NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC GIÀU CAROTENOPROTEIN TỪ PHẾ LIỆU TÔM LUẬN VĂN THẠC SĨ CHẾ BIẾN LƯƠNG THỰC, THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG

Lactobacillus fermentum .... Bacillus subtilis .... Astaxanthin và các ng d ng ..... DANH M C CÁC CH VI T T T ANOVA Analysis of Variance AA Activity of Amylase BOD Biochemical Oxygen Dem

TR NG I H C NÔNG LÂM

LÊ TH THANH

NGHIÊN C U THI T L P QUY TRÌNH S N XU T CH PH M PROBIOTIC

GIÀU CAROTENOPROTEIN T PH LI U TÔM

Chuyên ngành: Công ngh th c ph m

HU - 2018

TR NG I H C NÔNG LÂM

LÊ TH THANH

NGHIÊN C U THI T L P QUY TRÌNH S N XU T CH PH M PROBIOTIC

GIÀU CAROTENOPROTEIN T PH LI U TÔM

L I CAM OAN

Tôi xin cam đoan:

ơy lƠ công trình nghiên c u c a riêng tôi d i s h ng d n khoa h c c a PGS.TS Th Bích Th y Các s li u và k t qu trình bày trong lu n v n lƠ trung

th c, m t ph n đƣ đ c công b trên t p chí khoa h c chuyên ngành v i s đ ng ý

và cho phép c a các đ ng tác gi Ph n còn l i ch a đ c ai công b trong b t k công trình nào khác

Tác gi lu n v n

Lê Th Thanh

L I C M N

Trong su t quá trình h c t p, nghiên c u và hoàn thành lu n v n ngoƠi s n

l c vƠ đam mê c a b n thơn, tôi đƣ nh n đ c r t nhi u s giúp đ , đ ng viên c a quý

th y cô, gia đình vƠ b n bè

L i đ u tiên tôi xin bày t lòng c m n sơu s c t i PGS.TS Th Bích Th y

đƣ đ nh h ng nghiên c u và t n tình h ng d n tôi trong quá trình h c t p và th c

hi n lu n v n

Tôi xin c m n Phòng Ơo t o, Ban Giám hi u tr ng i h c Nông Lâm Hu

đƣ t o đi u ki n thu n l i vƠ giúp đ tôi hoàn thành m i th t c c n thi t trong quá trình làm nghiên c u

Tôi xin g i l i c m n chơn thƠnh t i Ban Ch nhi m Khoa, các th y cô giáo trong khoa C khí - Công ngh , tr ng i h c Nông Lâm Hu đƣ luôn quan tơm, giúp đ , t o đi u ki n thu n l i trong su t th i gian tôi h c tr ng và th c hi n đ tài lu n v n

Cu i cùng tôi xin c m n nh ng ng i thơn trong gia đình vƠ b n bè đƣ luôn bên đ đ ng viên, khích l , t o m i đi u ki n vƠ giúp đ tôi trong su t th i gian h c

t p vƠ nghiên c u v a qua

Tôi xin chân thành c m n!

Tác gi lu n v n

Lê Th Thanh

TÓM T T

Nghiên c u m t s thông s công ngh thích h p đ th y phân và lên men ph

li u tôm b i ch ng B subtilis C10 và L fermentum TC10 vƠ đ xu t quy trình s n xu t

ch ph m probiotic giàu carotenprotein t PLT K t qu c a đ tài làm ti n đ cho nghiên c u x lý PLT k t h p hai ch ph m vi sinh nh m t o ra ch ph m probitic giàu carotenoprotein có kh n ng ng d ng trong ch n nuôi Các ph ng pháp đ c

s d ng đ phân tích các ch tiêu trong quá trình nghiên c u và th c hi n n i dung đ tƠi: ph ng pháp t ng sinh vƠ nuôi c y đ thu nh n sinh kh i t bƠo, xác đ nh s t bào

s ng b ng ph ng pháp đ m khu n l c trên đ a th ch, xác đ nh ho t đ protease b ng

ph ng pháp Ason c i ti n, xác đ nh hƠm l ng protein t ng s b ng ph ng pháp Kjeldahl, xác đ nh hƠm l ng nit formol b ng ph ng pháp sorensen, xác đ nh ho t tính kháng oxy hóa b ng ph ng pháp DPPH, xác đ nh hƠm l ng astaxanthin trong

ph li u tôm vƠ xác đ nh đ m b ng ph ng pháp s y đ n kh i l ng không đ i

Các thông s công ngh thích h p đ x lý PLT trong quy trình s n xu t ch

ph m probiotic giàu carotenprotein: t l gi a B subtilis C10 và L fermentum TC10 gieo c y ban đ u vào PLT là 1:2 Nhi t đ lên men 35oC và th i gian lên men 24 gi Sau khi xác đ nh đ c các thông s đ x lý PLT, chúng tôi ti p t c kh o sát t l ph i

tr n dch carotenoprotein thu đ c t quá trình lên men vào ch t mang bã s n khô,

th c hi n s y ch ph m nhi t đ 35oC trong 5 gi vƠ đƣ xác đ nh đ c t l ph i tr n thích h p là 1:4 thông qua các ch tiêu m t đ t bào s ng (9,45 lg CFU/g), ho t đ protease (28,74 UI/ml), hƠm l ng astaxanthin (4,2 µg/g) vƠ đ m (6,9%) đ t yêu c u

c a ch ph m Xây d ng đ c quy trình s n xu t ch ph m probiotic giàu carotenoprotein t ph li u tôm

M C L C

L I CAM OAN i

L I C M N ii

TÓM T T iii

M C L C iv

DANH M C CÁC CH VI T T T vii

DANH M C B NG BI U viii

DANH M C HÌNH NH ix

M U 1

1 t v n đ 1

2 M c tiêu đ tài 2

3 ụ ngh a khoa h c và th c ti n 2

CH NG 1 T NG QUAN CÁC V N NGHIÊN C U 3

1.1 T NG QUAN V PROBIOTIC 3

1.1.1 Khái ni m probiotic 3

1.1.2 Tác d ng c a probiotic 3

1.2 T NG QUAN V VI KHU N LACTIC 5

1.2.1 Khái ni m vi khu n lactic 5

1.2.2 ng d ng c a vi khu n lactic 6

1.2.3 Lactobacillus fermentum 8

1.3 T NG QUAN V VI KHU N BACILLUS 9

1.3.1 Gi i thi u v Bacillus 9

1.3.2 c đi m chung 10

1.3.3 Bacillus subtilis 10

1.4 PH LI U TÔM 13

1.5 PH C H P CAROTENOPROTEIN VÀ ASTAXANTHIN 13

1.5.1 Ngu n g c và b n ch t c a ch ph m caroten-protein 13

1.5.2 Astaxanthin và các ng d ng 14

1.6 TÌNH HÌNH NGHIÊN C U LIÊN QUAN N TÀI 16

1.6.1 Trên th gi i 16

1.6.2 Vi t Nam 20

CH NG 2 N I DUNG VẨ PH NG PHÁP NGHIểN C U 24

2.1 PH M VI VẨ I T NG NGHIÊN C U 24

2.1.1 Ph m vi nghiên c u 24

2.1.2 i t ng nghiên c u 24

2.2 N I DUNG NGHIÊN C U 24

2.3 PH NG PHÁP NGHIÊN C U 25

2.3.1 Ph ng pháp vi sinh 25

2.3.2 Ph ng pháp hóa sinh 26

2.3.3 Ph ng pháp v t lý 28

2.3.4 Ph ng pháp b trí thí nghi m đ th c hi n n i dung nghiên c u 29

2.3.5 Ph ng pháp x lý s li u 34

CH NG 3 K T QU NGHIÊN C U VÀ TH O LU N 36

3.1 THÀNH PH N HÓA H C C A PH LI U TÔM 36

3.2 K T QU NGHIÊN C U NH H NG C A T L GI A B subtilis C10 VÀ L fermentum TC10 GIEO C Y BAN U VÀO PH LI U TỌM N CH T L NG C A CH PH M PROBIOTIC GIÀU CAROTENOPROTEIN 37

3.2.1 nh h ng c a t l gi a B subtilis C10 và L fermentum TC10 gieo c y ban đ u vƠo PLT đ n ho t đ enzyme protease 37

3.2.2 nh h ng c a t l gi a B subtilis C10 và L fermentum TC10 gieo c y ban đ u vƠo PLT đ n m t đ t bào s ng 39

3.2.3 nh h ng c a t l gi a B subtilis C10 và L fermentum TC10 gieo c y ban đ u vƠo PLT đ n ho t tính kháng oxy hóa 40

3.2.4 nh h ng c a t l gi a B subtilis C10 và L fermentum TC10 gieo c y ban đ u vƠo PLT đ n hƠm l ng protein tách đ c so v i ban đ u 41

3.2.5 nh h ng c a t l gi a B subtilis C10 và L fermentum TC10 gieo c y ban đ u vƠo PLT đ n hƠm l ng nit formol 42

3.3 K T QU NGHIÊN C U NH H NG C A NHI T LÊN MEN N CH T L NG C A CH PH M PROBIOTIC GIÀU CAROTENOPROTEIN 43

3.3.1 nh h ng c a nhi t đ lên men đ n ho t đ protease 43

3.3.2 nh h ng c a nhi t đ lên men đ n m t đ t bào s ng 44

3.3.3 nh h ng c a nhi t đ lên men đ n ho t tính kháng oxy hóa 45

3.3.4 nh h ng c a nhi t đ lên men đ n hƠm l ng protein tách đ c so v i ban đ u 46

3.3.5 nh h ng c a nhi t đ lên men đ n hƠm l ng nit formol 47

3.4 K T QU NGHIÊN C U NH H NG C A TH I GIAN LÊN MEN N CH T L NG C A CH PH M PROBIOTIC GIÀU CAROTENOPROTEIN 48

3.4.1 nh h ng c a th i gian lên men đ n ho t đ protease 49

3.4.2 nh h ng c a th i gian lên men đ n m t đ t bào s ng 50

3.4.3 nh h ng c a th i gian lên men đ n ho t tính kháng oxy hóa 51

3.4.4 nh h ng c a th i gian lên men đ n hƠm l ng protein tách đ c so v i ban đ u 52

3.4.5 nh h ng c a th i gian lên men đ n hƠm l ng nit formol 54

3.5 K T QU NGHIÊN C U NH H NG C A T L PH I TR N D CH CAROTENOPROTEIN VÀO CH T MANG N CH T L NG C A CH PH M PROBIOTIC 55

3.5.1 nh h ng c a t l ph i tr n d ch carotenoprotein vào ch t mang đ n m t đ t bào s ng 55

3.5.2 nh h ng c a t l ph i tr n d ch carotenoprotein vào ch t mang đ n ho t đ protease, hƠm l ng astaxanthin vƠ đ m ch ph m 56

3.6 THI T L P QUY TRÌNH S N XU T CH PH M PROBIOTIC GIÀU CAROTENOPROTEIN T PH LI U TÔM 57

K T LU N VÀ KI N NGH 60

K T LU N 60

NGH 60

TÀI LI U THAM KH O 61

PH L C

DANH M C CÁC CH VI T T T

ANOVA Analysis of Variance

AA Activity of Amylase

BOD Biochemical Oxygen Demand

CFU Colony-forming Unit

COD Chemical Oxygen Demand

FBC Fat Binding Capacity

LAB Lactic acid bacteria

DANH M C B NG BI U

B ng 3.1 Thành ph n hoá h c c b n c a ph li u tôm 36

B ng 3.2 Thông s thích h p cho quá trình s n xu t ch ph m probiotic giàu carotenoprotein t PLT b i B subtilis C10 và L fermentum TC10 54

