng que nhỏ, dài Khuẩn lạc chủng VTCCB- 871 Tế bào chủng VTCCB- 871 - Trình tự gen mã hóa cho rARN 16S TAAGCTGTCGCTATGGGATGGCCCCgCgGTGCCTTAGCTAGtTGGTAGGG TAACGgCCTACCAAGGCAATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCG GCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAG TAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTTTGATGGAGCAACGCCGCGTG AGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTGGTGAAGAAGGA TAGAGGTAGTAACTGGCCTTTATTTGACGGTAATCAACCAGAAAGTCAC GGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTG TCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGAAGAATAAGTCTG ATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAACTGCATCGGAAACTGTTTTT CTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATG CGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGC 73 AACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATAC CCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGGAGGTTTC CGCCTCTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTA CGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGC GGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGT CTTGACATCTAGTGCAATCCGTAGAGATACGGAGTTCCCTTCGGGGACA CTAAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTG GGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCCAGCaTTaA GTTGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGG GATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCT ACAATGGACAGTACAACGAGGAGCAAGCCTGCGAAGGCAAGCGAATCT CTTAAAGCTGTTCTCAGTTCGGACTGCAGTCTGCAACTCGACTGCACGA AGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTT CCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTCTGCAATGCC CAAAGCCGGTGGCCTAACCTTCGGGAAgGAGCCGTCTAAGGCAGGGCAG ATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGAGAACCTGCGGC TGGATCACCTCCTTT 74 Phụ lục 2: Đƣờng chuẩn OD- mật độ chủng Đường chuẩn OD- mật độ chủng Bacillus subtilis Mat x 10^ c fu/g C hart T itle 250 y = 48.448x + 2.1347 R = 0.9995 200 150 MD 100 L inear (MD) 50 0 OD Đƣờng chuẩn OD- mật độ chủng Lactobacillus acidophilus Mat x 10^ c fu/g C hart T itle y = 58.973x - 3.564 R = 0.9984 250 200 150 MD 100 L inear (MD) 50 0 OD Phụ lục 3: Giấy chứng nhận kết kiểm nghiệm đa chủng 75 ... tiến hành thực đề tài: Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm probiotic đa chủng vi n Vi sinh vật Công nghệ Sinh học- Đại học Quốc gia Hà Nội với mục tiêu xác định thông số quan trọng công nghệ. .. tƣớng Chính phủ Vi n Vi sinh vật Công nghệ Sinh học ngày vi n hàng đầu Công nghệ Sinh học Vi sinh vật Vi t Nam, đầu mối hợp tác nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật nƣớc quốc tế Vi n gồm nhiều phòng,... Hoàng Vi t xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới PGS.TS DƢƠNG VĂN HỢP Vi n Vi sinh vật Công nghệ Sinh học Đại học Quốc gia Hà Nội hƣớng dẫn bảo tận tình suốt trình học tập, nghiên cứu hoàn thành