Khảo sát quy trình chiết tách và hoạt tính sinh học của curcumin từ cây nghệ vàng curcuma longa l

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN HỮU ANH TUẤN KHẢO SÁT QUY TRÌNH CHIẾT TÁCH VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CURCUMIN TỪ CÂY NGHỆ VÀNG CURCUMA LONGA L CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ HĨA HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng 12 năm 2007 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH Cán hướng dẫn khoa học: PGS TS TRẦN THỊ VIỆT HOA TS PHAN THANH SƠN NAM Cán chấm nhận xét 1: GS TSKH NGUYỄN CÔNG HÀO Cán chấm nhận xét 2: TS NGUYỄN HỮU LƯƠNG Luận văn bảo vệ HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ, TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày tháng 01 năm 2008 Lời cảm ơn Đầu tiên, cho xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TRẦN THỊ VIỆT HOA tận tình hướng dẫn tơi q trình thực nhiệm vụ luận văn, cảm ơn học công việc sống cô dạy Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy PHAN THANH SƠN NAM hướng dẫn g iúp đỡ thời gian qua Tôi xin chân thành cảm ơn thầy khoa Cơng nghệ Hóa học, mơn Hóa hữu cơ, Phan Thị Hồng Anh, chị Phan Thị Thanh Bình giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận văn Cảm ơn thầy cho kiến thức Cảm ơn thầy Huỳnh Khánh Duy Cảm ơn bạn bè, LTNH, anh khóa 1999, em khóa 2002, khóa 2003, đồng nghiệp Bộ mơn Cơng nghệ Hóa học – Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh người sẻ chia với thời gian thực luận văn Và cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, ba mẹ, em dành cho con/cho anh điều tốt đẹp NGUYỄN HỮU ANH TUẤN TÓM TẮT Nghệ vàng (Curcuma Longa L.) nguồn cung cấp curcumin tinh dầu nghệ, thành phần có giá trị sử dụng cao công nghệ sản xuất dược phẩm, thực phẩm mỹ phẩm Trong luận văn này, cải tiến quy trình tách curcumin tinh dầu từ củ nghệ vàng Curcuma Longa L trồng Bình Dương cách kết hợp q trình trích ly curcumin với q trình tách tinh dầu khơng sử dụng dung môi hữu để tách loại chất béo quy trình trích ly curcumin cơng bố trước Hiệu suất thu hồi curcumin đạt khoảng 95% với độ tinh khiết 96%, xác định phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) hiệu suất thu hồi tinh dầu đạt 1.2% Thành phần tinh dầu nghệ vàng Bình Dương thu arturmerone (52.05%), curlone (16.69%) Curcumin (EC50 = 16.3 μM) tinh dầu nghệ vàng (EC50 = 50.5 μM) có hoạt tính kháng oxy hố tốt trolox (EC50 = 258.2 μM) Curcumin có tác dụng với vi khuẩn Bacillus subtilus, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu 0.05mg/ml; 0,10mg/ml 1.00mg/ml Kết khảo sát q trình trích ly có hỗ trợ vi sóng cho thấy thời gian trích ly ngắn (6 lần) so với phương pháp trích ly thường Tuy nhiên độ tinh khiết sản phẩm thấp Phương pháp hỗ trợ vi sóng phù hợp để sản xuất dạng curcumin công nghiệp sử dụng cho mục đích khơng địi hỏi độ tinh khiết cao dược phẩm ABSTRACT Curcuma Longa L has exhibited as an excellent