B ng 3.3 nh h ng c a t l ph i tr n d ch carotenoprotein vào ch t mang đ n ho t

đ protease, hƠm l ng astaxanthin vƠ đ m ch ph m 56

DANH M C HÌNH NH

Hình 1.1 Vi khu n Lactobacillus fermentum 8

Hình 1.3 Khu n l c Bacillus subtilis trên môi tr ng th ch 11

Hình 1.2 T bào Bacillus subtilis sau khi nhu m gram 11

Hình 1.4 Công th c c u t o astaxanthin 14

Hình 2.1 S đ b trí thí nghi m nghiên c u nh h ng c a t l gi a B subtilis C10 và L fermentum TC10 gieo c y ban đ u vƠo PLT đ n ch t l ng c a ch ph m probiotic giàu carotenoprotein 29

Hình 2.2 S đ b trí thí nghi m nghiên c u nh h ng c a nhi t đ lên men đ n ch t l ng c a ch ph m probiotic giàu carotenoprotein 31

Hình 2.3 S đ b trí thí nghi m nghiên c u nh h ng c a th i gian lên men đ n ch t l ng c a ch ph m probiotic giàu carotenoprotein 33

Hình 2.4 S đ b trí thí nghi m nghiên c u nh h ng c a t l ph i tr n d ch carotenprotein v i ch t mang đ n ch t l ng c a ch ph m probiotic giàu carotenoprotein 35

Hình 3.1 nh h ng c a t l gi a B subtilis C10 và L fermentum TC10 gieo c y ban đ u vƠo PLT đ n ho t đ protease 38

Hình 3.2 nh h ng c a t l gi a B subtilis C10 và L fermentum TC10 gieo c y ban đ u vƠo PLT đ n m t đ t bào s ng 39

Hình 3.3 nh h ng c a t l gi a B subtilis C10 và L fermentum TC10 gieo c y ban đ u vƠo PLT đ n ho t tính kháng oxy hóa 40

Hình 3.4 nh h ng c a t l gi a B subtilis C10 và L fermentum TC10 gieo c y ban đ u vƠo PLT đ n hƠm l ng protein tách đ c so v i ban đ u 41

Hình 3.5 nh h ng c a t l gi a B subtilis C10 và L fermentum TC10 gieo c y ban đ u vƠo PLT đ n hƠm l ng nit formol 42

Hình 3.6 nh h ng c a nhi t đ lên men đ n ho t đ protease 44

Hình 3.7 nh h ng c a nhi t đ lên men đ n m t đ t bào s ng 45

Hình 3.8 nh h ng c a nhi t đ lên men đ n ho t tính kháng oxy hóa 46

Hình 3.9 nh h ng c a nhi t đ lên men đ n hƠm l ng protein tách đ c so v i ban đ u 47

Hình 3.10 nh h ng c a nhi t đ lên men đ n hƠm l ng nit formol 48

Hình 3.11 nh h ng c a th i gian lên men đ n ho t đ protease 49

Hình 3.12 nh h ng c a th i gian đ n m t đ t bào s ng 51

Hình 3.13 nh h ng c a th i gian lên men đ n ho t tính kháng oxy hóa 52

Hình 3.14 nh h ng c a th i gian lên men đ n hƠm l ng protein tách đ c so v i ban đ u 53

Hình 3.15 nh h ng c a th i gian lên men đ n hƠm l ng nit formol 54

Hình 3.16 nh h ng c a t l ph i tr n d ch carotenoprotein vào ch t mang đ n m t đ t bào s ng 55

Hình 3.18 B t s n khô 57

Hình 3.17 D ch carotenoprotein 57

Hình 3.19 Ch ph m tr c và sau khi s y 57

Hình 3.20 Quy trình s n xu t ch ph m probiotic giàu carotenoprotein 58

ch t l ng s n ph m vƠ c i thi n môi tr ng ch n nuôi r t đ c quan tơm n c ta

hi n nay Vi c l m d ng kháng sinh c a ng i ch n nuôi đang tr thƠnh v n đ nan

gi i H qu lƠ l ng t n d kháng sinh có trong th c ph m không ch nh h ng đ n

v t nuôi mƠ còn nguy h i đ n s c kh e con ng i khi tiêu th th c ph m

h n ch và ti n t i lo i b kháng sinh trong th c n ch n nuôi, s d ng probiotic là m t trong nh ng gi i pháp thay th kháng sinh quan tr ng Probiotic là

nh ng vi khu n có ích ho c n m men khi đ a vƠo c th m t li u l ng v a đ s s n sinh ra các enzyme tiêu hóa, các vitamin và các ch t có ho t tính kháng khu n, t o ra

nh ng tác đ ng tích c c đ i v i quá trình tiêu hóa, giúp h p thu d ng ch t t t h n (FAO/WHO, 2001) [66]

Các loài Bacillus và Lactobacillus đ c xem là nh ng đ i t ng giàu ti m n ng

đ s n xu t probiotic Do Bacillus không ch có kh n ng sinh bƠo t đ ch ng ch u

v i đi u ki n môi tr ng b t l i (Sanders và cs, 2003, Hong và cs, 2005) [73], [109],

mà còn có th sinh ch t kháng sinh, ch t kháng khu n kìm hãm VSV (vi sinh v t) gây

b nh (Sanders và cs, 2003) [109] B subtilis sinh ra r t nhi u lo i enzyme, đ c bi t là

 amylase và protease ki m có giá tr cao Ngoài ra, B subtilis có kh n ng sinh ra riboflavin (ti n vitamin B2) (Nguy n Lơn D ng vƠ cs, 2001) [4] Lactobacillus đ c

bi t đ n là nhóm VK (vi khu n) có ch c n ng probiotic có nhi u tác đ ng có l i cho

s c kh e con ng i c ng nh đ ng v t Kh n ng sinh t ng h p bacterioxin c a VK lactic làm cho chúng c ch các VK gây b nh đ ng ru t ( Th Bích Th y, 2014) [25] L fermentum là VK có kh n ng ch ng ch u trong d ch d dày, d ch ru t non, kháng các VSV gây b nh, t ng c ng h mi n d ch, t ng kh n ng kháng oxy hóa (Gotteland và cs, 2006; Garcia và cs, 2009; Garcia và cs, 2012) [67],[68],[69]

Trong công ngh ch bi n thu s n xu t kh u c a Vi t Nam, công ngh ch

bi n tôm t o ra m t l ng l n PLT (ph li u tôm)bao g m đ u tôm và v tôm L ng nàyth ng chi m 50-70% nguyên li u ban đ u PLT là ngu n cung c p protein, chitin

và carotenoids (Holanda và Netto, 2006) [72].Trong đó, carotenoid đ c bi t là m t

ch t màu t nhiên an toàn cho các ngành công ngh th c ph m, d c ph m và m

ph m G n đơy, nhi u ph ng pháp đƣ đ c s d ng đ tách chi t và thu nh n các ch

ph m đ m giàu carotenoid Chúng có thành ph n chính là protein và carotenoid d ng

ph c h p caroten-protein và có nhi u trong ph li u giáp xác (tôm hùm, tôm sú, tôm chì, tôm th chân tr ng) và m t s ph li u h i s n khác Theo Lê Minh Hoàng và cs

(2015) thành ph n c a carotenoprotein tách chi t t v đ u tôm có mƠu đ g ch và mùi th m g m 7,1% hƠm l ng ch t khô, 68,5% hƠm l ng protein, 7,3% hƠm l ng lipid, 390 ppm hƠm l ng astaxanthin, 22,7% hƠm l ng khoáng [6] Vi c tách chi t chúng không ch thu nh n đ c các s n ph m có giá tr gia t ng mƠ còn gi m thi u ô nhi m môi tr ng (Chakrabarti, 2002; Ph m Th an Ph ng và Tr n Th Luy n, 2013) [16],[58] Vì v y, nghiên c u th y phân và lên men PLT b ng ph ng pháp vi sinh v a thu h i đ c hƠm l ng caroten-protein v a tách đ c l ng chitin đáng k (Ph m Th an Ph ng và cs, 2015) [19]

V i mong mu n t n d ng và nâng cao giá tr c a PLT b ng t o ra s n ph m probiotic b sung vào th c n ch n nuôi, góp ph n gi m thi u v n n n s d ng kháng sinh tràn lan, chúng tôi ch n đ tài: “Nghiên c u thi t l p quy trình s n xu t ch ph m

probiotic giàu carotenoprotein t ph li u tôm”

2 M c tiêu đ tài

Xây d ng quy trình công ngh s n xu t ch ph m probiotic giàu carotenoprotein

t PLT có kh n ng ng d ng trong ch n nuôi quy mô phòng thí nghi m làm ti n đ cho các nghiên c u quy mô ti n pilot và s n xu t

3 ụ ngh a khoa h c và th c ti n

1) Ý ngh a khoa h c

K t qu nghiên c u c a đ tài s góp ph n b sung thêm nh ng thông tin tài

li u liên quan đ n s n xu t ch ph m probiotic nói riêng vƠ các l nh v c trong công ngh th c ph m nói chung

2) Ý ngh a th c ti n

K t qu nghiên c u v ch ph m probiotic s t o ti n đ cho vi c xây d ng c

s s n xu t ch ph m quy mô công nghi p nh m nâng cao giá tr s d ng c a ph

li u tôm và góp ph n h n ch vi c s d ng kháng sinh trong ch n nuôi

nh ng tác đ ng có l i cho c th v t ch Có r t nhi u đ nh ngh a v probiotic đƣ đ c

đ ngh , Fuller (1989) (theo FAO/WHO, 2001), đƣ ch rõ b n ch t VSV c a probiotic qua đ nh ngh a: ắm t s b sung vi sinh v t s ng qua đ ng tiêu hóa mà t o ra nh ng tác đ ng có l i lên v t ch thông qua vi c gia t ng s cân b ng trong đ ng tiêu hóa”

N m 1998 Guarner vƠ Schaafsma (theo FAO/WHO, 2001) đ nh ngh a probiotic ắlƠ

nh ng vi sinh v t s ng, khi đ c đ a vƠo m t l ng thích h p, mang l i nh ng l i ích

s c kh e cho v t ch ” nh ngh a c a FAO/WHO (2001) đƣ khái quát đ c nh ng

đ c đi m chính c a probiotic, theo đó probiotic lƠ ắVSV s ng khi đ c đ a vƠo v i s

l ng h p lỦ đem l i l i ích cho s c kh e trên v t ch ” [66] Nh v y, nh ng đi m chính v probiotic là:

- Nh ng s n ph m g m có các VSV s ng khi có m t trong c th s gây ra tác

đ ng có l i cho v t ch

- C n đ c đ a vƠo v i m t l ng phù h p đ mang l i tác đ ng mong mu n Các VSV có tính ch t nh m t probiotic có m t trong đ i s ng, trong th c

ph m hƠng ngƠy, vƠ có th đ c đ a b sung vƠo c th thông qua đ ng n u ng các

s n ph m n s ng có ch a chúng nh s a chua, nem, tôm chua, d a c iầ

1.1.2 Tác d ng c a probiotic

Probiotic hi n nay không ch có l i cho con ng i mƠ còn đ c ng d ng trong nuôi tr ng th y s n, s d ng trong ch n nuôi gia súc, trong vi c x lỦ môi tr ng

1.1.2.1 Gi m nguỔ c tiêu ch y, r i lo n tiêu hóa

Trên th gi i m i n m th ng có vài tri u ng i ch t vì tiêu ch y, th ng t p trung ch y u tr em c a nh ng n c đang phát tri n Có kho ng 30% dân s

nh ng n c phát tri n b tiêu ch y do th c ph m (FAO/WHO, 2001) [66] Probiotic có

th làm gi m đ c nguy c tiêu ch y do có kh n ng c ch các VK gây b nh đ ng

ru t, c nh tranh ch trú đóng v i VK gây b nh b ng cách c n chúng bám dính vào thành ru t, ti t ra các enzyme h tr quá trình tiêu hóa nên có th làm gi m nguy c các tri u ch ng r i lo n v tiêu hóa, tiêu ch y (FAO/WHO, 2001; Parvez1 và cs, 2006; Lee và Salminen, 2009) [66],[81],[103]

1.1.2.2 Gi m nguỔ c nhi m Helicobacter pylori

Helicobacter pylori là m t lo i VK gram âm gây viêm d dày, có th d n đ n loét vƠ ung th d dày Các thí nghi m in vitro và th nghi m trên đ ng v t đƣ xác minh r ng VK lactic có th ng n ch n s phát tri n c a m m b nh và làm gi m ho t tính c a enzyme urease, m t enzyme c n cho Helicobacter pylori đ thích nghi v i

