Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của củ rễ cây mạch môn (ophiopogon japonicus (l f ) ker gawl ) tt

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Nguyễn Đình Chung NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HỐ HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA RỄ CỦ CÂY MẠCH MÔN (OPHIOPOGON JAPONICUS (L.f.) KER-GAWL.) Chun ngành: Hóa Hữu Mã số: 62.44.01.14 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội – 2018 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: PGS TS Nguyễn Tiến Đạt Người hướng dẫn khoa học 2: TS Nguyễn Văn Thanh Phản biện 1: ……………………………………………………… Phản biện 2: ……………………………………………………… Phản biện 3: ……………………………………………………… Luận án bảo vệ hội đồng chấm luận án Tiến sĩ cấp Học viện họp Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Vào hồi: ngày tháng năm 2018 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam - Thư viện Quốc gia GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Tính cấp thiết luận án Vai trò quan trọng hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học khẳng định từ y học cổ truyền y học đại Giá trị chúng khơng có cơng dụng trực tiếp làm thuốc chữa bệnh mà dùng làm nguyên mẫu cấu trúc dẫn đường cho phát phát triển nhiều dược phẩm Việt Nam đánh giá nước có nguồn tài nguyên dược liệu phong phú có nhiều kinh nghiệm sử dụng nguồn dược liệu nhờ vào y học cổ truyền lâu đời Theo thống kê Việt Nam có 13000 lồi thực vật 5000 loài sử dụng làm thuốc Đây lợi để khai thác nguồn dược liệu phục vụ cho sống Trên sở kết sàng lọc dịch chiết thô số dược liệu Việt Nam hoạt tính gây độc tế bào ung thư kháng viêm, rễ củ Mạch môn lựa chọn làm đối tượng nghiên cứu luận án Mạch mơn có tên khoa học Ophiopogon japonicus (L.f.) Ker-Gawl trồng nhiều nơi nước ta làm cảnh làm thuốc Rễ củ dược liệu quý có mặt nhiều thuốc y học cổ truyền với mục đích chữa ho long đờm, thương tổn, ho lao, sốt, bệnh lý tiểu đường, táo bón, thổ huyết, chảy máu cam Các nghiên cứu trước thành phần hoá học có chứa hợp chất homoisoflavonoid, steroid saponin polysaccharide Đây thành phần có nhiều hoạt tính sinh học đáng ý kháng viêm, chống oxi hóa, gây độc tế bào, phòng ngăn ngừa bệnh tiểu đường… Vì đề tài “Nghiên cứu thành phần hoá học hoạt tính sinh học rễ củ Mạch mơn (Ophiopogon japonicus (L.f.) Ker-Gawl.)” thực nhằm mục tiêu phát hoạt chất có tiềm từ Mạch mơn góp phần làm rõ cơng dụng chữa bệnh y học cổ truyền đồng thời làm tăng giá trị khoa học Việt Nam Mục tiêu nghiên cứu luận án  Phân lập xác định cấu trúc hợp chất từ rễ củ Mạch môn;  Đánh giá tác dụng gây độc tế bào hoạt tính kháng viêm dựa ảnh hưởng ức chế sản sinh NO hợp chất phân lập Các nội dung nghiên cứu luận án  Phân lập hợp chất từ rễ củ Mạch môn phương pháp sắc ký kết hợp Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập phương pháp vật lý, hóa học;  Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào hoạt tính kháng viêm hợp chất phân lập được; Chƣơng TỔNG QUAN Những nghiên cứu giới nước hóa học hoạt tính sinh học Mạch môn (O japonicus) Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mẫu thực vật Mẫu thực vật PGS.TS Trần Huy Thái (Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam) xác