khảo sát quy trình khuếch đại gen gdap1 liên quan đến bệnh lý thần kinh di truyền charcot marie tooth

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG KHẢO SÁT QUY TRÌNH KHUẾCH ĐẠI GEN GDAP1 LIÊN QUAN ĐẾN BỆNH LÝ THẦN KINH DI TRUYỀN CHARCOT - MARIE - TOOTH C ủn m ềt TS.BS.MAI PHƯ NG THẢO Tp Hồ C í M n , năm 2018 BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG KHẢO SÁT QUY TRÌNH KHUẾCH ĐẠI GEN GDAP1 LIÊN QUAN ĐẾN BỆNH LÝ THẦN KINH DI TRUYỀN CHARCOT - MARIE - TOOTH C ủn m ềt TS.BS.MAI PHƯ NG THAO THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - Năm 2018 DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI VÀ Đ N VI PHỐI HỢP CHÍNH Danh sách thành viên tham gia nghiên cứu: STT Họ v tên Mai Phƣơng Thảo Nguyễn Thị Phƣơng Thảo Lê Đông Trúc Đỗ Đức Minh Chuyên ngành Sinh lý học Dƣợc Y sinh học phân tử Y sinh học phân tử Nơi thực đề tài: Đại học Y Dƣợc TPHCM Cơ quan công tác ĐH Y Dƣợc TP.HCM ĐH Y Dƣợc TP.HCM ĐH Y Dƣợc TP.HCM ĐH Y Dƣợc TP.HCM MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƢƠNG TỔNG QUAN .1 1.1 BỆNH LÝ CHARCOT - MARIE - TOOTH .1 1.1.1 Nguyên nhân gây bệnh 1.1.2 Phân loại bệnh 1.1.3 Triệu chứng bệnh 1.1.4 Chẩn đoán bệnh 1.1.5 Phƣơng pháp điều trị 1.1.6 Tình hình nghiên cứu giới nƣớc 1.2 GDAP1 (GANGLIOSIDE - INDUCED DIFFERENTIATION - ASSOCIATED PROTEIN 1) 10 1.2.1 Vị trí cấu trúc gen 10 1.2.2 Chức protein Gdap1 11 1.2.3 Sự bất thƣờng gen GDAP1 liên quan đến bệnh lý CMT 11 1.3 CÁC KĨ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ 12 1.3.1 Kĩ thuật phân tách ADN từ máu ngoại vi phƣơng pháp định lƣợng ADN 12 1.3.2 Thiết kế mồi khuếch dại gen 13 1.3.3 Phản ứng khuếch đại gen 13 1.3.4 Kĩ thuật điện di 15 1.3.5 Kĩ thuật giải trình tự phƣơng pháp Sanger .16 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 PHÂN TÁCH ADN TỪ MÁU NGOẠI VI .17 2.1.1 Mẫu bệnh phẩm .17 2.1.2 Hóa chất dùng tách chiết ADN .17 2.1.3 Dụng cụ thí nghiệm dùng tách chiết ADN 17 2.1.4 Các bƣớc thực tách chiết ADN .18 2.2 THIẾT KẾ MỒI KHUẾCH ĐẠI GEN 19 2.2.1 Cách tiến hành thiết kế mồi 19 2.2.2 Kiểm tra trình tự mồi .19 2.3 PHƢƠNG PHÁP KHẢO SÁT TỐI ƢU HÓA ĐIỀU KIỆN PHẢN ỨNG PCR 20 2.3.1 Khảo sát nhiệt độ bắt cặp mồi 21 2.3.2 Khảo sát nồng độ mồi nồng độ ADN 22 2.3.3 Khảo sát số chu kỳ khuếch đại gen 22 2.4 KĨ THUẬT ĐIỆN DI TRÊN GEL AGAROSE 22 2.4.1 Thuốc thử dùng kĩ thuật điện di 22 2.4.2 Các dụng cụ thí nghiệm dùng kĩ thuật điện di .22 2.4.3 Quy trình điện di gel agarose 22 Phát sản phẩm PCR kĩ thuật điện di gel Agarose 2% Các bƣớc tiến hành nhƣ sau: .22 2.5 