đi u ki n axit c a d dày (FAO/WHO, 2001) [66].Kabir vƠ cs (1997) đƣ ch ng minh

đ c L salivarius có kh n ng c ch Helicobacter pylori [76] Michetti và cs (1999)

c ng phát hi n ch ng L johnsonii La1 c ng có kh n ng c ch Helicobacter pylori

ng i [93]

1.1.2.3 Ng n ng a ung th

Probiotic có th làm gi m các nguy c v ung th (FAO/WHO, 2001; Saikali và

cs, 2004; Parvez1 và cs, 2006; Lee và Salminen, 2009) [66],[103],[81],[108] M t s

vi khu n đ ng ru t có th t o ra các ch t gơy ung th (carcinogen) nh các nitrosamine, s có m t c a probiotic s gây c ch s t ng tr ng c a các VK này và

do đó lƠm gi m đ c kh n ng ung th (FAO/WHO, 2001)[66] Nhóm c a Saikali và

cs (2004) và nhóm c a Mongkol vƠ cs (2009) đƣ phát hi n s a lên men s ng có ch a probiotic có th gi m nguy c ung th ru t k t (colon cancer) [94],[108] Theo nghiên

c u c a Yu và Li (2016) m t ng d ng lâm sàng c a ch ph m sinh h c đƣ cho th y các ch ng probiotic có th làm gi m t l viêm sau ph u thu t b nh nhơn ung th vƠ nghiên c u đƣ k t lu n các s n ph m probiotic đ c s d ng an toàn và giúp c i thi n

s c kh e c a v t ch , m t s ch ng probiotic còn có th đ c s d ng đ h tr ng n

ng a vƠ đi u tr ung th [124] Các nghiên c u trên dòng t bƠo c ng nh trên mô hình

đ ng v t vƠ c th ng i c a Motevaseli và cs (2017) cho th y probiotic có tác d ng làm gi m xâm l n vƠ di c n c a t bào ung th [95]

1.1.2.4 n đ nh h vi sinh v t trong đ ng ni u - sinh d c

Chi Lactobacillus có vai trò r t quan tr ng trong vi c ch ng l i m t cân b ng và nhi m trùng đ ng sinh d c và ni u đ o Do có kh n ng sinh axit lactic làm gi m pH

ơm đ o và sinh m t s ch t kháng khu n khác nên chúng có th c ch m t s VSV gây nhi m trùng đ ng ơm đ o (FAO/WHO, 2001) [66]

1.1.2.5 Kích thích h mi n d ch t nhiên

Bên c nh ch c n ng c ch các VK gây b nh đ ng ru t và n đ nh h VSV

đ ng ru t, VK probiotic còn có kh n ng kích thích mi n d ch H th ng mi n d ch t nhiên c a c th có các t bƠo đ i th c bào (Macrophage), t bào trung tính (neutrophil),

t bào gi t t nhiên (natural killer-NK, g m có t bào T gamma và T delta) Chúng là hƠng rƠo đ u tiên b o v c th b ng cách tiêu di t t bào l xâm nh p và trình di n kháng nguyên S xâm nh p c a VK lactic không gây b nh cho c th nh ng l i kích

thích ho t đ ng c a các t bào này, t đó t ng c ng đ c ho t đ ng mi n d ch S

có m t c a VK lactic còn có th kích thích s n xu t kháng th IgA (FAO/WHO, 2001) [66]

1.1.2.6 Ch c n ng dinh d ng và h tr tiêu hóa

VK lactic trong đ ng ru t t o ra m t s vitamin nh thiamine, nicotin, folic acid, pyridoxin, Vitamin B12, ầ; t o ra enzyme có l i nh lactase; gi i phóng các amino axit t do, các axit béo m ch ng n (Lee và Salminen, 2009) [81] Ngoài ra, s

có m t c a VK lactic trong các s n ph m lên men c ng lƠm t ng giá tr dinh d ng

c a chúng Các s n ph m nh s a chua, th t lên men chua (nem, xúc xíchầ) d tiêu

h n vƠ kích thích đ c v giác, t o c m giác ngon mi ng

i v i nh ng ng i th ng b ch ng không dung n p lactose (lactose intolerant) thì enzyme lactase c a VK lactic s giúp h tiêu hóa đ ng này d dƠng h n

1.1.2.7 Gi m h p thu cholesterol và l ng cholesterol huy t thanh

HƠm l ng cholesterol trong huy t thanh nh h ng r t l n đ n các b nh v tim

m ch N u hƠm l ng nƠy cao h n so v i m c bình th ng thì ng i b nh có nhi u nguy c m c các b nh v tim m ch và béo phì Vi c s d ng các s n ph m probiotic

có kh n ng lƠm gi m hƠm l ng cholesterol trong máu (Liong và Shah, 2005; Parvez1 và cs, 2006; Lee và Salminen, 2009) [81],[84],[103] Liong và Shah (2005) trong th nghi m in vitro đƣ nh n th y có s liên k t gi a cholesterol và t bào m t s

ch ng Lactobacillus, do đó gơy ra s lo i b cholesterol [84]

1.2 T NG QUAN V VI KHU N LACTIC

1.2.1 Khái ni m vi khu n lactic

VK lactic là nh ng VK t o ra s n ph m ch y u là axit lactic trong quá trình lên men carbonhydrate (D ng Nguy n Lơn, 1983; Prescott và cs, 2002) [3],[104] Là

nh ng VK gram d ng, b t đ ng, không sinh bào t , catalase và oxydase âm tính Kh

n ng sinh t ng h p nh ng h p ch t c n cho s s ng là r t y u, nên chúng là nh ng VSV đa khuy t d ng đ i v i nhi u amino acid, nhi u lo i vitaminầ, không có kh

n ng t ng h p nhân hem c a porphyrine, chúng không có cytochrome Nhi u loài trong chúng là nh ng VK k khí tùy nghi, vi hi u khí và có kh n ng t n t i c hi u khí c ng nh k khí

Chi Lactobacillus là chi l n nh t trong nhóm VK lactic, g m kho ng 80 loài v i

m c đ khác nhau r t nhi u v hình thái, đ c đi m sinh hóa và sinh lý S không đ ng

nh t th hi n kho ng t l mol G+C r t r ng, t 32-55% (Prescott và cs, 2002) [104] Tuy nhiên, chúng v n đ c ch p nh n trong m t chi th ng nh t theo đ nh ngh a c a chi, v c b n là nh ng VK lactic hình que

Theo Abbaszadeh và cs (2015), các VK lactic nh L acidophilus, L rhamnosus, L casei, L paracasei và Bifidobacterium bifidum có kh n ng c ch s phát tri n c a m t s lo i n m gây h i thông th ng nh A niger, A flavus, A parasiticus và P chrysogenum [39]

Arasu vƠ cs (2016) đƣ nghiên c u ti m n ng probiotic c a VK lactic và trong

đó L plantarum đƣ thu hút đ c nhi u nhà nghiên c u vì ng d ng r ng rãi trong

l nh v c y t nh kh n ng ch ng viêm, ch ng oxy hóa, ch ng ung th vƠ ch ng béo phì [45]

Nghiên c u c a Veron và cs (2017)cho th y 17 ch ng VK lactic đ c phân l p

t các lo i trái cây O ficus-indica m c các vùng khô c n t Argentina có ti m n ng probiotic Các đ c tính probiotic đ c ki m tra có kh n ng ch ng ch u trong đ ng tiêu hóa, tính ch t b m t t bào và ho t tính kháng khu n [122] Bên c nh đó chúng

c ng nh h ng đ n tính ch t c a n c ép lên men Theo nghiên c u c a Sandes (2017), bê m i sinh ra d b m t s VSV gây b nh niêm m c Vì th s d ng VK lactic

có tính ch t probiotic làm th c ph m b sung trong ch n nuôi giúp c i thi n s c kh e,

t ng hi u su t sinh s n v t nuôi và gi m nguy c nhi m trùng niêm m c [110]

Nghiên c u c a Abushelaibi vƠ cs (2017) đƣ xác đ nh tính ch t probiotic và lên men c a các ch ng VK lactic phân l p t s a l c đƠ Công trình nƠy đƣ nghiên c u các tính ch t c a LAB v sinh lý, kh n ng t k t dính, đ ng k t dính, tính k n c, ch u acid và mu i m t, lo i b cholesterol, sinh t ng h p exopolysaccharide và kh n ng sinh kháng sinh S bi n đ i c a các y u t trong quá trình lên men nh s phát tri n

t bào, s bi n đ i pH, s th y phơn protein c ng đ c nghiên c u trong công trình này [40]

1.2.2 ng d ng c a vi khu n lactic

VK lactic có kh n ng lên men đ ng t o axit lactic trong môi tr ng k khí làm cho pH gi m xu ng d i 5, c ch đ c các VSV khác Vì v y, chúng đ c ng d ng trong b o qu n th c ph m, trong ch bi n th c n gia súc, ch bi n s a, các s n ph m

th c ph m len men lactic và lên men thu nh n axit lactic quy mô công nghi p

xu t axit lactic thông qua lên men lactic là tuy n ch n dòng sinh axit lactic cao (Kaloyan và cs, 2008; Cock và Stouvenel, 2006) [63], [77] t i u hóa kh n ng lên men lactic, lên men lactic v i ngu n nguyên li u r ti n (Ohkouchi và Inoue, 2006) [99] và gây bi n đ i di truy n đ thu đ c các ch ng s n xu t cao

ép qu mu i chua Thông th ng đ c ch s phát tri n c a VK gây th i ngay t đ u

và t o đi u ki n cho VK lactic phát tri n, ng i ta th ng b sung và nguyên li u m t

l ng NaCl kho ng 3-5% Vi t Nam có khá nhi u s n ph m lo i nƠy nh tôm chua, nem chua, rau qu mu i chua ầ

c bi t, trong ngành công nghi p s a, VK lactic có vai trò r t quan tr ng Chúng là tác nhân chính trong quá trình s n xu t các s n ph m s a lên men có giá tr dinh d ng cao, d b o qu n Hai ch ng S thermophilus và L delbrueckii subsp bulgaricus đ c dùng đ s n xu t s a chua và m t s lo i phomat Lactococcus lastic

c ng đ c dùng trong s n xu t phomat M t s ch ng Leuconostoc có liên quan đ n quá trình chín vƠ quá trình lên men ban đ u c a s a chua và phomat (Prescott và cs, 2002; Axelsson, 2004) [49],[104] Ngoài ra còn có m t s nghiên c u tuy n ch n các

ch ng VK lactic m i đ s n xu t s a chua thông th ng và s a chua t đ u nành (Park

và Oh, 2007) [102]

1.2.2.3 chua th c n gia súc

ơy lƠ ph ng pháp đ c s d ng ph bi n trong các trang tr i ch n nuôi Th c

n khi không nh ng gi m đ c s t n th t giá tr dinh d ng mà còn b sung nhi u

lo i vitamin do VSV t ng h p Ph ng pháp nƠy d a vào s chuy n hóa đ ng có s n trong nguyên li u c a VK lactic

Nguyên li u đ c thƠnh đ ng, ho c ch t vào các h sơu trong đ t Các VSV

có s n trong nguyên li u s phát tri n d n lên u tiên là nhóm VK hi u khí phát tri n

m nh s d ng h t l ng oxy có trong đ ng nguyên li u, làm tiêu th ph n th c n d tiêu và phân gi i protein c a nguyên li u K t qu là t o đi u ki n cho VK lactic phát tri n, lƠm tích l y d n axit lactic