định tên khoa học, tiêu lưu Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật Viện Hóa sinh biển 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp phân lập tinh chế hợp chất Việc phân lập, tinh chế phần dịch chiết thực phương pháp: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lớp mỏng điều chế (PTLC), sắc ký cột thường (CC) silica gel với cỡ hạt khác nhau, sắc ký cột pha đảo YMC RP-C18 ray phân tử Sephadex LH-20 2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học Cấu trúc hợp chất xác định kết hợp thông số vật lý với phương pháp phổ đại: điểm nóng chảy (Mp), độ quay cực ([α]D), phổ hồng ngoại (FT IR), phổ lưỡng sắc tròn (CD), phổ khối phun mù điện tử (ESI-MS), phổ khối phân giải cao (HR ESI MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân: phổ chiều (1H NMR, C NMR DEPT) phổ chiều (COSY, HSQC, 13 HMBC NOESY/ROESY) 2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học  Hoạt tính gây độc dòng tế bào ung thư người: tế bào ung thư phổi kháng thuốc (A549), ung thư phổi người (LU-1), ung thư biểu mô người (KB) ung thư da người (SK-Mel-2)  Hoạt tính tính ức chế sản sinh NO tế bào đại thực bào RAW264.7 kích thích LPS 2.3 Phân lập hợp chất từ rễ củ Mạch môn Ophiopogon japonicus Bột khô rễ củ mạch môn O japonicus (2.4kg) Ngâm với MeOH (5L×3 lần) Cất loại dung mơi Cặn MeOH tổng (360 g) Chiết với CHCl3 (3L×3 lần) OJC1.2 Cặn CHCl3 (8,6g) OJW Dịch nước Diaion HP-20 CC, Nước/Methanol (100:0-0:100) 100:0 0:100 75:25 OJW 1.3 OJW 1.5 OJW 1.4 Hình Sơ đồ chiết phân đoạn rễ củ Mạch môn Cặn CHCl3 OJC1.2 (8,6 g) Silica gel CC, n-Hexane:EtOAc (100:0-0:100) … OJC17.1 OJC17.3 OJC17.5 OJC17.4 … OJC17.9 (986 mg) (2,46 g) Silica gel CC, n-Hexane:EtOAc (20:1) OJC21.1 … OJC21.4 … c (116,4 mg) YMC RP-18 CC, Acetone:nước (2:1) OJC21.7 (264,9 mg) YMC RP-18 CC, Acetone:nước (1.5:1) … OJC21.9 (50,5 mg) Silica gel CC, n-Hexane:acetone (8:1) Hợp chất OJ-5 Hợp chất OJ-4 Hợp chất OJ-2 (69,5 mg) (18,2 mg) (20,8 mg) Hình Sơ đồ phân lập hợp chất OJ-2, OJ-4 OJ-5 từ cặn chloroform OJC 17.3 (986 mg) Silica gel CC, n-Hexane:EtOAc (9:1) OJC19.1 OJC19.2 OJC19.3 (351,9 mg) (60 mg) (197 mg) Hợp chất OJ-8 Hợp chất OJ-6 (31.5 mg) (40.4 mg) OJC20.1 OJC20.2 (70,9 mg) (162,3 mg) YMC RP-18 CC, Acetone:Nước (2:1) YMC RP-18 CC, Acetone:Nước (1:1) Silica gel CC, n-Hexane:acetone (7:1) YMC RP-18 CC, Acetone:Nước (1.5:1) YMC RP-18 CC, Acetone:Nước (1:1) OJC19.4 Kết tinh, Rửa tủa nHexane:CH2Cl2 (3:1) Hợp chất OJ-9 Hợp chất OJ-7 (46.3 mg) (125.7 mg) Hình Sơ đồ phân lập từ hợp chất OJ-6 đến OJ-9 từ phân đoạn OJC17.3 OJW1.5 (11,8 g) Silica gel CC, CHCl3:MeOH (100:0-0:100) OJW2.1 (200 mg) … c OJW2.4 OJW2.5 OJW2.6 (455 mg) (585 mg) (3,6 g) Silica gel CC, n-Hexane:EtOAc (12:1) Silica gel CC, n-Hexane:CH2Cl2:Acetone (15:1:0.1) … OJW2.9 Silica gel CC, CH2Cl2:MeOH(10:1 ) Hợp chất OJ-1 (30,1 mg) OJW9.1 OJW9.2 OJW9.3 (1,39 g) (868 mg) Sephadex LH-20 CC, Methanol:Nước (1:1) YMC RP-18 CC, Methanol:Nước (1:2) Sephadex LH-20 CC, Methanol:Nước (1:1) Hợp chất OJ-12 Hợp chất OJ-15 (45,7 mg) (365,7 mg) Hình Sơ đồ phân lập hợp chất OJ-1, OJ-12 OJ-15 từ phân đoạn OJW1.5 OJW2.4 (455 mg) YMC RP-18 CC, MeOH:Nước (1:1) OJW4.2 OJW 4.1 OJW 4.3 OJW 4.4 (152,5 mg) (49,3 mg) Sephadex LH-20 CC, Methanol:Nước (1:1) Silica gel CC, CH2Cl2:Acetone (10:1 6:1) Hợp chất OJ-3 Hợp chất OJ-10 Hợp chất OJ-11 (20 mg) (35,5 mg) (15,5 mg) Hình Sơ đồ phân lập hợp chất OJ-3, OJ-10 OJ-11 từ phân đoạn OJW2.4 OJW2.5 (585 mg) YMC RP-18 CC, Methanol : Nước (1:1) OJW12.1 … OJW12.4 (40 mg) Sephadex LH-20 CC, Methanol:Nước (1.5:1) Hợp chất OJ-13 (13,9 mg) OJW12.5 OJW12.6 (26,6 mg) Silica gel CC, CH2Cl2:Methanol (20:1) Hợp chất OJ-14 (10,1 mg) Hình Sơ đồ phân lập hợp chất OJ-13 OJ-14 từ phân đoạn OJW2.5 2.4 Thông số vật lý kiện phổ hợp chất Phần trình bày thông số vật lý kiện phổ hợp chất phân lập từ O japonicus 2.5 Kết thử hoạt tính hợp chất phân lập đƣợc 2.5.1 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư hợp chất Bảng 14 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro hợp chất dòng tế bào ung thư người (IC50, μM) Hợp chất OJ-1 OJ-2 OJ-3 OJ-4 OJ-5 OJ-6 OJ-7 OJ-8 OJ-9 OJ-10 OJ-11 OJ-12 OJ-13 OJ-14 OJ-15 Ellipticine Camptothecin LU-1 10,90 >30 >30 >30 >30 0,66 17,14 27,66 >30 >30 >30 >30 >30 >30 >30 0,43 - KB 8,86 >30 >30 >30 >30 0,51 >30 >30 >30 >30 >30 >30 >30 >30 28,84 0,51 - SK-Mel-2 14,01 >30 29,00 >30 >30 0,66 28,29 >30 >30 20,38 >30 >30 >30 >30 24,29 0,27 - A549 6,26 12,4 Ellipticine camptothecin: đối chứng dương sử dụng thực nghiệm 2.5.2 Tác dụng tính ức chế sản sinh NO Bảng 15 Tác dụng tính ức chế sản sinh NO (IC50, μM) Hợp chất IC50 (μM) Hợp chất IC50 (μM) OJ-1 OJ-2 OJ-3 OJ-4 OJ-5 OJ-6 OJ-7 OJ-8 11,4 29,1 >30 >30 >30 22,5 19,3 >30 OJ-9 OJ-10 OJ-11 OJ-12 OJ-13 OJ-14 OJ-15 Card.* >30 >30 >30 >30 >30 >30 >30 2,80 * Cardamonin: đối chứng dương Chƣơng THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 Các hợp chất phân lập đƣợc từ rễ củ Mạch mơn Hình Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ rễ củ Mạch môn 11 Bảng Số liệu phổ 1H 13C NMR (CD3OD, δ ppm) OJ-1 Vị trí TLTK [2] δ Ca δHb, dạng pic (J = Hz) 85,3 34,4 85,1 35,8 3a 7a 1' 2' 3' 4' 5' 6' 7' 118,4 121,3 118,4 152,2 104,4 158,4 130,4 129,3 113,9 158,4 113,9 129,3 40,9 118,0 123,9 117,3 153,8 108,1 158,0 131,2 131,4 114,7 159,7 114,7 131,4 42,0 5-Me 6-Me 7-Me 4'-OMe 56,4 (OMe) 60,5 (OMe) 55,1 16,4 9,15 55,6 4,86, m 3,07, dd (8,5, 15,0); 2,82, dd (7,5, 15,0) 6,67, s 7,19, d (8,5) 6,86, d (8,5) 6,86, d (8,5) 7,19, d (8,5) 3,02, dd (7,0, 14,0); 2,84, dd (6,5, 14,0) 2,12, s 2,05, s 3,78, s a 125 MHz, b500 MHz Tham khảo hợp chất 6,7-dimethoxy-2-(4-methoxylbenzyl)-2,3dihydrobenzofuran theo tài liệu [2] Cấu trúc hợp chất OJ-1 xác nhận dựa phân tích liệu phổ hai chiều Trên phổ tương tác xa HMBC nhận thấy có tương tác proton thơm H-4 với cacbon C-3, C-3a, C-5, C6, C-7a; từ proton nhóm methyl CH3-5 với cacbon C-4, C-5, C-6; từ proton nhóm methyl CH3-7 với cacbon C-6, C-7 C-7a Những tương tác khẳng định cho có mặt khung dihydrobenzofuran với nhóm hydroxyl vị trí C-6 hai nhóm methyl vị trí C-5 C-7 Vị trí nhóm methoxy xác định vị trí C-4' sở tương tác HMBC proton nhóm 12 methoxy cacbon C-4' Bằng cách phân tích chi tiết tương tác nhận phổ HMBC cho phép khâu nối mảnh cấu trúc lại với xác định toàn cấu trúc phẳng hợp chất OJ-1 mơ tả hình Thực nghiệm Tính tốn 2R Hình 17 Phổ ECD hợp chất OJ-1 Cấu hình tuyệt đối