KĨ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ BẰNG PHƢƠNG PHÁP SANGER 23 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .24 3.1 KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT ADN 24 3.2 TRÌNH TỰ MỒI 24 3.3 KHẢO SÁT ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA MỒI 26 3.4 KHẢO SÁT SỐ CHU KỲ LUÂN NHIỆT 27 3.5 KHẢO SÁT NHIỆT ĐỘ GẮN MỒI 28 3.6 KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ ADN VÀ NỒNG ĐỘ MỒI 30 3.7 ĐÁNH GIÁ TÍNH ỔN ĐỊNH CỦA QUY TRÌNH KHUẾCH ĐẠI GEN 31 3.8 GIẢI TRÌNH TỰ KIỂM TRA KẾT QUẢ TRÌNH TỰ CỦA SẢN PHẨM PCR 31 CHƢƠNG KẾT LUẬN .36 4.1 TỐI ƢU HĨA QUY TRÌNH KHUẾCH ĐẠI GEN 36 4.2 KIỂM TRA SẢN PHẨM PCR 37 4.3 ỨNG DỤNG CỦA NGHIÊN CỨU 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT CHỮ VIẾT TẮT CHỮ NGUYÊN BLAST Ý NGHĨA Basic Local Alignment Search Cơng cụ tìm kiếm gắn Tool kết cục Trình tự mã hóa CDS Coding sequence CMT Charcot - Marie - Tooth dATP Deoxy adenine triphosphate dbSNP Single Nucleotide Cơ sở liệu đa hình đơn nucleotid Polymorphism Database dCTP Deoxy cytosine triphosphate dGTP Deoxy guanine triphosphate DI - CMT Dominant Intermediate - Charcot Marie Tooth thể Charcot - Marie - Tooth ADN Deoxyribonucleic acid 10 dNTP Deoxyribonucleotide trung gian triphosphate 11 dTTP Deoxy thymine triphosphate 12 EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid 13 EMG Electromyography 14 GDAP1 Ganglioside - differentiation - Điện ký induced Protein liên quan associated khác biệt cảm ứng protein Gangliosid Cơng nghệ ADN tích hợp 15 IDT Intergrated DNA Technologies 16 NCBI National Center for Biology Trung tâm quốc gia 17 PCR Information thông tin sinh học Polymerase chain reation Phản ứng chuỗi khuếch đại 18 ARN Ribonucleic acid 19 Taq Thermus aquaticus 20 UV Ultra Violet Cực tím DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại CMT Bảng 1.2 Phân loại CMT1 Bảng 1.3 Phân loại CMT2 Bảng 1.4 Phân loại DI - CMT Bảng 1.5 Phân loại CMT4 Bảng 1.6 Phân loại CMTX Bảng 1.7 Các đột biến GDAP1 11 Bảng 2.1 Thành phần kit GE tách chiết ADN 17 Bảng 2.2 Chu trình nhiệt đƣợc đề nghị sử dụng kit NEB #E5000S để khuếch đại đoạn ADN kb 20 Bảng 2.3 Chu trình nhiệt đƣợc sử dụng khảo sát khảo sát phản ứng khuếch đại gen GDAP1 20 Bảng 2.4 Các thành phần phản ứng PCR 20 Bảng 3.1 Thông tin đoạn mồi sử dụng nghiên cứu .24 Bảng 3.2 Các đặc tính mồi .25 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen GDAP1 26 Bảng 3.4 Chu trình luân nhiệt kiểm tra độ đặc hiệu cặp mồi khuếch đại gen GDAP1 26 Bảng 3.5 Chu trình luân nhiệt khảo sát số chu kỳ phản ứng khuếch đại exon gen