Bên c nh đó, VK lactic còn ng d ng trong tách chi t carotenoids Theo nghiên

c u c a (Armenta & c ng s , 2002) lên men lactic đ chi t xu t carotenoids t nhiên

t các l p v c ng là m t ph ng pháp đ n gi n và thân thi n v i môi tr ng đ đ t

L ng axit lactic sinh ra v a có tác d ng hoàn thi n h ng v đ ng th i có tác d ng

b o qu n cho s n ph m Bên c nh đó, VK lactic có ti m n ng probiotic l n, có ch c

n ng probiotic có nhi u tác đ ng có l i cho s c kh e con ng i c ng nh đ ng v t

H n n a, VK lactic trong đ ng ru t t o ra m t s vitamin nh thiamine, nicotin, folic acid, pyridoxin, vitamin B12 ầ t o ra enzyme có l i nh lactase, gi i phóng các amino acid t do, các axit béo m ch ng n (Lee và Salminen, 2009; Parvez1 và cs,

2006) [81],[103]

Ngoài ra L fermentum còn có kh n ng ch ng ch u trong d ch d dày, d ch ru t non, kháng các VSV gây b nh, t ng c ng h mi n d ch, t ng kh n ng kháng oxy hóa (Gotteland và cs, 2006; Garcia và cs, 2009; Garcia và cs, 2012) [67],[68],[69]

Strompfova vƠ cs (2005) đƣ nghiên c u nh h ng c a L fermentum AD1 lên

h VSV đ ng ru t c a chim K t qu đƣ ch ng minh r ng sau 4 ngày th nghi m thì

ch ng nƠy lƠm t ng đáng k s l ng axit lactic và làm gi m đáng k s l ng E coli trong phân T l t ng cơn hƠng ngƠy đƣ t ng 14% M c dù pH ru t c a c 2 nhóm chim t ng t nhau, nh ng n ng đ axit lactic nhóm thí nghi m t ng đáng k N ng

đ c a các axit h u c khác (acetic, acetoacetic, formic, succinic, valeric, propionic, butyric) c ng nh glutathione peroxidase trong máu không b nh h ng Ch s ho t

đ ng th c bào c a b ch c u c ng đ c c i thi n đáng k [117]

T nh ng nghiên c u c a Lin và cs (2009), m t s ch ng L fermentum phân l p

t gia c m đ c tìm th y có tính ch t probiotic r t c n thi t đ s d ng b sung vào th c

n ch n nuôi Nghiên c u này cho th y đ ng tiêu hóa c a gia c m có ti m n ng probiotic cho vi c phân l p VK lactic Ch ng h n nh Escherichia coli, Salmonella spp.,

S sonnei và m t s S aureus enterotoxigenic [83]

Nghiên c u c a Zoumpopoulou vƠ cs (2008) đƣ thƠnh công khi áp d ng mô hình chu t viêm đ i tràng và nhi m trùng salmonella đ làm th nghi m v i L fermentum ACA-DC 179 K t lu n là ch ng L fermentum ACA-DC 179 đ c đánh giá là có ti m n ng probiotic cao đ i v i ch c n ng ho t tính kháng khu n và kh n ng

mi n d ch [127]

Theo nghiên c u c a Hu nh Ng c Tơm vƠ cs (2016), d a lê non mu i chua

b ng ph ng pháp lên men t nhiên đƣ phơn l p đ c 19 dòng VK th hi n các

đ c đi m sinh hóa c a VK lactic Ngoài kh n ng sinh bacteriocin kháng l i VK,

L fermentum còn có đ c tính probiotic và có th s d ng trong các ch ph m sinh

h c [20]

VK lactic nói chung và L fermentum nói riêng có kh n ng sinh t ng h p axit lactic ti t ra môi tr ng L ng axit lactic sinh ra là gi m pH c a môi tr ng cùng v i

kh n ng sinh bacteriocin c a chúng làm c ch , th m chí là tiêu di t VSV gây b nh

c ng nh gơy th i Vì v y, các loài VK nƠy đ c s d ng r ng rãi trong b o qu n, ch

bi n th c ph m c ng nh x lý ph ph ph m Bên c nh đó, v i ti m n ng probiotic,

s có m t c a chúng trong các s n ph m th c ph m c ng nh trong các ch ph m thu

đ c sau khi x lý ph ph ph m góp ph n quan tr ng l n trong vi c c i thi n s c

kh e cho ng i c ng nh đ ng v t

1.3 T NG QUAN V VI KHU N BACILLUS

1.3.1 Gi i thi u v Bacillus

Bacillus là m t trong nh ng VSV đ u tiên đ c phát hi n và mô t trong giai

đo n đ u c a ti n trình phát tri n ngành VSV h c cu i th k 19 ơy lƠ m t chi

l n v i g n 200 loài VK hi u khí, hình que, có kh n ng sinh n i bào t đ ch ng

ch u các đi u ki n b t th ng c a môi tr ng s ng Bacillus phân b r ng rãi trong các h sinh thái t nhiên: t trên c n đ n d i n c, t n c ng t đ n n c m n và t vùng ven b đ n đáy các i D ng (Vos vƠ cs, 2009) [123] Bên c nh các loài VK gây b nh cho con ng i nh B anthracis và B cereus, nhi u loài VK Bacillus, đ c

bi t là nhóm B subtilis, có ti m n ng s n xu t các s n ph m th ng m i ng d ng trong y h c, trong nông nghi p và trong công nghi p th c ph m

1.3.2 c đi m chung

Bacillus phân b r ng rãi trong t nhiên, trong đ t, n c, không khí do chúng

có kh n ng hình thƠnh bƠo t và s ng hi u khí tùy ti n Ph n l n các ch ng thu c các loài c a gi ng nƠy đ u có kh n ng sinh ra nhi u -amylase và protease ki m, có m t

s ch ng sinh ra xenlulase, gi ng này không sinh ra lipase [29]

Bacillus lƠ VK Gram d ng, hình que có kích th c khác nhau (0,5-2,5) x 10) m Bacillus có chùm tiêm mao giúp chúng có kh n ng di đ ng Là VK d d ng hóa n ng, ho i sinh thu n ng l ng nh oxy hóa các h p ch t h u c [29]

(1,2-Bacillus có kh n ng sinh bƠo t Thông th ng bào t đ c t o ra khi t bƠo đƣ

tr i qua giai đo n phát tri n m nh nh t, hay do c n ki t ch t dinh d ng a s Bacillus sinh tr ng t t pH = 7, m t s phù h p v i pH = 9-10 nh B alcalophillus, hay có lo i phù h p v i pH = 2-6 nh B acidocaldrius V nhi t đ có nhi u ch ng a nhi t đ cao (45o

C-75oC), hay a l nh (5o

C-25oC), nh ng th ng g p Bacillus s ng nhi t đ 34o

C-37oC H u h t Bacillus không gơy đ c cho ng i vƠ đ ng v t M t s

lo i gơy đ c cho côn trùng Chúng có kh n ng sinh enzyme ngo i bƠo do đó đ c ng

d ng nhi u trong công nghi p, b o v môi tr ng, nông nghi p [29]

1.3.3 Bacillus subtilis

B subtilis đ c nhà khoa h c cùng th i v i Rober Knoch tên là Ferdinand Cohn phát hi n vƠ đ t tên n m 1872 B subtilis phân b nhi u trong đ t đ c bi t là c khô nên còn đ c g i là tr c khu n c khô Có d ng hình que, ng n và nh , kích th c 0,6 x (3-5) m B subtilis lƠ VK gram d ng, đôi khi các t bào n i l i v i nhau t o thành chu i dài, ng n khác nhau ho c các t bƠo đ ng riêng r (Hình 1.2) Là khu n

l c khô, không màu ho c màu xám tr ng, ho c t o ra l p màng m n, lan trên b m t

th ch, có mép nh n ho c mép l i lõm nhi u hay ít, bám ch t vƠo môi tr ng th ch (Hình 1.3) (Nguy n Lơn D ng, 1983; L ng c Ph m, 2007) [3],[15]

B subtilis có l p mƠng nhƠy, đ c c u t o ch y u t polypeptit ch y u là axit polyglutamic Vi c hình thành màng nhày giúp VK có kh n ng ch u đ c đi u ki n

kh c nghi t nh màng nhày có kh n ng d tr th c n vƠ b o v VK tránh b t n

th ng khi khô h n Nhi t đ thích h p cho s sinh tr ng c a B subtilis là 36oC ậ

50oC, t i đa kho ng 60oC, là lo i a nhi t cao Bào t c a B subtilis c ng ch u đ c nhi t khá cao Bào t có hình b u d c, kích th c 0,6 ậ 0,9 m Phân b không theo nguyên t c ch t ch nào, l ch tâm, g n tơm nh ng không chính tơm B subtilis sinh ra

r t nhi u lo i enzyme, đ c bi t là  amylase và protease ki m có giá tr cao, ngoài ra

B subtilis có kh n ng sinh ra riboflavin (ti n vitamin B2) Vì v y chúng đ c ng

d ng nhi u trong công nghi p c ng nh m t s ngành khác (Nguy n ThƠnh t 1990;

Nguy n Lơn D ng, 1983) [2],[3]

Ch ng B subtilis đ c ch ng minh là có kh n ng t o ra enzyme ngo i bào protease trong lên men tr ng thái r n (SSF) khi s d ng bánh đ u nƠnh lƠm môi tr ng nuôi c y (Soares và cs, 2005) Khi so sánh nh h ng c a nhi t đ nuôi c y và pH ban

đ u trong s n xu t protease gi a SSF và lên men chìm (SF), k t qu cho th y trong SSF có ph m vi pH r ng h n (5-10), nh ng cùng nhi t đ t i u (37o

C) Ho t đ enzyme protease vƠ n ng su t t i đa lƠ 960 U g-1

và 15,4 U g-1 h-1 đ i v i SSF và 12 U

mL-1 và 1,3 U mL-1 h-1 đ i v i SF Nh ng k t qu này ch ra r ng VK này có ti m

n ng công ngh sinh h c cao trong s n xu t enzyme protease khi lên men tr ng thái

r n [115]

Theo m t nghiên c u c a Zhao và cs (2012), thí nghi m đ c ti n hƠnh đ xác

đ nh nh h ng ti m n ng probiotic c a B subtilis T13 (phân l p t ru t c a chu t

bi n kh e m nh) v s t ng tr ng, kh n ng mi n d ch và kh n ng kháng b nh

Hình 1.2 T bào Bacillus subtilis sau

khi nhu m gram [131]

Hình 1.3 Khu n l c Bacillus

subtilis trên môi tr ng th ch [129]

Nghiên c u nƠy đƣ ch ng minh đ c tác d ng có l i c a B subtilis T13 nh lƠ probiotic trong ch đ n tr v thành niên[126].