vị trí C-2 OJ-1 xác định dựa vào phương pháp tính tốn lượng tử hóa học điện tử lưỡng sắc tròn (ECD - Electronic Circular Dichroism) dựa phụ thuộc thời gian mật độ lý thuyết [3] Trên phổ ECD hợp chất OJ-1 xuất hiệu ứng cotton dương 224 nm cho cấu hình 2R vị trí C-2, phù hợp với mơ hình tính tốn Trên sở phân tích liệu phổ, hợp chất OJ-1 xác định (2R)-(4-methoxybenzyl)5,7-dimethyl-6-hydroxyl-2,3-dihydrobenzofuran 3.1.2 Hợp chất OJ-7: Homoisopogon B Hình 55 Cấu trúc hợp chất OJ-7 tương tác HMBC 13 Hình 57 Phổ 1H NMR hợp chất OJ-7 Hợp chất OJ-7 phân lập dạng bột màu vàng Công thức phân tử xác định C19H22O4 cở sở liệu phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS (m/z 315,1602 [M + H]+, tính tốn lý thuyết cho cơng thức C19H23O4, 315,1596) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H NMR thể đặc trưng hấp thụ δH 4,06 (1H, dd, J = 2,0, 11,0 Hz) 3,83 (1H, dd, J = 6,0, 11,0 Hz) gắn cho proton H-2, δH 2,25 (1H, m) proton H-3; δH 2,80 (1H, dd, J = 5,5, 16,0 Hz) 2,44 (1H, dd, J = 6,5, 16,0 Hz) proton H-4; δH 2,64 (1H, dd, J = 9,0, 14,0 Hz) 2,52 (1H, dd, J = 6,5, 14,0 Hz) gắn cho proton H-9 Thêm vào đó, phổ 1H NMR xuất tín hiệu δH 6,38 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-3'), 6,40 (1H, d, J = 2,5, 8,0 Hz, H-5'), 6,98 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-6') gợi ý cho có mặt nhóm 1,2,4 vòng thơm B Hai tín hiệu singlet proton thơm δH 6,76 (1H, s, H-5) 6,34 (1H, s, H-8) phát hiện, gợi ý cho có mặt nhóm vòng A Từ phổ 13 C NMR DEPT, mười chín tín hiệu cacbon ghi nhận bao gồm: nhóm methyl [δC 15,3 (6-CH3)], nhóm methoxy [δC 55,2 (7-OCH3) 55,3 (4'-OCH3)], nhóm 14 methylen [δC 69,2 (C-2), 30,2 (C-4) 31,0 (C-9)], nhóm methin δC 33,2 (C-3), methin vòng thơm [δC 131,4 (C-5), 98,9 (C-8), 102,0 (C-3'), 106,1 (C-5'), 131,5 (C-6')] cacbon thơm không liên kết với hydro [δC 112,4 (C-4a), 119,1 (C-6), 156,7 (C-7), 152,7 (C-8a), 118,0 (C-1'), 155,0 (C-2') 159,3 (C-4')] Những liệu gợi ý hợp chất OJ-7 homoisoflavane [5] Hình 58 Phổ 13C NMR hợp chất OJ-7 Trên phổ hai chiều tương tác xa HMBC thu tín hiệu tương tác proton nhóm methyl δH 2,10 (3H, s) với C-5 (δC 131,4), C-6 (δC 119,1) C-7 (δC 156,7), tín hiệu từ proton nhóm methoxy δH 3,74 đến C-7 từ δH 3,73 tới C-4' (δC 159,3) Các kết xác định vị trí nhóm methyl methoxy khung homoisoflavane C-6, C-7 C-4', tương ứng Cấu hình tuyệt đối C-3 xác định R sở hiệu ứng cotton âm bước sóng 230 nm hiệu ứng cotton dương bước sóng 285 nm phân tích phổ CD so sánh với tài liệu tham khảo trước cơng bố cấu hình tuyệt đối cho hợp chất (3R)-6,4'dihydroxy-8-methoxyhomoisoflavan ([θ]282 +1080 [θ]217 -2072) 15 [5] Theo đó, cấu trúc hợp chất OJ-7 xác định (3R)4',7-dimethoxy-2'-hydroxy-6-methylhomoisoflavane hợp chất gọi tên homoisopogon B Bảng Số liệu phổ 1H 13C NMR (CDCl3, δ ppm) OJ-7 Vị trí TLTK [4] δCa δHb dạng pic (J = Hz) 69,9 69,2 4,06, dd (2,0, 11,0) 3,83, dd (6,0, 11,0) 34,1 33,2 2,25, m 30,3 30,2 2,80, dd (5,5, 16,0) 2,44, dd (6,5, 16,0) 4a 113,8 112,4 - 130,5 131,4 6,76, s 107,8 119,1 - 155,3 156,7 - 103,0 98,9 6,34, s 8a 154,7 152,7 - 37,3 31,0 2,64, dd (9,0, 14,0) 2,52, dd (6,5, 14,0) 1' 132,6 118,0 - 2' 115,1 155,0 - 3' 145,0 102,0 6,38, d (2,5) 4' 