source of curcumin and essential oils, having wide scale applications in pharmaceutical, food and cosmetic industry In this thesis, improvements on separation processes of curcumin and essential oils from Curcuma Longa L cultivated in Binh Duong have been made, combining the curcumin extraction and steam distillation of essential oils, without the extraction of fatty components using any nonpolar organic solvent Recovered curcumin yield was over 95% with the purity of over 96% (HPLC), while over 1.2% of essential oil were achieved Main components of the essential oils were ar-turmerone (52.05%) and curlone (16.69%) It was observed that the curcumin (EC50 = 16.3 μM) and the essential oils (EC50 = 50.7 μM) exhibited better antioxidant activity than trolox (EC50 = 258.2 μM) It was also found that the curcumin had antibacterial activity against Bacillus subtilus, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi at the MIC of 0.05 mg/l; 0.1 mg/l and mg/l respectively Microwave assisted extraction technique was also investigated for rapid extraction of curcuminoids from the above material (pulverized Curcuma longa L rhizomes which was steam distillate for essential oils) Extraction was carried out by ethanol – water solvent system, simultineously irradiation in a domestic microwave oven Whirpool (Power max 850 watts, frequency 2450 MHz) Recovered curcuminoid yield was 94.39% with the purity of 86.74% However, the extraction time was shorter six times than conventional methods Mục lục MỤC LỤC MỤC LỤC I DANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG VÀ ĐỒ THỊ V DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT IX CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Cây nghệ 1.1.1 Đặc điểm thực vật 1.1.2 Phân bố sinh thái 1.1.3 Trồng trọt thu hoạch 1.1.4 Thành phần thân rễ nghệ 1.2 Tinh dầu nghệ 1.3 Curcuminoid 1.3.1 Cấu trúc hóa học hợp chất curcuminoid nghệ 11 1.3.2 Tính chất vật lý .15 1.3.3 Tính chất hóa học 18 1.3.4 Phương pháp xác định curcuminoid .24 1.3.5 Khả phân tách đồng phân curcuminoid 26 1.4 Dược tính curcuminoid 27 1.5 Phương pháp trích ly curcuminoid từ nghệ 38 i Mục lục 1.6 Một số cơng trình nghiên cứu nước nghệ vàng Curcuma longa L .46 CHƯƠNG 47 THỰC NGHIỆM 47 2.1 Mục đích nội dung nghiên cứu 47 2.2 Tiến trình thực nghiệm .48 2.3 Khảo sát nguyên liệu 48 2.3.1 Chuẩn bị nguyên liệu .48 2.3.2 Xác định độ ẩm nguyên liệu .48 2.3.3 Phân tích sơ hóa thực vật nguyên liệu củ nghệ 49 2.3.4 Xác định hàm lượng curcuminoid bột nghệ 49 2.4 Khảo sát hàm lượng, thành phần tính chất hóa lý tinh dầu 50 2.4.1 Xác định tính chất hóa lý tinh dầu 51 2.4.2 Xác định thành phần tinh dầu nghệ .55 2.5 Khảo sát q trình trích ly curcuminoid từ ngun liệu củ nghệ .56 2.5.1 Khảo sát phương pháp trích ly curcuminoid 56 2.5.2 Khảo sát sơ lựa chọn quy trình tách curcuminoid từ nghệ tươi 57 2.5.3 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến q trình trích ly curcuminoid theo quy trình (trong thiết bị Soxhlet) 60 2.5.4 Khảo sát quy trình trích ly curcuminoid từ củ nghệ với hỗ trợ vi sóng61 2.6 Định tính, định lượng curcuminoid 63 2.7 Khảo sát hoạt tính sinh học sản phẩm curcuminoid tinh dầu nghệ 65 ii Mục lục 2.7.1 Hoạt tính kháng oxy hóa curcuminoid tinh dầu 65 2.7.2 Hoạt tính kháng khuẩn sản phẩm curcuminoid 66 CHƯƠNG 68 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 68 3.1 Khảo sát nguyên liệu 68 3.1.1 Phân tích sơ hóa thực vật bột nghệ 69 3.1.2 Hàm lượng curcuminoid tổng bột nghệ vàng Bình Dương 70 3.2 Tinh dầu nghệ .71 3.2.1 Kết tách tinh dầu 71 3.2.2 Thành phần tính chất tinh dầu 72 3.3 Khảo sát q trình trích ly curcuminoid từ củ nghệ .74 3.3.1 Xử lý nguyên liệu 74 3.3.2 Khảo sát phương pháp trích ly curcuminoid .75 3.3.3 Khảo sát sơ lựa chọn quy trình tách curcuminoid 76 3.3.4 Kết khảo sát điều kiện trích ly curcuminoid (trong thiết bị Soxhlet) 78 3.3.4.1 Khảo sát nồng độ hệ dung mơi trích ly ethanol – nước .78 3.3.4.2 Khảo sát tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 80 3.3.4.3 Khảo sát thời gian trích ly 83 3.3.5 Kết khảo sát điều kiện trích ly curcuminoid điều kiện vi sóng (Phương pháp trích ly trực tiếp) 85 a Khảo sát nồng độ ethanol hệ dung môi ethanol – nước 85 b Khảo sát tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 88 iii Mục lục c Khảo sát thời gian trích .90 3.4 Kết định tính định lượng curcuminoid .92 3.4.1 Kết đo điểm chảy 92 3.4.2 Kết TLC 93 3.4.3 Kết định lượng UV – Vis 94 3.4.4 Kết HPLC, LC – MS 95 3.5 Kết khảo sát hoạt tính sinh học tinh dầu curcuminoid .96 3.5.1 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá tinh dầu curcuminoid 96 3.5.2 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn curcuminoid 99 CHƯƠNG 101 KẾT LUẬN 101 TÀI LIỆU TRÍCH DẪN .104 CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ ĐƯỢC CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 111 PHỤ LỤC .112 iv Tài liệu trích dẫn [47] Nguyễn Minh Chính, Phạm Văn Vượng, Nguyễn Hữu Long, Tách chiết nghiên cứu số thơng số hóa lý curcumin từ củ nghệ vàng Curcuma longa L., Tạp chí y dược học quân sự, 28, 5-9, 2003 [48] Gianni Sacchetti, Silvia Maietti, Mariavittoria Muzzoli, Martina Scaglianti, Stefano Manfredini, Matteo Radice and Renato Bruni, Comparative evaluation of 11 essential oils of different origin as functional antioxidants, antiradicals and antimicrobials in foods, Food Chemistry, 91, 621-632, 2005 [49] Gurdip Singh, Om Prakash Singh and Sumitra Maurya, Chemical and biocidal investigations on essential oils of some Indian Curcuma species, Progress in Crystal Growth and Characterization of Materials, 45, 75-81, 2002 [50] Bharat B Aggarwal, Chitra Sundaram, Nikita Malani, Haruyo Ichikawa, Curcumin: the indian solid gold, SVNY332-Aggarwal, 2006 [51] Bharat B Aggarwal, Anushree Kumar, Manoj S Aggarwal, Shishir Shishodia, Curcumin derived from