Theo nghiên c u c a Lê Th H i Y n và Nguy n c Hi n (2016) kh o sát đ c tính probiotic c a 21 ch ng VK B subtilis phân l p t đ t và phân tr i gà t i các t nh

ng b ng sông C u Long K t qu cho th y, 100% các ch ng nh y v i 5 lo i kháng sinh trong 9 lo i th nghi m, t l nh y v i kháng sinh Colistin là th p nh t (5%) 10

ch ng trong t ng s 21 ch ng B subtilis có kh n ng sinh c 3 lo i enzyme ngo i bào amylase, protease và lipase Khi kh o sát tính đ i kháng v i VK gây b nh đ ng ru t, các ch ng AG27, AG60, VL05, VL28 có kh n ng c ch s phát tri n c a E.coli, Salmonella spp., Staphylococcus spp., và Streptococcus spp K t qu b c đ u cho

th y, 4 ch ng VK B subtilis AG27, AG60, VL05, VL28 có ti m n ng ng d ng làm probiotic trong ch n nuôi gia c m [38] Nghiên c u g n đơy c a Liu và cs (2009) v

vi c s d ng ch ng B subtilis E20 có kh n ng sinh protease m nh b sung vào th c

n c a tôm th chân tr ng (Litopenaeus vannamei) K t qu cho th y tôm có b sung

B subtilis E20 có kh n ng tiêu hóa t t h n h n so v i tôm không đ c b sung nên

n ng ch u đ ng pH th p (pH 2.0) và mu i m t (0,3%) B subtilis AMS6 c ng cho th y

ho t tính kháng khu n cao nh t ch ng l i ch ng gây b nh Salmonella enterica typhimurium (MTCC 1252) K t qu nghiên c u cho th y B subtilis AMS6 có ti m

n ng probiotic vƠ đ c ng d ng nh lƠ m t ph gia trong th c n ch n nuôi giúp t ng

c ng tiêu hóa ch t x vƠ s c kh e đ ng ru t c a đ ng v t [89]

B subtilis không nh ng có kh n ng sinh t ng h p nhi u enzyme ngo i bào mà còn c ch ho c tiêu di t các VK gây b nh đ ng ru t nh E coli, Samonellaầ H n

n a, loài VK này còn có kh n ng sinh bƠo t và có ch c n ng probiotic Chính vì v y,

vi c nghiên c u s d ng B subtilis đ x lý, th y phân, tách chi t protein t PLT s có

ti m n ng l n v kh n ng th y phơn đ tách chi t ng th i s có m t c a loài VK này trong ch ph m thu đ c s nh h ng có l i cho s c kh e c a v t nuôi

1.4 PH LI U TÔM

Ngu n PLT r t quan tr ng trong ch bi n tôm công nghi p hi n nay, nó chi m kho ng 35-45% tr ng l ng tôm PLT r t giàu ngu n chitin, protein và astxanthin Vì

v y vi c t n d ng ngu n ph li u nƠy đang đ c quan tâm trong nh ng n m g n đơy

Tr n Th Luy n (2004) cho bi t trong v tôm t i chitosan chi m kho ng 5% kh i

l ng, trong v tôm khô kho ng 20-40% kh i l ng PLT là nh ng thành ph n ph

th i t các c s ch bi n tôm bao g m đ u, v vƠ đuôi tôm NgoƠi ra, còn có tôm gƣy thân, tôm l t v sai quy cách ho c tôm b bi n màu [12] Holanda và Netto (2006) cho

r ng PLT có th chi m 50 - 70% so v i nguyên li u Ph n l n tôm đ c đ a vƠo ch

bi n d i d ng bóc v , b đ u Ph n đ u th ng chi m kh i l ng 34-45%, ph n v , đuôi vƠ chơn chi m 10-15% tr ng l ng c a tôm nguyên li u [72] Theo nghiên c u

c a (Trang S Trung và cs, 2015) s bi n đ i ch t l ng đ u tôm di n ra r t nhanh, protein vƠ astaxanthin trong đ u tôm t n th t đáng k ch sau 4 gi b o qu n nhi t đ

th ng ho c sau m t ngày b o qu n l nh [37] PLT d h ng m t ph n vì ch a enzyme phân gi i protein, m t ph n do quá trình phân h y vi sinh Các lo i ph li u này n u không đ c b o qu n mà th i tr c ti p ra môi tr ng s gây ô nhi m môi tr ng

tr m tr ng và n u đem x lý ch t th i thì chi phí s r t l n Hi n nay n c ta đa

s s d ng PLT đông l nh đ s n xu t th c n ch n nuôi NgƠy nay đƣ có r t nhi u

h ng nghiên c u s d ng PLT đ s n xu t các ch ph m có giá tr trong đó vi c

s n xu t chitin chitosan t v giáp xác là ph bi n nh t M t s công trình khác đi theo h ng tách chi t protein và carotenoid t ph ph ph m này Các công trình nghiên c u này s đ c gi i thi u ph n 1.6

1.5 PH C H P CAROTENOPROTEIN VÀ ASTAXANTHIN

1.5.1 Ngu n g c và b n ch t c a ch ph m caroten-protein

Trong các loài sinh v t bi n, carotenoid vƠ protein th ng liên k t v i nhau t o thành ph c carotenoprotein Ngoài ra, ph c carotenoprotein còn liên k t v i các ch t khác nh axit béo, chitin, khoáng ch t c bi t, ph c carotenoprotein th ng g p các loƠi đ ng v t giáp xác th y s n, t n t i nhi u l p ngo i bì, trong v , các c quan n i t ng (tr ng, d dày hay b ch huy t) Carotenoprotein đ c chia thành 2 nhóm chính: (1) carotenoid liên k t v i lipo (glyco) protein, (2) carotenoid liên k t v i m t protein ho c glycoprotein (Zagal sky, 1976) [125] Ph n ng gi a các nhóm 4- vƠ 4’-keto trong các vòng đ u m ch c a astaxanthin v i các nhóm ch c amin trong protein

lƠ đi u ki n tiên quy t đ hình thành ph c carotenoprotein gi a astaxanthin và protein (Chakrabarti, 2002) [58]

Ph c h p carotenoprotein tan trong n c và có tính b n v ng Trong m t vài

tr ng h p, màu s c c a nó b n đ n vƠi n m trong không khí đi u ki n nhi t đ phòng Các carotenoid có liên k t v i protein ít b oxy hóa h n so v i khi chúng

d ng t do Do v y, carotenoid trong c th sinh v t b n v ng h n so v i carotenoid sau tách chi t d ng t do Carotenoid d ng t do th ng có màu vàng, cam ho c

đ C u trúc c a carotenoid c ng quy t đ nh các ch c n ng sinh h c c a chúng, trong

đó ph n l n carotenoid đ u có m ch 40 carbon liên k t v i các nhóm ch c ch a oxy khác nhau Trong ph li u tôm, carotenoid ch y u là astaxanthin (trên 95%), thu c nhóm ch t tetraterpenoid, là s c t mƠu đ cam Trong các loài giáp xác th y s n, astaxanthin ch y u t p trung ph n v ngoài (Buchwald và Jencks, 1968; Chakrabarti, 2002; Armenta và Guerrero, 2009) [47],[55],[58]

1.5.2 Astaxanthin và các ng d ng

1.5.2.1 Gi i thi u

Công th c phân t c a astaxanthin thì t ng t nh -caroten nh ng nó ph c

t p h n (Hình 1.4) Astaxanthin có 13 n i đôi trong khi -caroten ch có 7 n i đôi nên

kh n ng ch ng oxy hóa c a nó c ng cao h n -caroten

Hình 1.4 Công th c c u t o astaxanthin [128]

Astaxanthin là d n xu t c a carotene và có công th c hóa h c lƠ 3,3’- dihydroxyl ậ 4,4’- diketo c a -carotene, công th c phân t là C40H52O4 , kh i l ng phân t M = 595 dvC Trong t nhiên nó t n t i đ ng phân d ng trans, khi k t tinh

t o thành tinh th màu tím (Bon và cs, 1997; Chumpolkulwong và cs, 1997) [53],[61]

Astaxanthin là m t carotenoid gi ng nh nhi u carotenoid, là m t ch t màu có

th tan trong dung môi không phân c c Astaxanthin có th tìm th y trong t o, n m men, cá h i, nhuy n th , tôm, các lo i giáp xác và lông v c a m t s loài chim Giáo s Basil Weedon lƠ ng i đi đ u trong vi c tìm ra c u trúc c a astaxanthin

khi gia nhi t do protein b bi n tính lƠm đ t các liên k t gi a ph c h p carotenprotein làm phóng thích astaxanthin t do Màu s c cu i cùng và s th m màu ph thu c vào hƠm l ng c a astaxanthin l ng đ ng l i

i v i nh ng th c ph m đ c bi t là s n ph m có ngu n g c t các loài giáp xác b bi n màu do gi m ho c m t astaxanthin trong quá trình ch bi n thì vi c b sung astaxanthin nh m t ph gia s lƠm t ng giá tr c m quan c a th c ph m (Ciapara và cs, 2006; Capelli và Cysewski , 2006; Nguy n Th Minh Nguy t, 2010) [14],[57],[62]

 Trong y h c

Astaxanthin có vai trò sinh h c đ c bi t quan tr ng đ i v i s c kh e con ng i

- Astaxanthin là m t tác nhân ch ng s oxy hóa

Do trong c u trúc c a astaxanthin có nhi u n i đôi nên nó lƠ m t ch t ch ng oxy hóa h u hi u c tính ch ng oxy hóa c a astaxanthin đ c th hi n ch nó

ng n c n s hình thành g c t do b ng cách lo i b oxy t do, trong tr ng h p các

- Astaxanthin là m t tác nhân ch ng ung th

Nghiên c u v đ c tính ch ng ung th c a astaxanthin đƣ đ c ti n hành trên chu t do Tanaka và c ng s (1994) th c hi n B ng cách qu n lý ch đ n astaxanthin đƣ cho th y h n ch đ c ch t sinh ung th bàng quang, khoang mi ng

và tr c tràng c a chu t Thêm vƠo đó, astaxanthin đƣ kích thích enzyme chuy n hoá

ch t l trong th n c a chu t, đơy lƠ quá trình có th ng n ng a ch t sinh ung th [118]

- Astaxanthin có vai trò ch ng đ trong h th ng mi n d ch

Astaxanthin có nh h ng đ n ch c n ng mi n d ch Astaxanthin lƠm t ng

l ng kháng th do s kích thích t bào lá lách chu t và t bào h ng c u c u (Ciapara và cs, 2006; Capelli và Cysewski, 2006) [57], [62]

- Astaxanthin là ch t b o v kh i ánh sáng

Ánh sáng đ c bi t là tia UV có th gây ra các ph n ng và s n ph m c a nó là oxy t do Lipit, protit, ch t mƠu đ u có liên quan đ n c ch này S thi t h i do s oxy hóa m t, da b i tia UV ngày m t nhi u nên tính ch ng oxy hóa c a astaxanthin

đ c đ ngh nh tác nhơn b o v

Nghiên c u hi u qu ch ng oxy hoá m t chu t cho th y r ng astaxanthin có

th c i thi n các võng m c b t n h i vƠ nó c ng có hi u qu t t trong vi c b o v t bào nh n kích thích ánh sáng kh i b thoái hóa (Higuera và cs, 2006; Khanafari và cs, 2007) [71],[78]

Trong các loài giáp xác th y s n, astaxanthin ch y u t p trung ph n v ngoài chi m 58 ÷ 87% t ng l ng carotenoid Nó th ng t n t i d ng t do, d ng mono hay dieste v i các axit béo không no m ch dài ho c d i d ng ph c carotenoprotein

c a d ng đ ng phân quang h c (3S, 3’S) HƠm l ng astaxanthin trong v tôm thay

đ i đáng k tùy theo loài (10 ÷ 40 mg/kg tr ng l ng t) (Buchwald và Jencks, 1968; Chakrabarti, 2002; Armenta và Guerrero, 2009) [55],[58]

Senphan vƠ cs (2013) đƣ nghiên c u phân tích thành ph n carotenoprotein c a tôm th chân tr ng vƠ đƣ công b có ch a 73,58% protein, 21,87% lipit và 2,63% hàm

l ng tro và giàu các amino acid thi t y u Do đó, vi c tách carotenoprotein t v tôm

th chân tr ng có th đóng vai trò lƠ thƠnh ph n th c ph m dinh d ng b sung ho c làm th c n ch n nuôi [112]

PLT, ph ph ph m c a quá trình ch bi n tôm ch a nhi u thành ph n có giá tr

nh chitin, chitosan, protein vƠ astaxanthin cùng m t s khoáng ch t, amino acid Vì

v y, nghiên c u khai thác các h p ch t có giá tr này là h t s c c n thi t

1.6 TÌNH HÌNH NGHIÊN C U LIểN QUAN N TÀI

1.6.1 Trên th gi i

1.6.1.1 Nghiên c u s n xu t ch ph m probiotic

Nghiên c u s n xu t ch ph m vi sinh, probiotic b sung vào th c n ch n nuôi đang đ c phát tri n m nh m trên th gi i do nh ng hi u qu to l n c a nó trong vi c

t ng n ng su t v t nuôi, nâng cao hi u qu s d ng th c n, h giá thành s n xu t và

b o đ m v sinh an toàn s n ph m Nh ng loài VK, n m men nh : L acidophillus, L platarum, B subtilis, B megaterium, T faecium, S boulardii, S serevisiae,… đƣ đ c

phân l p, nuôi c y và bào ch d i d ng ch ph m vi sinh, probiotic, prebiotic b sung vào th c n nh m c i thi n kh n ng n ng tiêu hóa, h p thu, nâng cao s c đ kháng và thay th s d ng kháng sinh, hóa d c trong th c n ch n nuôi (Simon, 2001) [114]