145,5 159,3 - 5' 116,6 106,1 6,40, dd (2,5, 8,0) 6' 120,4 131,5 6,98, d (8,0) 6-CH3 - 15,3 2,10, s 55,2 3,74, s 55,3 3,73, s 7-OCH3 4'-OCH3 a 56,0 125 MHz, b500 MHz Tham khảo hợp chất 7-hydroxy-3-(3-hydroxy-4methoxybenzyl)chroman theo tài liệu [4] 16 3.2 Đánh giá hoạt tính sinh học hợp chất phân lập đƣợc 3.2.1 Hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư Kết theo bảng cho thấy dòng tế bào LU-1 có hợp chất thử nghiệm mang hoạt tính tốt OJ-1, OJ-6, OJ-7 OJ8, OJ-6 thể hoạt tính mạnh với giá trị IC50 = 0,66 µM Trong dòng tế bào ung thư biểu mơ KB có chất thể hoạt tính tốt OJ-1, OJ-6 OJ-15, OJ-1 có hoạt tính mạnh với giá trị IC50 = 0,51 µM hợp chất gồm OJ-1, OJ3, OJ-6, OJ-7, OJ-10 OJ-15 lại có tác dụng gây độc tế bào ung thư da (SK-Mel-2) Điều đáng ý hợp chất homoisopogon A (OJ-6) có tác dụng mạnh dòng tế bào thử nghiệm với giá trị IC50 thấp khoảng 0,51 đến 0,66 µM Đây hợp chất có khung homoisoflavanone phổ biến chi Ophiopogon chứng minh có nhiều hoạt tính sinh học đáng quan tâm Trong nghiên cứu này, lần tác dụng gây độc tế bào ung thư hợp chất thuộc nhóm nồng độ thấp cơng bố Trong nhóm chất homoisoflavane hợp chất thể hoạt tính ức chế trung bình ba dòng tế bào ung thư homoisopogon B (OJ-7) với giá trị IC50 từ 17,14 đến 32,94 µM Trong đó, homoisopogon C (OJ-8) ức chế tế bào LU-1 với giá trị IC50 = 27,66 µM Mối liên quan cấu trúc tác dụng gây độc tế bào homoisoflavonoid nghiên cứu cơng bố Theo đó, nhóm 4'-methoxy xem nhóm định, có ảnh hưởng đến tác dụng độc tế bào lớp chất Trong nghiên cứu này, homoisoflavonoid có nhóm methoxy C-4' thể hoạt tính mạnh dòng tế bào ung thư Trong đó, hợp chất homoisopogon D (OJ-9) với 17 có mặt nhóm methylenedioxy C-3'/C-4' khơng thể hoạt tính ba dòng tế bào ung thư nghiên cứu Trong số hợp chất benzofuran thử nghiệm, OJ-1 có tác dụng gây độc tế bào Hợp chất có cấu hình tuyệt đối C-2 xác định R, chất lại dạng racemic thêm nối đơi khơng có hoạt tính Điều gợi ý % apoptotic cells vai trò quan trọng cấu hình 2R khung 2-benzylbenzofuran Hình 115 Tác dụng gây chết theo chương trình OJ-6 dòng tế bào A549 Do hợp chất homoisopogon A (OJ-6) có tác dụng gây độc tế bào ung thư mạnh có dòng ung thư phổi (LU-1), hợp chất tiếp tục thử nghiệm dòng tế bào ung thư phổi kháng thuốc (A549) Kết cho thấy hợp chất ức chế mạnh phát triển tế bào A549 (IC50 = 6,27 μM) so với thuốc chữa ung thư camptothecin (IC50 = 12,4 μM) Tiếp đến, hợp chất đánh giá sâu tác dụng diệt tế bào ung thư A549 theo chế 18 gây chết theo chương trình (apoptosis) phương pháp trắc lưu tế bào Kết Hình 115 cho thấy sau 24 ủ với OJ-6 nồng độ 25 μM, tỷ lệ tế bào A549 chết rụng đạt khoảng 27,5% Trong với OJ-6 nồng độ 50 μM, tỷ lệ tăng lên đến 83,8% tỷ lệ sống sót tế bào 16,2% Dòng tế bào A549 thử nghiệm nghiên cứu dòng ung thư phổi tế bào không nhỏ (NSCLC) kháng thuốc EGFR-TKI Hiện nay, tượng kháng thuốc EGFR-TKI NSCLC thách thức lớn điều trị ung thư phổi Kết thu cho thấy homoisopogon A (OJ-6) hợp chất kháng ung thư tiềm năng, diệt tế bào ung thư theo chế gây chết theo chương trình 3.2.2 Tác dụng tính ức chế sản sinh NO Các hợp chất phân lập được thử hoạt tính ức chế sản sinh NO tế bào đại thực bào RAW 264.7 kích thích LPS Trong số