turmeric (Curcuma longa): a Spice for All Seasons, CRC Press LLC, 2005 [52] Wanida Chearwae, Pornngarm Limtrakul, Curcuminoids purified from turmeric powder modulate the function of human multidrug resistance protein (ABCC1), Cancer Chemother Pharmacol, 57: 376–388, 2006 [53] Negi PS, Sakariak KK., Antibacterial activity of turmeric oil: a byproduct from curcumin manufacture, PMID: 10552805 [PubMed – indexed for MEDLINE] [54] Javaprakasha GK, Negi PS, Sakariah KK., Chemical composition of turmeric oil – a byproduct from turmeric industry and its inhibitory activity against different fungi, PMID: 11302211 [PubMed – indexed for MEDLINE] Tài liệu trích dẫn [55] Sun, You-Min, Wang, Ruo-Xi, Yuan, Shi-Ling, Theoretical study on the antioxidanta activity of curcumin, Chinese Journal of Chemistry, Vol 22, 827-830, 2004 [56] Wanida Chearwae, Chung-Pu Wu, H -Y Chu, T Randall Lee, Suresh V Ambudkar and Pornngarm Limtrakul, Curcuminoids purified from turmeric powder modulate the function of human multidrug resistance protein (ABCC1), Cancer Chemother Pharmacol, Vol 57, 376–388, 2006 Phụ lục CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ ĐƯỢC CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Nguyen Huu Anh Tuan, Ngo Nguyen Anh Vy, Phan Thi Hoang Anh, Phan Thanh Son Nam, Tran Thi Viet Hoa, Improvements of separation processes of curcumin and essential oil from Curcuma longa L – Investigation of their biological activity, Proceeding of The 10th science and technology conference, 2007 Phụ lục PHỤ LỤC 1.1 Tính tốn kết 1.1.1 Tính tốn kết Số liệu thu từ nghiệm thức phân tích ANOVA phần mềm Statgraphic 7.0 Sai số chuẩn SE (Standard error) kết thu được thể đồ thị 1.2 Số liệu nghiệm thức Bảng 1: Ảnh hưởng nồng độ ethanol hệ dung môi điều kiện thường CEtOH 95 90 80 70 60 TN mthô (g) mcur (g) 2 2 0.99 0.98 0.98 0.96 1.03 0.99 1.00 0.97 1.01 0.98 0.94 0.95 0.94 0.92 0.97 0.94 0.93 0.90 0.93 0.89 Ccur (%) 95.28 97.14 95.37 96.00 94.55 94.34 92.52 92.31 91.67 90.48 96.21 95.69 94.45 92.42 91.08 H (%) 93.52 94.44 92.72 91.56 96.30 92.59 91.66 88.89 91.67 87.97 93.98 92.14 94.45 90.28 89.82 Phụ lục Bảng 2: Ảnh hưởng tỉ lệ R/L điều kiện trích ly thường R/L 1/12 1/14 1/16 1/18 1/20 TN 2 2 mthô (g) mcur (g) 0.59 0.60 0.99 0.98 0.99 1.00 0.76 0.82 0.77 0.80 0.56 0.57 0.94 0.95 0.95 0.97 0.73 0.79 0.74 0.77 Ccur (%) 94.12 95.00 95.28 97.14 96.12 96.64 96.05 96.34 96.10 96.25 H (%) 94.56 96.21 96.38 96.20 96.18 54.98 56.44 93.52 94.44 94.22 95.68 72.28 78.22 73.27 76.24 55.71 93.98 94.95 75.25 74.75 Bảng 3: Ảnh hưởng thời gian trích ly điều kiện trích ly thường Thời gian (giờ) TN mthô (g) mcur (g) 2 2 0.80 0.82 0.89 0.92 0.99 1.00 0.98 0.99 0.89 0.92 0.74 0.76 0.85 0.88 0.95 0.97 0.94 0.96 0.86 0.88 Ccur (%) 92.54 92.68 95.51 95.65 96.12 96.64 95.92 96.67 96.63 95.65 92.61 95.58 96.38 96.30 96.14 H (%) 73.30 75.25 84.16 87.13 94.22 95.68 93.07 94.76 85.15 87.13 74.27 85.64 94.95 93.91 86.14 Phụ lục Bảng 4: Ảnh hưởng nồng độ ethanol điều kiện vi sóng Nồng độ ethanol 75 80 85 90 95 Mẫu mthô (g) VS-DM11 VS-DM12 VS-DM21 VS-DM22 VS-DM31 VS-DM32 VS-DM41 VS-DM42 VS-DM51 VS-DM52 0.38 0.39 0.40 0.41 0.45 0.46 0.42 0.43 0.47 0.46 mcur.