Theo Musa và cs (2009) ch ph m probiotic đƣ thúc đ y s t ng tr ng c a nhi u loƠi đ ng v t trong n c, giúp c i thi n hi u qu tiêu hóa th c n, s l ng và

ch t l ng c a s a, th t và tr ng Ch ph m probiotic b o v đ ng v t ch ng l i tác nhân gây b nh, t ng c ng kh n ng mi n d ch, gi m s d ng kháng sinh và cho th y

ch ph m probiotic có ch s an toàn cao [98]

Nghiên c u s d ng các loài L acidophilus, S faecium, ph i tr n gi a L acidophilus v i S faecium, Lactobacillus casei, L fermentum và L plantarum trong

th c n cho c u trong th i gian 7 tu n v i li u 6x106

CFU/kg (CFU: Colony forming unit) th c n đ kh o sát s bài th i E.coli O157 :H7 K t qu cho th y h n h p L cidophilus v i S faecium, L casei, L fermentum và L plantarum đƣ lƠm gi m s bài

th i E.coli trong phân (Lema và cs, 2001) [82] Nghiên c u c a Ezema (2013) đƣ

ch ng minh probiotic giúp thúc đ y t ng tr ng, nâng cao hi u qu s d ng th c n,

b o v v t ch kh i nhi m trùng đ ng ru t và kích thích ph n ng mi n d ch đ ng

v t trang tr i Ch ph m sinh h c lƠm t ng s n xu t tr ng gà công nghi p N ng su t

đƣ t ng đáng k gà th t và gà tây đ ng v t nhai l i, ch ph m sinh h c c ng c i thi n t c đ t ng tr ng T ng cơn vƠ hi u qu s d ng th c n cao h n lƠ k t qu c a các th nghi m trên l n T l t vong đ c bi t là do tiêu ch y đƣ gi m l n [65]

1.6.1.2 Nghiên c u x lý ph li u tôm

Chitin là ngu n t nhiên đ c tái t o ph bi n nh t sau cellulose và ngu n chính c a chitin là ph li u giáp xác Chitosan là m t d n xu t c a chitin sau quá trình deacetyl hóa đ c s d ng nhi u trong y t vƠ th ng m i Vì v y, đƣ có nhi u công trình nghiên c u tách chi t thu nh n chitin và chitosan t PLT b ng ph ng pháp hóa

h c c ng nh sinh h c

Các công trình s d ng ph ng pháp hóa h c th ng v i m c đích s n xu t

n c Chitin thô đ c x lý b ng axit clohydric đ m đ c và chitin tinh khi t thu đ c

sau khi x lý b ng dung d ch ki m Chitosan hòa tan trong n c đƣ đ c chu n b

b ng cách th c hi n m t quá trình deacetyl hóa b ng cách s d ng 50% NaOH (w/w)

100oC trong 4-5 gi vƠ sau đó r a s ch, s y khô và nghi n Islam và cs (2016) đƣ nghiên c u tinh ch chitin và chitosan b i m t lo t các thí nghi m đ c ti n hƠnh đ

t i u hóa m c đ NaOH, nhi t đ và th i gian kh khoáng và kh protein/deacetyl

hóa [75] Ch t l ng c a chitosan c ng đƣ đ c công b là ph thu c vƠo các đi u

ki n c a quá trình trích ly b ng hóa h c K t qu cho th y 3% HCL và 4% NaOH là

n ng đ phù h p đ kh khoáng và kh protein, t ng ng nhi t đ môi tr ng xung quanh (28 ± 2oC) (Hossain và Iqbal, 2014) [74] Nghiên c u c a Sadighara và cs (2015) đƣ mô t các s c t và chi t xu t chitosan t PLT b ng các ph ng pháp khác nhau Trong b c kh protein, s d ng ba quá trình chi t xu t là axit, ki m và enzyme K t qu nghiên c u đƣ ch ng minh có th thu đ c chitosan n ng su t cao khi x lý b ng enzyme [107] Tokatlố và Demirdöven (2018) đƣ nghiên c u vƠ đánh giá các đi u ki n s n xu t chitin và chitosan t PLT b ng ph ng pháp b m t đáp

ng i u ki n t i u cho s n xu t chitin đ c quan sát khi s d ng HCl 0,73 mol/l trong 132,61 phút nhi t đ phòng đ kh khoáng và 0,95 mol/l NaOH trong 75,65 phút 60,49oC đ kh protein [119] Ahing vƠ Wid (2016) đƣ nghiên c u s n xu t chitosan t v tôm Sabah vƠ đánh giá ch t l ng chitosan thông qua các thông s

bao g m đ m, đ hòa tan và m c đ deacetyl hóa (DDA) b ng các ph ng pháp hóa

h c g m quá trình kh protein, kh khoáng và deacetyl hóa Các k t qu thu đ c t nghiên c u này cho th y r ng đ m dao đ ng t 4-7%, trong khi đ hòa tan c a chitosan đ t t i 90% Giá tr DDA thu đ c cao dao đ ng t 70-85% [41]

Vi c x lý PLT b ng ph ng pháp hóa h c ch nh m m c đích thu nh n chitin

và chitosan Ph n d ch lo i b giƠu caroteinoprotein trong các ph ng pháp nƠy không

đ c t n d ng đ ng th i gây ô nhi m môi tr ng

Chính vì v y, m t s công trình nghiên c u tách chi t protein và carotenoprotein t PLT b ng ph ng pháp sinh h c đƣ đ c th c hi n

Lee và c ng s (1999) đƣ so sánh kh n ng tách chi t và thu h i carotenoid có trong ch ph m caroten-protein b ng ph ng pháp xi lô axit acetic vƠ ph ng pháp

k t h p s d ng dung dch đ m Na3-EDTA và enzyme protease v i m c đích s d ng làm ph m màu th c ph m ch c n ng K t qu nghiên c u cho th y hi u qu tách chi t

ch ph m caroten-protein b ng ph ng pháp k t h p s d ng Na3-EDTA và m t lo i enzyme protease sinh t ng h p t VSV (không xi lô b ng axit) đ t đ c lƠ cao h n [80] c đi m chung c a các enzyme này là có kho ng pH thích h p r ng, th ng t 5,5 - 8,5; vì v y, khi ng d ng th y phân thì có th thích ng v i pH môi tr ng t nhiên c a nguyên li u th y s n mà không c n đi u ch nh pH Nhi t đ thích h p c a các enzyme nƠy dao đ ng trong kho ng t 35 ậ 50oC S d ng protease s phá v các liên

k t c a các protein khác trong PLT, do đó lƠm gi m s k t t a protein t i đi m đ ng

đi n pI vƠ lƠm t ng kh n ng thu h i caroten-protein (Dauphin, 1991)[64]

Armenta-López vƠ cs (2002) đƣ nghiên c u trích ly astaxanthin t PLT b ng cách lên men lactic và th y phân b ng enzyme ph c h p carotenoprotein PLT đ c nuôi c y v i VK Lactobacillus, sau đó carotenoid đ c chi t xu t b ng các dung môi

h u c Tách ph c h p protein ậ s c t đ c th c hi n b ng cách s d ng h n h p 4 enzyme th ng m i vƠ protein đ c tách kh i s c t b ng ph ng pháp siêu l c[48] Carotenoprotein đƣ đ c ng d ng ph bi n trong nuôi tr ng th y s n nh t o màu cho tht cá, t ng h mi n d ch, gi m stress (Pan và cs, 2003) [101] K t qu nghiên c u c a Amar và cs (2001) cho th y astaxanthin giúp c i thi n màu s c th t cá

H i vân sau 9 tu n nuôi [42] Nghiên c u c a Bell và cs (2000) v s bi n đ i màu s c

c th t cá H i i Tơy D ng khi b sung astaxanthin c ng cho bi t màu s c c th t cá thay đ i rõ r t sau 12 tu n nuôi [50] Sowmya vƠ cs (2011) đƣ nghiên c u s d ng protease c a đ u tôm đ thu h i carotenoprotein v i ho t đ ng ch ng oxy hóa cao

Ho t tính protease cao nh t trích ly b ng dung dch đ m pH 8,0 (9,85 ± 0,61 đ n v )

Ho t tính protease t ng lên v i nhi t đ lên đ n 50o

C v i ho t đ cao nh t là 19,32 ± 2.0 đ n v và gi m sau đó Do đó, vi c t phân h y tôm đ thu h i carotenoprotein

đ c th c hi n pH 8,0 và 50oC i u ki n t i u đ có ho t tính ch ng oxy hóa giàu carotenoprotein t đ u tôm đƣ đ c xác đ nh là ch t th i vƠ đ m (pH 8.0) t l 1:

5 và th i gian phân h y 2 gi 50oC [116] Theo nghiên c u c a Arbia và cs (2013)

ph ng pháp m i s d ng VK lactic ho c VK phân gi i protein đƣ đ c s d ng đ chi t xu t chitin Ph ng pháp nƠy cho phép t o ra ch t l ng chitin t t và t n d ng

đ c ph n ch t l ng giàu protein có th đ c s d ng làm th c n cho ng i vƠ đ ng

v t, ngoƠi ra ph ng pháp nƠy còn t o ra s c t , ch y u là astaxanthin [46] Sila và cs (2014) đƣ nghiên c u các đ c tính sinh hóa và ch ng oxy hóa c a carotenoprotein t PLT b ng th y phân enzyme Thành ph n, tính ch t ch c n ng vƠ ho t tính ch ng oxy hóa trong ng nghi m c a ph n peptide c a carotenoprotein t PLT (Parapenaeus longirostris) đ c t o ra b ng cách x lý enzyme alcalase Ph n peptide c a carotenoprotein (PFCP) ch a 80,8 ± 0,21% protein, 2,74 ± 0,3% lipid, 14,4 ± 0,14% tro, 1,13 ± 0,08% chitin và 1,08 ± 0,02 g t ng s carotenoid/g m u C u trúc amino acid c a PFCP cho th y các amino acid thi t y u có t l cao nh arginine, lysine, histidine và leucine Do đó, PFCP có giá tr dinh d ng cao và có th đ c s d ng

nh m t ch t b sung protein cho các ch đ n u ng kém cân b ng K t qu t nghiên

c u này cho th y ph n peptide c a carotenoproteins là m t ch t ch ng oxy hóa t nhiên [113] Senphan vƠ cs (2014) đƣ nghiên c u đ c đi m và ho t đ ng ch ng oxy hóa c a carotenoprotein chi t xu t t v tôm th chân tr ng Thái Bình D ng b ng cách s d ng protease gan t y K t qu nghiên c u cho th y carotenoprotein bao g m 73,58% protein, 21,87% lipit vƠ 2,63% hƠm l ng tro và có th s d ng làm th c

ph m b sung dinh d ng ho c nh th c n ch n nuôi [112] Ngoài ra, carotenoid

c ng đ c dùng trong công nghi p th c ph m do chúng có kh n ng ch ng oxy hóa, kích thích h th ng mi n dch, kích thích t ng kh n ng sinh tr ng và sinh s n Nó còn có th giúp làm gi m stress vƠ ng n ng a m t s b nh thoái hóa c th nh ch ng

x v a đ ng m ch, ung th vƠ các b nh v m t (Britton, 1995; Mayne, 1996; Chien và

cs, 2003; Higuera và cs, 2006; Khanafari và cs, 2007) [54],[59],[71],[78],[90]

Ph ng pháp sinh h c đ chi t xu t chitin t PLT là m t k thu t tiên ti n và

m i trong đó chitin đ c chi t xu t b ng cách s d ng VK lactic và s n ph m t o ra

có ch t l ng t t K thu t thân thi n v i môi tr ng và chi phí th p nƠy đòi h i 24 -

48 gi c y Lactobacillus đ lên men C y 10% ch ng đ lên men v i PLT cùng v i

l ng carbon đ c trong 180 gi , ti p theo là l c vƠ chitin đ c s y khô b ng u

đi m c a ph ng pháp nƠy lƠ s n ph m c a ch t l ng giàu protein và có th đ c s

d ng cho th c n cho ng i vƠ đ ng v t (Pal và cs, 2014) [100] Messina và cs (2014)