hợp chất phân lập được, hợp chất dẫn xuất benzofuran thể hoạt tính tốt Hợp chất OJ-1 ức chế mạnh sản sinh NO với giá trị IC50 = 11,4 µM, hợp chất OJ-2 thể hoạt tính ức chế trung bình với giá trị IC50 = 29,1 µM Các hợp chất khác thể hoạt tính ức chế yếu khơng có hoạt tính 2,3-Dihydrobenzofuran biết đến hợp chất có tác dụng kháng viêm mạnh Điều chứng minh thể hợp chất có khung 2,3-dihydrobenzofuran-2-one có khả kháng viêm mạnh thử nghiệm in vivo Các hợp chất có khung 5-chloro-6-cyclohexyl-2,3-dihydrobenzofuran-2-one có ý nghĩa ức chế mạnh so với chất tham khảo, diclofenac, tất 19 thí nghiệm [6] Thêm vào đó, hợp chất dihydrobenzo furan phân lập từ hạt Prunus tomentosa thử nghiệm thu kết ức chế mạnh sản sinh NO dòng tế bào BV-2 [7] Từ kết nghiên cứu rằng, dihydrobenzofuran từ rễ củ mạch môn nguồn kháng viêm từ tự nhiên mạnh nên nghiên cứu kỹ để tìm nguồn kháng viêm công nghiệp sản xuất dược phẩm Hai hợp chất thuộc nhóm homoisoflavonoid gồm homoisopogon A (OJ-6) homoisopogon B (OJ-7) thể tác dụng ức chế sản sinh NO với giá trị IC50 22,5 19,3 μM, tương ứng Các hợp chất khác tác dụng nồng độ thử nghiệm lớn 30 μM KẾT LUẬN Về nghiên cứu thành phần hóa học Từ rễ củ Mạch mơn (O japonicus), 15 hợp chất phân lập bao gồm hợp chất mới, hợp chất lần phân lập từ thiên nhiên hợp chất biết Các hợp chất thuộc nhóm chất benzofuran (5 chất), homoisoflavonoid (4 chất), flavonoid (2 chất), eudesmane sesquiterpenoid (3 chất) steroidal glycoside (1 chất) Cấu trúc hóa học chúng xác định gồm: Nhóm chất benzofuran: (2R)-(4-methoxybenzyl)-5,7- dimethyl-6-hydroxyl-2,3-dihydrobenzofuran (OJ-1, chất mới), 2-(2hydroxyl-4-methoxy-benzyl)-5-methyl-6-methoxyl-2,3-dihydrobenz ofuran (OJ-2, chất mới), 2-(4-hydroxy-benzyl)-5,6-dihydroxylben zofuran (OJ-3, chất mới), 2-(4-methoxy-benzyl)-6,7-dimethoxyl- 20 2,3-dihydrobenzofuran (OJ-4, chất từ thiên nhiên) 2-(4methoxy-benzyl)-6,7-methylenedioxy-2,3-dihydrobenzofuran (OJ-5, chất từ thiên nhiên) Nhóm chất homoisoflavonoid: homoisopogon A (OJ-6, chất mới), homoisopogon B (OJ-7, chất mới), homoisopogon C (OJ-8, chất mới) homoisopogon D (OJ-9, chất mới) Nhóm chất flavonoid: 8-C-methyl-3',5,5',7-tetrahydroxy3,4′-dimethoxyflavone (OJ-10, chất mới) myricetin 3,4'-dimethyl ether (3',5,5',7-tetrahydroxy-3,4'-dimethoxyflavone) (OJ-11) Nhóm chất eudesmane sesquiterpenoid: 1α,4β,6β- trihydroxy-5,10-bis-epi-eudesmane-6-O-β-D-glucopyranoside 12), (OJ- 1α,6β-dihydroxy-5,10-bis-epi-eudesm-4(15)-ene-6-O-β-D- glucopyranoside (OJ-13) 1α,6β-dihydroxy-5,10-bis-epi-eudesm3-ene-6-O-β-D-glucopyranoside (OJ-14) Nhóm chất steroidal glycoside: (25R)-ruscogenin 1-O-(4-Osulfo)-β-D-fucopyranoside (OJ-15, chất mới) Các hợp chất có khung 2-benzylbenzofuran gặp dẫn xuất 2-benzyl-2,3-dihydrobenzofuran chưa phân lập từ thiên nhiên Luận án phân lập xác định cấu trúc hoá học hợp chất thuộc nhóm chất Cùng với hợp chất thuộc nhóm chất khác, điểm bật luận án đóng góp vào ngân hàng liệu hoá học hợp chất thiên nhiên Về nghiên cứu hoạt tính sinh học 2.1 Đã khảo sát hoạt tính gây độc tế bào in vitro hợp chất phân lập dòng tế bào ung thư phổi kháng thuốc 21 (A549), ung thư phổi (LU-1), ung thư biểu mô (KB), ung thư sắc tố (SK-Mel-2) Kết cho