GDAP1 .27 Bảng 3.6 Chu trình luân nhiệt khảo sát nhiệt độ gắn mồi 28 Bảng 4.1 Thành phần phản ứng PCR sau khảo sát 36 Bảng 4.2 Chu trình luân nhiệt tối ƣu 36 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Biến dạng bàn chân hình vịm (Pes cavus) Hình 1.2 Biến dạng ngón chân hình búa (Hammertoes) Hình 1.3 Biến dạng chân hình chai sâm panh lộn ngƣợc Hình 1.4 Hình ảnh thối hóa “củ hành” (onion bulb) Hình 1.5 Các thành phần tế bào thần kinh .10 Hình 1.6 Vị trí gen GDAP1 nhiễm sắc thể số 11 Hình 1.7 Các giai đoạn PCR 14 Hình 1.8 Kĩ thuật điện di 15 Hình 2.1 Các bƣớc tách chiết ADN sử dụng GE .18 Hình 3.1 Kết điện di sản phẩm khuếch đại gen GDAP1 kiểm tra độ đặc hiệu mồi 27 Hình 3.2 Kết điện di so sánh sản phẩm khuếch đại gen GDAP1 với số chu kỳ khuếch đại 30 28 Hình 3.3 Kết điện di so sánh sản phẩm khuếch đại gen GDAP1 với nhiệt độ gắn mồi 58 °C 29 Hình 3.4 Kết điện di so sánh sản phẩm khuếch đại gen GDAP1 với nồng độ ADN 70 ng/25µl 29 Hình 3.5 Kết điện di so sánh sản phẩm khuếch đại gen GDAP1 với nồng độ ADN 50 ng/25µl 30 Hình 3.6 Kết điện di so sánh sản phẩm khuếch đại gen GDAP1 với mẫu ADN ngƣời bệnh 31 Hình 3.7 Một đoạn kết giải trình tự exon gen GDAP1 bệnh nhân BN1 BN2 32 Hình 3.8 Một đoạn kết giải trình tự exon gen GDAP1 bệnh nhân BN1 BN2 32 Hình 3.9 Một đoạn kết giải trình tự exon gen GDAP1 bệnh nhân BN1 BN2 33 Hình 3.10 Một đoạn kết giải trình tự exon gen GDAP1 bệnh nhân BN1 BN2 .33 25 Bảng 3.2 Các đặc tính mồi Yếu tố kiểm tra Nhi t ộ Cấu trúc Cấu trúc Cấu trúc nóng chảy hairpin loop self-dimer heterodimer (Tm) (kcal/mol) (kcal/mol) (kcal/mol) 55,0 59,48 1,47 -9,27 21 57,1 60,20 0,02 -4,16 Primer 2F 20 60,00 60,67 -0,09 -3,61 Primer 2R 21 52,38 59,45 0,48 -8,53 Primer 3F 21 57,14 59,46 -0,98 -4,52 Primer 3R 23 52,17 60,74 -1,63 -5,99 Primer 4F 20 60,00 61,10 -0,43 -5,38 Primer 4R 21 47,62 59,32 -1,48 -14,86 Primer 5F 21 57,14 60,47 -0,87 -6,34 Primer 5R 23 47,83 59,20 0,45 -7,05 Primer 6F 20 55,00 58,21 0,21 -3,53 Primer 6R 20 55,00 59,26 0,23 -6,21 Kết Kích % t ước GC Primer 1F 20 Primer 1R kiểm tra -9,31 -6,14 -4,52 -8,52 -6,69 -11,71 Dựa vào kết khảo sát đặc tính mồi, chúng tơi nhận thấy:  Về mặt kích thƣớc, mồi đạt yêu cầu chiều dài tốt (20 - 25 bp)  Về thành phần % nucleotide GC, mồi có % GC nằm tỉ lệ tốt (45 - 60 %)  Về nhiệt độ nóng chảy Tm, mồi có Tm tốt khoảng 55 - 60 °C  Cấu trúc thứ cấp bao gồm cấu trúc kẹp tóc (hairpin loop), oligonucleotid tự bắt cặp với (self - dimer), bắt cặp hai oligonucleotid khác (heterodimer) Độ bền vững cấu trúc thứ cấp đƣợc đo số lƣợng tự (ΔG, kcal/mol) Theo Igem [21], ΔG cấu trúc kẹp tóc phải lớn kcal/mol ΔG cấu trúc dimer (self - dimer, heterodimer) phải lớn -15 kcal/mol Kết khảo sát phần mềm trực tuyến IDT Oligoanalyzer 3.1 cho thấy tất cấu trúc thứ cấp hệ primers có ΔG thỏa mãn điều kiện 26 3.3 KHẢO SÁT ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA MỒI Chúng tiến hành phản ứng khuếch đại exon gen GDAP1 điều kiện phản ứng nồng độ 50 ng/25µl, nồng độ mồi 0,2 µM, nhiệt độ gắn mồi 56 oC số chu kỳ nhiệt 30 nhằm kiểm tra hoạt động mồi Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen GDAP1 T n p ần T ể tíc (µl) Nồng ộ 2,5 1X 0,2 mM Primer F 10 µM 0,5 0,2 µM Primer R 10 µM 0,5 0,2 µM ADN 1,54 50 ng/25µl Taq ADN Polymerase 0,1 Buffer 10X Mix dNTP 2,5 mM Vừa đủ 25 H2O Bảng 3.4 Chu trình luân nhiệt kiểm tra độ đặc hiệu cặp mồi khuếch đại gen GDAP1 Ga oạn N t ộ (°C) T g an Số c u kỳ Biến tính ban đầu 95 phút Biến tính 95 30 giây Gắn mồi 56 30 giây Kéo dài 68 55 giây Kéo dài sau 68 phút Giữ lạnh ∞ 1 30 Kết điện di sản phẩm khuếch đại gen GDAP1 kiểm tra độ đặc hiệu mồi đƣợc trình bày hình 3.1 27 M 1000 700 500 Hình 3.1 Kết điện di sản phẩm khuếch đại gen GDAP1 kiểm tra độ đặc hiệu mồi (M: thang ADN 1kb, giếng 1-6 tương ứng với sản phẩm khuếch đại exon từ 1-6) N ận xét Các cặp mồi 2F/2R, 3F/3R, 4F/4R, 6F1/6R1 khuếch đại gen mục tiêu cho sản phẩm PCR mong muốn với băng có kích thƣớc so với thang chuẩn Tuy nhiên vạch sản phẩm khuếch đại exon tín hiệu mờ, xuất sản phẩm phụ exon không thu đƣợc sản phẩm khuếch đại exon exon 3.4 KHẢO SÁT SỐ CHU KỲ LUÂN NHIỆT Do không thu đƣợc sản phẩm mục tiêu sử dụng cặp mồi khuếch đại exon exon điều kiện phản ứng kiểm tra độ đặc hiệu mồi, tiến hành so sánh phản ứng khuếch đại exon gen GDAP1 với số chu kỳ 30 40 Bảng 3.5 Chu trình luân nhiệt khảo sát số chu kỳ phản ứng khuếch đại exon gen GDAP1 Ga oạn N t ộ (°C) T g an Số c u kỳ Biến tính ban đầu 95 phút Biến tính 95 30 giây Gắn mồi 56 30 giây Kéo dài 68 55 giây Kéo dài sau 68 phút Giữ lạnh ∞ 1 30 oặc 40 Kết điện di khảo sát số chu kỳ luân nhiệt đƣợc trình bày hình 3.2 28 M M 10 11 12 1000 700 500 1000 700 500 Hình 3.2 Kết điện di so sánh sản phẩm khuếch đại gen GDAP1 với số chu kỳ khuếch đại 30 (giếng - 6, tương ứng exon - 6) 40 (giếng - 12, tương ứng exon - 6) (M: thang AND kb) N ận xét Khi tăng số chu kỳ khuếch đại 40, sản phẩm khuếch đại exon thu đƣợc băng có kích thƣớc so với thang chuẩn nhiều Tuy nhiên có xuất sản phẩm phụ khuếch đại exon exon (giếng giếng 12) 3.5 KHẢO SÁT NHIỆT ĐỘ GẮN MỒI Nhằm loại bỏ sản phẩm phụ không đặc hiệu, khảo sát