(g) 0.33 0.34 0.36 0.37 0.41 0.42 0.39 0.40 0.44 0.44 0.34 0.37 0.42 0.39 0.44 Ccur (%) 88.19 88.69 90.89 91.46 92.08 92.13 93.54 92.58 93.37 95.40 88.44 91.17 92.11 93.06 94.39 H (%) 65.91 68.08 71.61 73.90 81.84 83.75 77.47 78.55 86.76 86.72 67.00 72.75 82.79 78.01 86.74 Bảng 5: Ảnh hưởng tỉ lệ R/L điều kiện vi sóng Tỉ lệ R/L 1/7 1/9 1/11 1/13 1/15 Mẫu mthô (g) VS-RL11 VS-RL12 VS-RL21 VS-RL22 VS-RL31 VS-RL32 VS-RL41 VS-RL42 VS-RL51 VS-RL52 0.32 0.31 0.40 0.41 0.46 0.45 0.47 0.45 0.46 0.46 mcur (g) 0.29 0.28 0.37 0.38 0.43 0.43 0.43 0.42 0.42 0.42 0.29 0.37 0.43 0.43 0.42 Ccur (%) 91.01 91.23 92.25 91.74 93.37 95.40 92.42 92.58 91.63 91.85 91.12 91.99 94.39 92.50 91.74 H (%) 58.83 57.13 74.53 75.98 86.76 86.72 87.74 84.16 85.14 85.35 57.98 75.26 86.74 85.95 85.24 Phụ lục Bảng 6: Ảnh hưởng thời gian điều kiện vi sóng TG 20 25 30 35 40 Mẫu VS-TG11 VS-TG12 VS-TG21 VS-TG22 VS-TG31 VS-TG32 VS-TG41 VS-TG42 VS-TG51 VS-TG52 mthô (g) 0.35 0.34 0.38 0.37 0.47 0.45 0.46 0.46 0.47 0.47 mcur (g) 0.32 0.32 0.32 0.35 0.35 0.35 0.44 0.43 0.43 0.43 0.42 0.42 0.43 0.43 0.43 Ccur (%) 92.30 92.73 93.15 92.25 92.78 93.32 93.37 94.39 95.40 92.42 92.02 91.63 91.63 91.26 90.89 H (%) 65.26 63.97 70.81 69.75 86.76 86.72 85.87 85.14 86.99 86.29 64.62 70.28 86.74 85.51 86.64 Bảng 7: Kết khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa curcuminoid (DPPH test) Mẫu Chứng Trolox Curcuminoid Nồng độ (μM) 0.00 62.50 93.75 125.00 187.50 250.00 1.00 2.00 8.00 16.00 32.00 64.00 OD 1.335 1.162 1.075 0.979 0.875 0.675 1.137 1.056 0.950 0.674 0.323 0.127 HTCO% 12.96 19.48 26.67 34.46 49.44 14.83 20.90 28.84 49.51 75.80 90.49 Bảng 8: Hoạt tính kháng oxy hóa tinh dầu nghệ (DPPH test) Mẫu Chứng Tinh dầu Nồng độ (μM) 10 20 80 120 200 OD 1.335 0.992 0.843 0.502 0.362 0.255 HTCO% 25.69 36.85 62.40 72.88 80.90 Phụ lục Bảng 9: Hoạt tính kháng oxy hóa curcuminoid (MDA test) Mẫu Chứng Trolox Curcuminoid Nồng độ (μM) 0.00 12.50 18.75 25.00 37.50 50.00 1.00 2.00 3.00 6.00 12.50 OD 0.660 0.419 0.323 0.298 0.260 0.203 0.544 0.437 0.329 0.209 0.180 HTCO% 36.52 51.06 54.85 60.61 69.24 17.58 33.79 50.15 68.33 72.73 Bảng 10: Hoạt tính kháng oxy hóa tinh dầu (MDA test) Mẫu Chứng Tinh dầu Nồng độ (μM) 10 40 80 120 OD 0.660 0.193 0.319 0.345 0.371 HTCO% 70.76 51.67 47.73 43.79 Phụ lục Bảng 11: Một số loại nghệ thuộc loài curcuma C aeruginosa C albicoma C albiflora C amarissima C americana C angustifolia C aromatica* C attenuata C aurantiaca C bakeriana C bicolor C brog C burttii C caesia C cannanorensis C caulina C careyana C ceratotheca C chuanezhu C chuanhuangjiang C cochinchinensis C codonantha C coerulea C colorata C comosa* C cordata C cordifolia