thấy hợp chất homoisopogon A (OJ-6) có hoạt tính mạnh dòng tế bào thử nghiệm (LU-1, KB SK-Mel-2) với giá trị IC50 từ 0,51 đến 0,66 µM so sánh với chất đối chứng ellipticine Hợp chất (2R)-(4-methoxybenzyl)-5,7-dimethyl-6hydroxyl-2,3-dihydrobenzofuran (OJ-1) có tác dụng mạnh với giá trị IC50 từ 8,86 đến 14,0 µM Đối với dòng tế bào ung thư phổi kháng thuốc (A549), homoisopogon A (OJ-6) thể tác dụng mạnh so với đối chứng dương camptothecin Hợp chất thể tác dụng gât chết tế bào ung thư A549 theo chế gây chết theo chương trình nồng độ thử nghiệm 25 50 μM 2.2 Đánh giá hoạt tính kháng viêm dựa ảnh hưởng ức chế sản sinh NO 15 hợp chất tế bào đại thực bào RAW 264.7 Trong số hợp chất phân lập được, hợp chất dẫn xuất thuộc nhóm benzofuran thể hoạt tính tốt Hợp chất OJ-1 ức chế mạnh sản sinh NO với giá trị IC50 = 11,4 µM, hợp chất OJ-2 thể hoạt tính ức chế trung bình với giá trị IC50 = 29,1 µM Hai hợp chất thuộc nhóm homoisoflavonoid homoisopogon A (OJ-6) homoisopogon B (OJ-7) thể tác dụng ức chế sản sinh NO với giá trị IC50 22,5 19,3 μM KIẾN NGHỊ Đây cơng trình nghiên cứu Mạch mơn O japonicus, hợp chất phân lập thể hoạt tính gây độc tế bào hoạt tính kháng viêm nhiều tiềm Đặc biệt hợp chất 22 homoisopogon A (OJ-6) cần nghiên cứu sâu hoạt tính sinh học theo tác dụng gây chết tế bào ung thư kháng viêm NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Từ rễ củ Mạch môn (O japonicus), 15 hợp chất phân lập bao gồm: - 09 hợp chất [(2R)-(4-methoxybenzyl)-5,7-dimethyl-6hydroxyl-2,3-dihydrobenzofuran (OJ-1), 2-(2-hydroxyl-4-methoxybenzyl)-5-methyl-6-me thoxyl-2,3-dihydrobenzofuran (OJ-2), 2-(4hydroxy-benzyl)-5,6-dihydroxyl benzofuran (OJ-3), homoisopogon A (OJ-6), homoisopogon B (OJ-7), homoisopogon C (OJ-8), homoisopogon D (OJ-9), 8-C-methyl-3',5,5',7-tetra hydroxy-3,4′dimethoxyflavone (OJ-10) (25R)-ruscogenin 1-O-(4-O-sulfo)-βD-fucopyranoside (OJ-15)] - 02 hợp chất lần phân lập từ thiên nhiên [2-(4methoxy-benzyl)-6,7-dimethoxyl-2,3-dihydrobenzofuran (OJ-4) 2-(4-methoxy-benzyl)-6,7-methylenedioxy-2,3-dihydrobenzofuran (OJ-5)] hợp chất biết Các hợp chất thuộc lớp chất benzofuran (05 chất), homoisoflavonoid (04 chất), flavonoid (02 chất), eudesman sesquiterpene (03 chất) steroid glycoside (01 chất) Đã khảo sát hoạt tính gây độc tế bào in vitro hợp chất phân lập dòng tế bào ung thư phổi kháng thuốc (A549), bào ung thư phổi (LU-1), ung thư biểu mô (KB), ung thư sắc tố (SK-Mel-2) Kết cho thấy hợp chất homoisopogon A (OJ-6) có hoạt tính mạnh tất dòng tế bào LU-1, KB SK- 23 Mel-2 với giá trị IC50 từ 0,51 đến 0,66 µM so sánh với chất đối chứng ellipticine Hợp chất thể tác dụng diệt tế bào ung thư A549 theo chế gây chết có lập trình nồng độ thử nghiệm 25 50 μM Hợp chất OJ-1 có tác dụng mạnh với giá trị IC50 từ 8,86 đến 14,0 µM Đánh giá hoạt tính kháng viêm dựa ảnh hưởng ức chế sản sinh NO 15 hợp chất tế bào đại thực bào RAW264.7 Trong số hợp chất phân lập được, hợp chất dẫn xuất benzofuran thể hoạt tính tốt Hợp chất OJ-1 ức chế mạnh sản sinh NO với giá trị IC50 = 11,4 µM, hợp chất OJ-2 thể hoạt tính ức chế trung bình với giá trị IC50 = 29,1 µM Hai hợp chất homoisoflavonoid homoisopogon A (OJ-6) homoisopogon B (OJ-7) thể tác dụng ức