nhiệt độ gắn mồi khác nhau, so sánh phản ứng khuếch đại exon gen GDAP1 với nhiệt độ gắn mồi cao 58 60 oC với nồng độ ADN 70 ng/25µl, nồng độ mồi 0,3 µM số chu kỳ nhiệt 40 Bảng 3.6 Chu trình luân nhiệt khảo sát nhiệt độ gắn mồi Ga oạn N t ộ (°C) T g an Số c u kỳ Biến tính ban đầu 95 phút Biến tính 95 30 giây Gắn mồi 58 oặc 60 30 giây Kéo dài 68 55 giây Kéo dài sau 68 phút Giữ lạnh ∞ 1 40 Kết điện di khảo sát nhiệt độ gắn mồi đƣợc trình bày hình 3.3 29 M M 10 11 12 1000 700 500 1000 700 500 Hình 3.3 Kết điện di so sánh sản phẩm khuếch đại gen GDAP1 với nhiệt độ gắn mồi 58 °C (giếng - 6, tương ứng exon - 6) 60 °C (giếng - 12, tương ứng exon - 6) (M: thang ADN kb) N ận xét - Ở nhiệt độ 58oC, sản phẩm khuếch đại exon đặc hiệu, cho băng có kích thƣớc so với thang chuẩn khơng có sản phẩm phụ Tuy nhiên sản phẩm khuếch đại exon (giếng 6) cho tín hiệu mờ - Ở nhiệt độ 60 oC, sản phẩm khuếch đại exon cho vạch tín hiệu rõ, với kích thƣớc so với thang chuẩn khơng xuất sản phẩm phụ Để xác định nhiệt độ gắn mồi tối ƣu 60 oC, không xuất sản phẩm phụ, tiến hành tăng nồng độ ADN lên 90 ng/25µl, nồng độ mồi tƣơng ứng 0,4 µM điện điều kiện để so sánh Kết điện cho thấy nồng độ 90 ng/25µl khơng xuất vạch sản phẩm phụ (Hình 3.4) M 1000 700 500 M 10 11 12 1000 700 500 Hình 3.4 Kết điện di so sánh sản phẩm khuếch đại gen GDAP1 với nồng độ ADN 70 ng/25µl (giếng - 6, tương ứng exon - 6) 90 ng/25µl (giếng - 12, tương ứng exon - 6) (M: thang ADN kb) 30 N ận xét Kết khảo sát nhiệt độ gắn mồi cho thấy nhiệt độ gắn mồi 60oC tối ƣu 58 oC 3.6 KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ ADN VÀ NỒNG ĐỘ MỒI Nhằm mục đích giảm lƣợng ADN sử dụng thí nghiệm, chúng tơi tiến hành so sánh phản ứng khuếch đại exon gen GDAP1 với nồng độ 50 70 ng/25µl, tƣơng ứng với nồng độ mồi lần lƣợt 0,2 0,3 µM điều kiện nhiệt độ gắn mồi 60 o C số chu kỳ nhiệt 40 Kết điện di khảo sát nồng độ ADN nồng độ mồi đƣợc trình bày hình 3.5 M M 10 11 12 1000 700 500 1000 700 500 Hình 3.5 Kết điện di so sánh sản phẩm khuếch đại gen GDAP1 với nồng độ ADN 50 ng/25µl (giếng - 6, tương ứng exon - 6) 70 ng/25µl (giếng - 12, tương ứng exon - 6) (M: thang ADN kb) N ận xét Kết điện cho thấy nồng độ 70 ng/25µl với nồng độ mồi tƣơng ứng cho sản phẩm khuếch đại đặc hiệu tín hiệu tối ƣu (Hình 3.5) Kết luận Dựa vào việc khảo sát số chu kỳ, nồng độ ADN, nồng mồi nhiệt độ gắn mồi, khảo sát phản ứng khuếch đại gen GDAP1 nhƣ sau:  Nồng độ ADN 70 ng/25µl  Nồng độ mồi 0,3 µM  Nhiệt độ gắn mồi 60oC  Số chu kỳ nhiệt 40 31 3.7 ĐÁNH GIÁ TÍNH ỔN ĐỊNH CỦA QUY TRÌNH KHUẾCH