C domestica C ecalcarata C ecomata C elata C erubescens C euchroma C ferruginea C flaviflora C pseudomontana C glans C purpurascens C glaucophylla C purpurea C grandiflora C reclinata C haritha C rhabdota C harmandii C rhomba C heyneana C roscoeana C inodora C rotunda C latiflora C rubescens C leucorhiza C rubrobracteata C leucorrhiza C sessilis C loerzingii C sichuanensis C longa* C singularis C longiflora C soloensis C longispica C sparganifolia C lutea C speciosa C malabarica C spicata C mangga* C stenochila C meraukensis C strobilifera C montana C sulcata C mutabilis C sylvatica C.neilgherrensis C sylvestris C nilamburensis C thalakaveriensis C ochrorhiza C thorelii C officinalis C trichosantha C oligantha C vamana C ornata C vellanikkarensis C parviflora C wenchowensis C parvula C wenyujin C peethapushpa C xanthorrhiza* C petiolata C yunnanensis C phaeocaulis* C zanthorrhiza C pierreana C zedoaria* C porphyrotaenia C zerumbet C.: Curcuma *: Curcuminoid cô lập từ loại nghệ in đậm (Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/Curcuma) Phụ lục Bảng 12: Một số nguồn curcumin thị trường [51] Sử dụng cho người: Sabinsa (www.sabinsa.com/products/circumin_book.htm) Piscataway NJ Kalsec (www.kalsec.com/products/turmeric_over.cfm) Kalamazoo MI Life Extension (www.lef.org/hewshop/items/item00552.html?source=WebProtProd) Turmeric Curcumin (www.turmeric-curcumin.com/) Iherb (www.iherb.com/curcumin1.html) Club Natural (www.clubnatural.com/curex9550180.html) Irvine CA American Nutrition (www.AmericanNutrition.com) Amerifit (www.amerifit.geomerx.com/items/categories.cfm?category=2) Bloomfiled CT XKMS (www.xkms.org/WebVitamins-32/Curcumin-Power-60C.htm) Powerhoue Gym (store.yahoo.com/musclespot/curcumin95.html) MMS Pro (www.mmspro.com) Herbal Fields (www.herbalfields.com/curcumin.html) Sử dụng nghiên cứu: Sigma Aldrich (www.sigmaaldrich.com/cgibin/hsrun/Distributed/HahtShop/HAHTpage/HS_CatalogSearch) Calbiochem (www.calbiochem.com/Products/ProductDetail_CBCB.asp?catNO=239802) LKT Laboratories (www.lktlabs.com) Phụ lục PHỤ LỤC PHỔ HPLC Phụ lục PHỤ LỤC PHỔ GC – MS Phụ lục PHỤ LỤC PHỔ LC – MS Phụ lục PHỤ LỤC KẾT QUẢ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA Phụ lục PHỤ LỤC KẾT QUẢ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN ... .55 2.5 Khảo sát q trình trích ly curcuminoid từ nguyên liệu củ nghệ .56 2.5.1 Khảo sát phương pháp trích ly curcuminoid 56 2.5.2 Khảo sát sơ lựa chọn quy trình tách curcuminoid từ nghệ. .. 95 3.5 Kết khảo sát hoạt tính sinh học tinh dầu curcuminoid .96 3.5.1 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hố tinh dầu curcuminoid 96 3.5.2 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn curcuminoid 99... nước Một yếu tố quan trọng khác quy trình chiết tách quy mơ cơng nghiệp thời gian trình Do vậy, quy trình chiết tách curcuminoid từ thân rễ nghệ vàng Curcuma longa L thực với hỗ trợ vi sóng Hướng