đƣ đánh giá m c đ th y phân sau quá trình th y phân PLT đ c th c hi n b i ba enzyme protease th ng m i lƠ Protamex, Flavourzyme vƠ Alcalase H n n a đ thu

h i astaxanthin t ch t th i tôm khô, s d ng dung môi h u c vƠ siêu t i h n CO2

N ng su t chi t (µg/g) gi a hai ph ng pháp đ c s d ng đơy đ c so sánh thông qua phân tích quang ph Gi a các protease đ c s d ng, Protamex có DH% cao

nh t K t qu hexane/ isopropanol là dung môi t t nh t đ chi t astaxanthin [91]

1.6.2 Vi t Nam

Các nghiên c u trong n c đƣ đóng góp tích c c vào vi c c i thi n tình hình

ch n nuôi Tìm ra nh ng ch ph m m i có công d ng trong ch n nuôi gia c m, gia súc, th y s nầ Theo Nguy n Ti n ToƠn vƠ V n Ninh (2013) khi b sung 0,6% probiotic trong kh u ph n th c n giúp t ng t c đ sinh tr ng c a gà lên 4% và h s tiêu th th c n trên 1 kg t ng tr ng gi m 9,8% [30] K t qu nghiên c u này ch ra

ti m n ng s d ng lysine và probiotics trong kh u ph n th c n cho gƠ nuôi th ng

ph m đ c i thi n t c đ sinh tr ng, hi u qu chuy n hóa th c n vƠ ch t l ng th t

Lê V n An vƠ cs (2017) đƣ nghiên c u s d ng ch ph m probiotic (B subtilis và L plantarum) trong kh u ph n th c n giai đo n nuôi l n sau cai s a và nuôi th t [1]

VK lactic và VK Bacillus lƠ nh ng VK có đ c tính probiotic đ c s d ng nhi u trong các ch ph m sinh h c cho ng i vƠ đ ng v t T các m u đ t ao nuôi tôm, phơn giun lƠm th c n nuôi tôm, t đ ng tiêu hóa c a tôm, Khu t H u Thanh

vƠ cs (2009) đƣ phơn l p đ c 60 ch ng VK lactic và Bacillus Trong đó 18/32 ch ng

VK lactic vƠ 12/28 ch ng VK Bacillus có ho t tính đ i kháng VK Vibrio và VK

ki m đ nh Nghiên c u đƣ xác đ nh trình t 16 S rRNA c a các ch ng LPG 5, LRT8, BaD vƠ BaRT Ch ng LPG 5 t ng đ ng 100% v i L acidophilus strain LH5, ch ng LRT8 t ng đ ng 98% v i L helveticus strain IMAU40107, ch ng BaD t ng đ ng 100% v i B subtilis strain EBS05, ch ng BaRT t ng đ ng 97% v i Bacillus sp strain RSP-GLU Ch ph m probiotic t o đ c có hi u qu t ng s c kháng b nh c a tôm sú đi u ki n thí nghi m, t l tôm s ng t ng kho ng 15%, tr ng l ng tôm 120 ngƠy tu i t ng kho ng 13% so v i đ i ch ng [22]

Hi n nay Vi t Nam, ph n l n các nhà s n xu t chitin vƠ chitosan đ u s d ng

ph ng pháp hóa h c Nh c đi m c a ph ng pháp nƠy không nh ng không t n

d ng đ c ph n ch t l ng carotenoprotein, mƠ ng c l i ph n này s b lo i b cùng

v i hóa ch t gây ô nhi m môi tr ng kh c ph c đ c v n đ trên đƣ có m t s công trình nghiên c u v vi c x lý PLT b ng ph ng pháp sinh h c Trang S Trung (2008) đƣ đánh giá ch t l ng s n ph m và hi u qu v m t môi tr ng c a quy trình

s n xu t chitin t PLT đ c th c hi n b ng cách k t h p x lý enzyme và thu h i chitin cùng v i h n h p protein và astaxanthin trong quy trình Quy trình c i ti n có nhi u u đi m nh thu h i l ng ch t khô trong ph li u t ng lên kho ng 20% Chitin, chitosan thu đ c có ch t l ng cao h n, đ c bi t lƠ đ nh t so v i ph ng pháp hóa

h c truy n th ng H n h p protein vƠ astaxanthin thu đ c có ch t l ng cao, có th

ng d ng trong ch bi n th c n gia súc NgoƠi ra, n c th i c a quy trình c i ti n có hƠm l ng ch t l l ng th p, gi m h n 90%, BOD gi m 50%, COD gi m h n 30% so

v i n c th i c a ph ng pháp hóa h c không thu h i protein [35]

K t qu nghiên c u c a Ph m Th an Ph ng và cs (2008) cho th y carotenoprotein có thành ph n ch y u là protein (kho ng 55%), khoáng, chitin và astaxanthin [18] Trong đó, carotenoprotein có ch a m t l ng caroten, c th là astaxanthin v i hƠm l ng lên đ n trên 140 mg/kg Vì astaxanthin là m t ch t có ho t tính sinh h c cao, có nhi u ng d ng trong th c n th y s n (Kittikaiwan và cs, 2007)[79] V nh h ng c a ph ng pháp x lý lo i n c b ng s y nhi t đ th p vƠ ph i

n ng, k t qu cho th y s y nhi t đ 35oC thì không nh h ng nhi u đ n ch t l ng

b t carotenoprotein, th hi n r t rõ hƠm l ng astaxanthin còn l i so v i ph ng pháp s y đông khô (đ i ch ng) Ng c l i, làm khô b ng ph i n ng nh h ng r t l n

đ n hƠm l ng astaxanthin S tác đ ng x u do ph i n ng x y ra vì astaxanthin r t d

b phân h y d i tác d ng c a nhi t và ánh sáng

Theo nghiên c u c a Ph m Th an Ph ng và cs (2008), carotenoprotein

d ng b t nhƣo có hƠm l ng n c cao trên 69% thu nh n t quá trình ch bi n chitin

đ c x lý thành d ng b t khô v i đ m 13-14% Ph ng pháp tách n c b t carotenoprotein thích h p là s y nhi t đ 35o

C [18] B t carotenoprotein sau khi x

lý ch a trên 58% protein v i đ y đ các amino acid thi t y u, 5% chitin, và kho ng 14% khoáng và m t l ng astaxanthin đáng k Theo nghiên c u c a Trang S Trung

và cs (2009) d ch thu h i theo ph ng pháp xi lô có màu s c đ p, mùi th m đ c

tr ng, ch a nhi u thành ph n có giá tr nh protein, khoáng, lipid, đ c bi t có ch a astaxanthin H n n a, d ch có g n nh đ y đ các acid amin đ c bi t là các acid amin thi t y u K t qu trên cho th y d ch là m t ngu n nguyên li u có giá tr đ ng

d ng trong ph i tr n s n xu t th c n cao đ m cho nuôi tr ng th y s n ho c s d ng

tr c ti p ph i ch cho th c n gia súc, gia c m [36] K t qu nghiên c u c a Nguy n Quang Huy và cs (2018) cho th y màu s c c th t c a cá H i vơn trong nuôi th ng

ph m thay đ i rõ r t sau 60 ngày nuôi s d ng th c n b sung astaxanthin [8] Do

v y, vi c b sung carotenoprotein vào th c n ch n nuôi lƠm t ng đ đ m vƠ t ng

c ng ho t ch t sinh h c (asthaxanthin) góp ph n nâng cao ch t l ng v t nuôi đ ng

th i s d ng hi u qu ngu n carotenoprotein thu nh n t PLT

Các ph ng pháp m i đ h n ch s d ng hóa ch t đ c ng d ng trong quá trình s n xu t chitin t PLT Vi c k t h p x lý b ng tác đ ng v t lý và sinh h c trong công đo n ti n x lỦ đƣ lo i b kho ng 85% protein có trong PLT và 65% kh i l ng các thành ph n phi chitin K t h p quá trình ti n x lý cho phép gi m 65% l ng HCl, 75% l ng NaOH HƠm l ng khoáng và protein c a s n ph m chitin thu đ c t quy trình có áp d ng công đo n ti n x lý th p h n 1% nh t c a s n ph m chitosan thu đ c t quy trình có áp d ng công đo n ti n x lý cao g p 2 l n so v i m u chitin

s n xu t b ng ph ng pháp hóa h c K t qu cho th y k t h p ti n x lý trong s n

xu t chitin là m t gi i pháp thân thi n v i môi tr ng trong s n xu t chitin t PLT (Trang S Trung vƠ cs 2012) [34] Vi c thu h i protein khi tách chi t chitin t v tôm

c ng đ c th c hi n b ng ph ng pháp đi n hóa (Nguy n V n Thi t và cs, 2012) [23]

K t qu thí nghi m cho th y ph n l n protein trong v tôm đ c chi t rút trong khoang catod trong l n đi n phân th nh t; hƠm l ng protein trong khoang catod t ng liên t c trong quá trình đi n phân, ít ph thu c vào n ng đ ch t đi n li NaCl và t l tuy n tính v i l ng nguyên li u v tôm s d ng cho đi n phơn H n n a, hƠm l ng protein trong khoang catod còn t ng lên kho ng 1,5 l n khi đun cách th y dung d ch catolite cùng v i v tôm 85 ± 5oC trong 30 phút sau m i l n đi n phân Trong th c

t , ph ng pháp xi lô b ng các axit h u c ho c k t h p axit h u c v i vô c v n

đ c nghiên c u và ng d ng khá ph bi n đ thu h i ch ph m d ch xi lô dùng cho

s n xu t th c n ch n nuôi gia súc vƠ th y s n Tuy nhiên, s d ng axit vô c đ xi

lô nh m m c đích thu h i ch ph m caroten-protein s không cho s n ph m có ch t

l ng cao so v i ph ng pháp xi lô b ng axit h u c ho c lên men vi sinh (VK), do các acid vô c có kh n ng phơn h y m t s carotenoid, đ c bi t là có kh n ng gơy

bi n tính protein Nh v y, ch ph m caroten-protein thu đ c s có ch t l ng th p

do l ng protein vƠ carotenoid thu đ c th p, đ c bi t nh h ng r t l n đ n màu s c

c a s n ph m do carotenoid b oxy hóa m nh và ch phù h p làm th c n ch n nuôi

H n n a, đ s d ng ch ph m caroten-protein thu đ c t quá trình xi lô b ng axit

vô c c n ph i đ c trung hòa ch bi n th c n ch n nuôi (Ph m Th an Ph ng và

cs, 2015) [19] Theo Trang S Trung vƠ cs (2010) các lo i enzyme đ c s d ng đ tách chi t ph bi n hi n nay là papain, trypsin, pepsin, m t s lo i protease chi t rút t VSV (A melleus, A oryzae, B Licheniforrnis, B subtilis, Pseudomonasầ) vƠ các lo i protease th ng m i khác (Alcalase, Protamex, Flavourzyme, Neutrase) [33]

Theo nghiên c u c a Nguy n Th Ng c Hoài và Ph m Vi t Nam (2017) vi c

xi lô PLT là m t ph ng pháp thu h i protein t PLT đƣ t n thu ph n l n protein đ làm th c n trong ch n nuôi ng th i, trong quá trình xi lô còn có m t l ng khoáng trong PLT c ng đ c tách ra do k t h p s d ng acid h u c v i n ng đ và t

l thích h p Bƣ PLT sau khi đ c tách riêng kh i d ch ép s đ c s d ng cho vi c

s n xu t chitin Ti n hành t i u hóa công đo n xi lô v i axit lactic trong quá trình chi t chitin t PLT th chân tr ng (Penaeus vannamei) b ng ph ng pháp m t đáp

ng, s d ng mô hình composit T i u 3 nhơn t n ng đ axit lactic (1-5%), t l r

đ ng (8-12%), th i gian xi lô (24-120 gi ) v i hai hàm m c tiêu lƠ hƠm l ng protein còn l i trên bã và hi u qu kh khoáng K t qu thu đ c thông s t i u

n ng đ axit lactic 2,5%, t l r đ ng b sung là 9,5%, th i gian xi lô là 75 gi v i

hi u qu kh protein khá cao (kho ng 78%), hi u su t kh khoáng thu đ c là 21,1% [5] Th Bích Th y và Tr n Th Luy n (2006) đƣ nghiên c u nuôi c y tr c ti p VK