ĐẠI GEN Để đánh giá tính ổn định quy trình sau khảo sát, tiến hành phản ứng khuếch đại exon gen GDAP1 hai mẫu ADN bệnh nhân đƣợc chẩn đốn có bệnh lý thần kinh ngoại biên di truyền (kí hiệu: BN1 BN2) M 1000 700 500 M 10 11 12 1000 700 500 Hình 3.6 Kết điện di so sánh sản phẩm khuếch đại gen GDAP1 với mẫu ADN ngƣời bệnh (giếng - 6: tương ứng exon - BN1, giếng - 12: tương ứng exon - BN2) (M: thang ADN kb) N ận xét Kết điện sản phẩm khuếch đại gen GDAP1 hai mẫu ADN bệnh nhân cho sản phẩm khuếch đại đặc hiệu 3.8 GIẢI TRÌNH TỰ KIỂM TRA KẾT QUẢ TRÌNH TỰ CỦA SẢN PHẨM PCR Để chứng minh tính đặc hiệu sản phẩm PCR, chúng tơi tiến hành giải trình tự mẫu ADN bệnh nhân (BN1 BN2) phƣơng pháp Sanger so sánh với trình tự đƣợc cơng bố NCBI Kết giải trình tự gen bệnh nhân BN1 BN2 đƣợc phân tích phần mềm CLC Main Workbench 7.6.2 đƣợc trình bày hình 3.7, 3.8, 3.9, 3.10, 3.11 3.12 32 Hình 3.7 Một đoạn kết giải trình tự exon gen GDAP1 bệnh nhân BN1 BN2 (BN1: bệnh nhân có bệnh lý thần kinh ngoại biên, BN2: bệnh nhân chẩn đoán bệnh lý CMT) N ận xét Kết giải trình tự cho thấy phản ứng PCR khuếch đại trình tự exon gen GDAP1 bệnh nhân BN1 BN2 Hình 3.8 Một đoạn kết giải trình tự exon gen GDAP1 bệnh nhân BN1 BN2 N ận xét Kết giải trình tự cho thấy phản ứng PCR khuếch đại trình tự exon gen GDAP1 bệnh nhân BN1 BN2 33 Hình 3.9 Một đoạn kết giải trình tự exon gen GDAP1 bệnh nhân BN1 BN2 N ận xét Kết giải trình tự cho thấy phản ứng PCR khuếch đại trình tự exon gen GDAP1 bệnh nhân BN1 BN2 Hình 3.10 Một đoạn kết giải trình tự exon gen GDAP1 bệnh nhân BN1 BN2 N ận xét Kết giải trình tự cho thấy phản ứng PCR khuếch đại trình tự exon gen GDAP1 bệnh nhân BN1 BN2 Ở bệnh nhân BN2 phát đột biến đồng hợp tử thay nucleotid c.507T>G vùng mã hóa 34 Hình 3.11 Một đoạn kết giải trình tự exon gen GDAP1 bệnh nhân BN1 BN2 (Mẫu chứng: người bình thường) N ận xét Kết giải trình tự cho thấy phản ứng PCR khuếch đại trình tự exon gen GDAP1 bệnh nhân BN1 BN2 Ở bệnh nhân BN2 phát đột biến lặp đoạn nucleotid c.671 - 672dupTTGCA vùng mã hóa Hình 3.12 Một đoạn kết giải trình tự exon gen GDAP1 bệnh nhân BN1 BN2 N ận xét Kết giải trình tự cho thấy phản ứng PCR khuếch đại trình tự exon gen GDAP1 bệnh nhân BN1 BN2 35 N ận xét c ung Kết trình tự gen exon phù hợp với trình tự gen GDAP1 Điều chứng tỏ cặp mồi nhƣ quy trình chúng tơi thiết kế khuếch đại đặc hiệu trình tự gen GDAP1 36 CHƯ NG KẾT LUẬN 4.1 TỐI ƯU HĨA QUY TRÌNH KHUẾCH ĐẠI GEN Chúng tơi thiết kế khảo sát thành cơng quy trình khuếch đại gen GDAP1 liên quan đến bệnh lý thần kinh di truyền CMT: - Bộ mồi