chế sản sinh NO với giá trị IC50 22,5 19,3 μM TÀI LIỆU THAM KHẢO Ortega, N.; Urban, S.; Beiring, B.; Glorius, F., Ruthenium NHC catalyzed highly asymmetric hydrogenation of benzofurans Angewandte Chem Int Edition 2012, 51, 1710−1713 Qi, P.; Jiang, J.; Qi, H.; Jin, Y.; Shen, Q.; Wu, Y.; Song, H.; Zhang, W., Synthesis and antiproliferative activity of new polyoxo 2-benzyl-2,3-dihydrobenzofurans and their related compounds Lett Drug Des Dis 2013, 10, 886−894 Kwon, J.; Hiep, N T.; Kim, D W.; Hong, S.; Guo, Y.; Hwang, B Y.; Lee, H J.; Mar, W.; Lee, D., Chemical constituents isolated 24 from the root bark of Cudrania tricuspidata and their potential neuroprotective effects J Nat Prod., 2016, 79, 1938−1951 Masaoud, M.; Ripperger, H.; Porzel, A.; Adam, G., Flavonoids of dragon's blood from Dracaena cinnabari Phytochemistry 1995, 38 (3), 745-749 Awale, S.; Miyamoto, T.; Linn, T Z.; Li, F.; Win, N N.; Tezuka, Y.; Esumi, H.; Kadota, S., Cytotoxic Constituents of Soymida febrifuga from Myanmar J Nat Prod., 72 (9), 1631–1636 Closse, A.; Haefliger, W.; Hausser, D.; U.Gubler, H.; Dewald, B.; Baggiolini, M., 2,3-Dihydrobenzofuran-2-ones: A new class of highly potent antiinflammatory agents J Med Chem., 1981, 24, 1465−1471 Liu, Q.-B.; Huang, X.-X.; Bai, M.; Chang, X.-B.; Yan, X.-J.; Zhu, T.; Zhao, W.; Peng, Y.; Song, S.-J., Antioxidant and antiinflammatory active dihydrobenzofuran neolignans from the seeds of Prunus tomentosa J Agri Food Chem., 2014, 62, 7796– 7803 25 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nguyen Dinh Chung, Nguyen Phuong Thao, Ha Manh Tuan, Nguyen Van Thanh, Nguyen Hai Dang, Nguyen Tien Dat New steroidal glycoside and flavonoid constituents from Ophiopogon japonicus Nat Prod Commun., 2017, 12(6), 905–906 Nguyen Hai Dang, Nguyen Dinh Chung, Ha Manh Tuan, Nguyen Tuan Hiep, Nguyen Tien Dat Cytotoxic homoisoflavonoids from Ophiopogon japonicus tubers Chem Pharm Bull., 2017, 65(2), 204–207 Nguyen Hai Dang, Nguyen Dinh Chung, Ha Manh Tuan, Nguyen Van Thanh, Nguyen Tuan Hiep, Dongho Lee, and Nguyen Tien Dat 2-Benzyl-benzofurans from the tubers of Ophiopogon japonicus Chem Cent J., 2017, 11:15 Nguyen Dinh Chung, Nguyen Tien Dat, Le Thi Van Anh, Jeong-Hyung Lee, Nguyen Hai Dang Homoisopogon A from Ophiopogon japonicus induced apoptosis in A549-a non small cell lung cancer cell line Tạp chí Sinh học 2017, 15(1), 35–39 Nguyen Dinh Chung, Nguyen Hai Dang, Nguyen Van Thanh, Nguyen Tien Dat Eudesmane sesquiterpene glucosides from Ophiopogon japonicus Tạp chí Khoa học Cơng nghệ 2015, 53(4C), 56–62 ... đường… Vì đề tài Nghiên cứu thành phần hố học hoạt tính sinh học rễ củ Mạch môn (Ophiopogon japonicus (L. f. ) Ker- Gawl .) thực nhằm mục tiêu phát hoạt chất có tiềm từ Mạch mơn góp phần làm rõ cơng... lý, hóa học;  Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào hoạt tính kháng viêm hợp chất phân lập được; Chƣơng TỔNG QUAN Những nghiên cứu giới nước hóa học hoạt tính sinh học Mạch môn (O japonicus) Chƣơng... dược liệu Việt Nam hoạt tính gây độc tế bào ung thư kháng viêm, rễ củ Mạch môn lựa chọn làm đối tượng nghiên cứu luận án Mạch mơn có tên khoa học Ophiopogon japonicus (L. f. ) Ker- Gawl trồng nhiều