B subtilis đ lo i protein ra kh i ph n v c a PLT K t qu nghiên c u đƣ xác đ nh

đ c đi u ki n nuôi c y thích h p trong quá trình nhân gi ng B subtilis đ ng d ng vào vi c lo i b protein ra kh i PLT [27]

B subtilis và L fermentum đ c xem là nh ng đ i t ng giàu ti m n ng đ s n

xu t probiotic B subtilis không ch có kh n ng sinh ch ng ch u v i đi u ki n môi

tr ng b t l i, mà còn có th sinh ch t kháng sinh, ch t kháng khu n kìm hãm VSV gây b nh B subtilis còn có kh n ng sinh ra r t nhi u lo i enzyme, đ c bi t là enzyme ngo i bào protease giúp cho quá trình th y phân tách chi t protein t PLT đ c d dàng L fermentum ngoài ch c n ng probiotic nh kh n ng ch ng ch u t t trong d ch

d dày, d ch ru t non, kháng các VSV gây b nh, t ng c ng h mi n d ch, t ng kh

n ng kháng oxy hóa [67],[68],[69] H n n a, vi c lên men sinh axit lactic là gi m pH trong môi tr ng c a L fermentum c ng góp ph n phá v các m i liên k t gi a ph n protein và ph n chitin trong PLT Chính vì v y, vi c k t h p hai ch ng VK này trong

vi c x lý tách chi t carotenoprotein t PLT không nh ng có hi u qu cho quá trình

th y phân các liên k t mà còn t o ra s n ph m có ch c n ng probiotic do có m t c a chúng trong ch ph m thu đ c

Vì v y, trong đ tƠi nƠy, chúng tôi đƣ ti n hành nghiên c u s k t h p gi a B subtilis C10 và L fermentum TC10 đ th y phân và lên men PLT nh m t o ra ch

ph m probiotic giƠu carotenoprotein đ đáp ng đ c nhu c u s d ng hi u qu th c

n trong ch n nuôi

d ng đ c r a s ch, đ ráo trong th i gian 5 phút Trong tr ng h p ch a lƠm ngay thì

r a s ch, bao gói và b o qu n đông đi u ki n nhi t đ -20o

(1) Phơn tích thƠnh ph n hóa h c c a PLT

(2) Nghiên c u nh h ng c a t l gi a B subtilis C10 và L fermentum TC10 gieo c y ban đ u vƠo PLT đ n ch t l ng c a ch ph m probiotic giàu carotenoprotein

(3) Nghiên c u nh h ng c a nhi t đ lên men đ n ch t l ng c a ch ph m probiotic giàu carotenoprotein

(4) Nghiên c u nh h ng c a th i gian lên men đ n ch t l ng c a ch ph m probiotic giàu carotenoprotein

(5) Nghiên c u nh h ng c a t l ph i tr n d ch carotenoprotein vào ch t mang đ n ch t l ng c a ch ph m probiotic giàu carotenoprotein

(6) Thi t l p quy trình s n xu t ch ph m probiotic giàu carotenoprotein t PLT

Khu n l c VK sau 24 gi nuôi c y đ c c y vào 1 ml môi tr ng l ng Ch ng

B subtilis C10 đ c c y vƠo môi tr ng có ch a cao th t và pepton, th c hi n nuôi

c y trên máy l c 220 vòng/ phút 35oC, 24 gi Ch ng L fermentum TC10 đ c c y vƠo môi tr ng MRS không l c 35oC, 24 gi

2.3.1.2 Ph ng pháp nuôi c Ổ đ thu nh n sinh kh i t bào

D ch nuôi c y t ng sinh (500 l) đƣ thu nh n m c 2.3.1.1 ti p t c đ c cho vƠo bình tam giác ch a 20 ml môi tr ng cao th t vƠ pepton th c hi n nuôi c y trên máy l c theo ch đ trên đ i v i B subtilis C10 500 l d ch t ng sinh c a ch ng L fermentum TC10 đ c c y vào 20 ml môi tr ng MRS và nuôi c y nh đi u ki n nuôi

c y t ng sinh

2.3.1.3 Xác đ nh s t bào s ng trong s n ph m b ng ph ng pháp đ m khu n l c trên đ a th ch

* Xác đ nh s l ng t bào s ng đ i v i VK lactic (TCVN 4884:2005) [21]

M u thí nghi m có ch a t bƠo VSV đ c đ ng hóa và pha loãng th p phân 1

ml d ch pha loãng thích h p đ c cho vƠo đ a petri vô trùng vƠ tr n v i môi tr ng MRS agar 43oC Sau khi l p môi tr ng th nh t đông, l p môi tr ng MRS agar

th hai đ c đ lên cho đ n khi kín b m t S l ng t bào s ng đ c xác đ nh b ng cách đ m s khu n l c phát tri n trên các đ a có s l ng n m trong kho ng 50 ậ 250 sau khi 37oC trong 48 gi T ng s VK lactic trong 1 ml m u th đ c tính theo công th c:

=

Trong đó, N: T ng s VK s ng có trong 1 ml m u th (CFU/ml), ∑ C: T ng s khu n l c đ m đ c trên t t c các đ a đƣ ch n; V: Th tích c y trên m i đ a (ml); n1:

S đ a c a đ m đ pha loãng th nh t đ c gi l i; n2: S đ a c a đ m đ pha loãng

th hai đ c gi l i; d: H s pha loãng c a đ m đ pha loãng th nh t

* Xác đ nh s l ng t bào s ng đ i v i VK B subtilis

M u thí nghi m có ch a t bƠo VSV đ c đ ng hóa và pha loãng th p phân 0,1

ml c a đ pha loãng thích h p đ c dàn đ u trên đ a th ch có ch a môi tr ng th ch

th t-pepton S t bào s ng đ c xác đ nh nh đ i v i VK lactic

2.3.2 Ph ng pháp hóa sinh

2.3.2.1 Xác đ nh ho t đ protease b ng ph ng pháp Ason c i ti n

H n h p ph n ng th y phân g m dung d ch enzyme và dung d ch casein 2,0%,

t l 1:2 đ c 30oC, 10 phút; ph n ng đ c k t thúc b ng cách cho dung d ch axit tricloacetic (TCA) 5,0% theo t l 5 th tích dung d ch axit cho 1 th tích enzyme vào

h n h p ph n ng; d ch n i thu đ c sau khi ly tơm đ c s d ng đ th c hi n ph n

ng t o màu v i thu c th Folin 0,2N có m t Na2CO3 6% (t l d ch n i: dung d ch

Na2CO3: Folin 0,2N = 1:4:1) M u ki m tra đ c th c hi n đ ng th i b ng cách cho dung dch tricloacetic acid (TCA) vƠo enzyme tr c khi v i c ch t h p th ánh sáng (OD) c a dung dch mƠu thu đ c sau ph n ng đ c đo trên máy quang ph k

b c sóng 750 nm D a vƠo đ th chu n tyrosine, đ tính s n ph m t o thƠnh t ng

b i H3PO3 t o thành (NH4)2P4O7 (amoni tetraborat) nh l ng mu i amoni tetraborat

t o thành b ng dung d ch H2SO4 0,1N cho đ n khi xu t hi n màu h ng nh t v i ch t

ch th tasiro (AOAC,1995) [44]

2.3.2.3 Xác đ nh hàm l ng nit formol b ng ph ng pháp Sorensen

i v i các acid amin dicarboxylic (acid glutamic, acid aspatic, ầ) ph i trung hòa tr c nhóm carboxylic t do đ n pH = 7 Khi dùng ph ng pháp Sorensen, ta

th ng chu n đ NaOH đ n mƠu đ th m đ đ m b o k t thúc đ nh phơn n m trong kho ng pH = 9,1 ậ 9,6 Trong đi u ki n nƠy, ta coi s nhóm ậCOOH (không tính các nhóm carboxylic t do) đ c chu n đ chính lƠ s phơn t acid amin trong m u Do khó nh n bi t lúc chuy n mƠu nên th ng dùng dung d ch mƠu tiêu chu n nh sau: l y

100 ml Na2HPO4 0,1N và cho thêm 0,5 ml phenophtaletin 0,1% (AOAC, 1996) [43]

Chu n b dung d ch m u:

- Dùng pipet l y chính xác 10 ml (Vm) cho vƠo bình đ nh m c 100 ml, cho

n c c t đ n v ch đ nh m c

Trung hòa m u:

- Dùng pipet l y chính xác 20 ml (V’) dung d ch m u cho vƠo bình nón dung tích 250 ml, cho ti p 2 ml phenolphthalein 0,5%, 20 ml n c c t, trung hòa dung d ch

v i NaOH 0,1N n u m u có tính acid đ n mƠu h ng nh t ho c v i HCl 0,1N n u m u

có tính base đ n không mƠu vƠ l y l i mƠu h ng nh t b ng vƠi gi t NaOH 0,1N

Chu n đ :

- Chu n đ dung d ch đƣ trung hòa b ng NaOH 0,1N t mƠu h ng nh t sang mƠu h ng

- Chu n đ dung d ch b ng NaOH 0,2N t mƠu h ng sang mƠu đ th m (pH = 9,1)

- Cho 10ml formol trung hòa dung d ch s m t mƠu, chu n đ dung d ch b ng NaOH 0,2N đ n khi có mƠu h ng nh t (pH = 8,3)

- Chu n đ dung d ch b ng NaOH 0,2N t mƠu h ng sang mƠu đ th m (gi ng mƠu tiêu chu n) (pH = 9,6)

Quy trình th c hi n: L y kho ng 20 µl đ n 40 µl d ch chi t tr n v i n c c t

đ đ t th tích lƠ 30 ml Sau đó thêm vƠo 1ml dung d ch DPPH 0,2 nM, l c đ u vƠ đ yên trong bóng t i 30 phút o đ h p thu quang h c b c sóng 517 nm (Blois, 1958) [52]

2.3.2.5 Ph ng pháp phân tích hàm l ng astaxanthin trong ph li u tôm

HƠm l ng astaxanthin trong đ u tôm đ c phơn tích theo ph ng pháp c a Metusalach (1997) và Tolasa và c ng s (2005) [92],[120] M u c n phân tích (1g)

đ c cho vào ng đ ng hóa Dung môi ch a hexan và isopropanol v i t l 3:2 (v:v) (5 mL) đ c cho vào ng đ ng hóa cps ch a m u Quá trình đ ng hóa m u đ c th c

hi n trong 2 phút v i t c đ 15000 vòng/phút Sau khi đ ng hóa, m u đ c đ yên 30 phút D ch chi t thu đ c sau đó ti n hành l c qua gi y l c Whatman No.1 (quá trình nƠy đ c th c hi n 3 l n) đ c cho vào bình chi t có b sung thêm n c mu i sinh lý

v i t l 1:2 và l c nh , sau đó đ yên trong 10 phút nhi t đ phòng đ tách pha hoàn toàn Pha trên có ch a astaxanthin đ c r a b ng n c mu i sinh lý, sau đó lo i b hexan b ng cách cô quay chân không 40oC M u thu đ c đ c pha v i ete d u m

vƠ đ nh m c lên 10 ml đo đ h p th c a dung d ch b c sóng 468 nm (A468), dùng eter d u m làm dung d ch so sánh

HƠm l ng astaxanthin t ng s trong m u đ c tính theo công th c c a Saito

đ c s y 103 2oC trong 2 gi , làm ngu i trong bình hút m và cân kh i l ng

S y m u thêm 30 phút, làm ngu i vƠ cơn đ ki m tra kh i l ng không đ i

- Tính k t qu :

% 100 1

2 1 m

m m