khuếch đại exon hoạt động hiệu đặc hiệu - Thành phần phản ứng PCR đƣợc trình bày bảng 4.1 Bảng 4.1 Thành phần phản ứng PCR sau khảo sát T n p ần p ản ứng Nồng ộ gADN 70 ng/25µl PCR buffer 1X dNTP mix 0,2 mM dNTP Mồi xi 0,3 µM Mồi ngƣợc 0,3 µM Taq ADN Polymerase 1,25 U/50 μL PCR H2O Vừa đủ - Chu trình luân nhiệt đƣợc trình bày bảng 4.2 Bảng 4.2 Chu trình luân nhiệt tối ƣu Ga oạn N t ộ (°C) T g an Số c u kỳ Biến tính ban đầu 95 phút Biến tính 95 30 giây Gắn mồi 60 30 giây Kéo dài 68 55 giây Kéo dài sau 68 phút Giữ lạnh ∞ 1 40 - Ứng dụng quy trình chứng âm (mẫu ADN bệnh nhân BN1) chứng dƣơng (mẫu ADN bệnh nhân BN2) cho kết tốt Từ cho thấy quy trình khuếch đại gen GDAP1 chúng tơi có khả ứng dụng việc chẩn đốn bệnh lý thần kinh di truyền CMT xét nghiệm di truyền phân tử 37 4.2 KIỂM TRA SẢN PHẨM PCR Các sản phẩm PCR sau tinh đƣợc tiến hành giải trình tự chuỗi ADN theo kỹ thuật Sanger hệ thống ABI 3130 Genetic Analyzer cho kết trình tự chuỗi phù hợp với trình tự gen GDAP1, chứng tỏ cặp mồi chúng tơi thiết kế khuếch đại đặc hiệu trình tự gen GDAP1 4.3 ỨNG DỤNG CỦA NGHIÊN CỨU Quy trình khuếch đại gen GDAP1 đƣợc ứng dụng việc chẩn đoán bệnh lý thần kinh di truyền CMT kỹ thuật sinh học phân tử, giúp cho chẩn đoán sớm xác bệnh Các bƣớc tiến hành chẩn đốn bệnh lý CMT đƣợc trình bày hình 4.1 • Thu thập mẫu máu bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh lý CMT • Phân tách DNA từ máu ngoại vi • Phản ứng PCR khuếch đại exon gen GDAP1 • Tinh sản phẩm PCR • Giải trình tự gen so sánh với ngân hàng Gen • Xác định đột biến gen GDAP1 Hình 4.1 Các bƣớc tiến hành chẩn đoán bệnh lý CMT 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO T ếng V t Bùi Chí Bửu, "Phƣơng pháp nhân PCR", Lê Minh (2003), "Bệnh Charcot - Marie - Tooth bệnh thần kinh ngoại biên di truyền có liên quan", tạp chí Y học TPHCM (7), - Mai Văn Trọng, "Kĩ thuật điện di", - Nguyễn Văn Thanh (2012), Sinh học phân tử, Nhà xuất giáo dục, Hà Nội, 198 Liệu pháp tế bào gốc, "Tái sinh sợi trục tế bào gốc thần kinh", http://lieuphaptebaogoc.com/tai-sinh-soi-truc-cua-te-bao-goc-than-kinh, 20/04/2016 Viện vệ sinh dịch tễ trung ƣơng, "Qui trình PCR phát gen kháng kháng sinh", http://niheold.nihe.org.vn/new-vn/thuong-quy-va-huong-dan-ky- thuat/938/Qui-trinh-PCR-phat-hien-gen-khang-khang-sinh.vhtm, 25/04/2016 Lê Đông Trúc (2016), luận văn thạc sĩ “Khảo sát số đột biến gen gây bệnh gia đình đƣợc chẩn đốn bệnh Charcot-Marie-Tooth loại 2” T ếng An Better Health Channel, "Charcot - Marie - Tooth disease (CMT)", 1-3 Christian Veillette, "Charcot - Marie - Tooth Disease", 9-10 10 GE Healthcare, "Illustra blood genomicPrep Mini Spin Kit", - 18 11 Genetics Home Reference, "Charcot - Marie - Tooth disease", 12 Genetics Home Reference, "GDAP1", 1-2 13 Pareyson & Marchesi (2009), "Diagnosis, natural history, and management of Charcot–Marie–Tooth disease", 664 14 Pezzini et al (2015), "GDAP1 mutations in Italian axonal Charcot–Marie– Tooth patients: Phenotypic features and clinical course", 28-30 15 Premiere Biosoft, "PCR Primer Design Guidelines", 16 New england Biolabs Inc., "Polymerase and Amplification - Taq PCR Kit", 39 17 Saporta et al (2011), "Charcot - Marie - Tooth disease subtypes and genetic testing strategies", 3-4 18 Shiang - Yao Hsieh, Hung - Chou Kuo, Chun - Che Chu, Kon - Ping Lin, Chin Chang Huang, "Charcot - Marie - Tooth Disease Type 1A: A Clinical, Electrophysiological, Pathological, and Genetic Study", 303 19 Thomas D Bird, "Charcot - Marie - Tooth Hereditary Neuropathy Overview", http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1358/, 03/05/2016 20 Thomas D Bird, "Charcot - Marie - Tooth Neuropathy Type 1", http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1205/, 04/05/2016 21 Genomikon, "Primer design", http://2010.igem.org/Team:Alberta/Notebook/protocols/primer_design, 07/05/2016 22 Laser, Aesthetic, Medical and Surgical Footcare, "Hammertoes", http://healthyfeetny.net/conditions-treated/hammertoes/, 04/05/2016 23 Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), "Ganglioside - induced differentiation - associated protein 1; GDAP1", http://www.omim.org/entry/606598, 08/05/2016 24 Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), "Hypertrophic neuropathy of Dejerine - Sottar", http://www.omim.org/entry/145900, 09/05/2016 25 Promega, "How I determine the concentration, yield and purity of a DNA sample?", https://worldwide.promega.com/resources/pubhub/enotes/how-do-i- determine-the-concentration-yield-and-purity-of-a-dna-sample/, 04/05/2016 ... thực với mục đích khảo sát quy trình khuếch đại gen GDAP1 liên quan đến bệnh lý thần kinh di truyền CMT Mục t tổng quát: Khảo sát điều kiện phản ứng khuếch đại toàn exon gen GDAP1 Mục t cụ t ể:... TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG KHẢO SÁT QUY TRÌNH KHUẾCH ĐẠI GEN GDAP1 LIÊN QUAN ĐẾN BỆNH LÝ THẦN KINH DI TRUYỀN CHARCOT - MARIE - TOOTH. .. nhƣ quy trình chúng tơi thiết kế khuếch đại đặc hiệu trình tự gen GDAP1 1 CHƯ NG TỔNG QUAN 1.1 BỆNH LÝ CHARCOT - MARIE - TOOTH Bệnh Charcot - Marie - Tooth (CMT) tên gọi nhóm bệnh lý rối loạn thần