chuyển hoá artemisinin từ thanh hao hoa vàng (artemisia annua l ) bằng phương pháp sinh học để tạo thành các dẫn xuất có hoạt tính sinh học

Để khắc phục các nhược điểm trên, các nhà khoa học đã nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất của artemisinin với các tính chất sinh học tốt hơn bằng các phương pháp hóa học cũng như sinh học..

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

- -

PHẠM QUANG DƯƠNG

CHUYỂN HOÁ ARTEMISININ TỪ THANH HAO HOA VÀNG

(ARTEMISIA ANNUA L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC

ĐỂ TẠO THÀNH CÁC DẪN XUẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

- -

PHẠM QUANG DƯƠNG

CHUYỂN HOÁ ARTEMISININ TỪ THANH HAO HOA VÀNG

(ARTEMISIA ANNUA L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC

ĐỂ TẠO THÀNH CÁC DẪN XUẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KỸ THUẬT HOÁ HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

KỸ THUẬT HOÁ HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :

1 PGS TS VŨ ĐÌNH HOÀNG

2 PGS TS PHẠM GIA ĐIỀN CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG :

PGS.TS HOÀNG XUÂN TIẾN

HÀ NỘI – 2014

LỜI CAM ĐOAN

Luận văn Thạc sĩ khoa học chuyên ngành Kỹ thuật Hóa học với đề tài “Chuyển hóa artemisinin từ thanh hao hoa vàng (Artemisia annua L.) bằng phương pháp sinh học để tạo thành các dẫn xuất có hoạt tính sinh học’’ được hoàn thành dưới

sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS Vũ Đình Hoàng – Bộ môn CN Hóa dược và BVTV – Viện Kỹ thuật Hóa học – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội và PGS.TS Phạm Gia Điền - Phòng CN Các chất có hoạt tính sinh học – Viện Hoá học – Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Tôi xin cam đoan các số liệu, những kết luận nghiên cứu được trình bày trong luận văn này là trung thực và không sao chép nội dung từ bất kỳ một luận văn thạc sĩ hay tiến sĩ nào khác

MỤC LỤC

Trang

PHẦN I: TỔNG QUAN 9

I.1.TÌNHHÌNHSỐTRÉTỞVIỆTNAMVÀTRÊNTHẾGIỚI 9

I.1.1 Tình hình sốt rét trên thế giới 9

I.1.2 Tình hình sốt rét ở Việt Nam 10

I.1.3 Các hoạt chất có hoạt tính sinh học trong điều trị sốt rét 10

I.2.CHUYỂNHOÁHOÁHỌCCỦAARTEMISININ 11

I.2.1 Artemisinin 11

I.2.2 Tính chất hoá học của artemisinin 12

I.2.2.1 Phản ứng nhiệt phân 12

I.2.2.2 Phản ứng với kiềm 13

I.2.2.3 Phản ứng với amoniac và amin 13

I.2.2.4 Phản ứng với acid 14

I.2.2.5 Phản ứng khử hoá 14

I.2.3 Phản ứng tạo các dẫn xuất từ artemisinin 15

I.2.3.1 Bán tổng hợp các dẫn xuất ete của dihydroartemisinin (DHA) 15

I.2.3.2 Bán tổng hợp các dẫn xuất este của dihydroartemisinin (DHA) 16

I.2.3.3 Bán tổng hợp các dẫn xuất carbohydrat của DHA 16

I.2.3.4 Bán tổng hợp các dẫn xuất fluoralkyl ete của DHA 16

I.2.4 Hoạt tính chống sốt rét của artemisinin 17

I.2.4.1 Cơ chế tác động của Artemisinin-Sự hoạt hoá bởi Fe2+ của haem 17

I.2.4.2 Cơ chế tác động của Artemisinin-Sự kìm hãm enzyme PfATP6 20

I.2.5 Hoạt tính chống ung thƣ của artemisinin và các dẫn xuất 21

I.2.5.1 Artemisinin monomer 21

I.2.5.2 Những monomer khác 22

I.2.5.3 Artemisinin dimer 23

I.2.5.4 Artemisinin liên hợp 24

I.3.CHUYỂNHOÁSINHHỌCCỦAARTEMISININVÀCÁCDẪNXUẤT 26

I.3.1 Chuyển hoá sinh học của artemisinin 27

I.3.2 Chuyển hoá sinh học của dẫn xuất artemisinin 31

I.4. ĐẶCĐIỂMCHỦNGVISINHVẬTPENICILLIUM CITRINUM 34

I.4.1 Đặc điểm hình thái 34

I.4.2 Chuyển hoá của chủng Penicillium citrinum 35

PHẦN II: VẬT LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

II.1.VẬTLIỆU,THIẾTBỊ 38

II.1.1 Hoá chất, Chủng và môi trường vi sinh vật 38

II.1.2 Dụng cụ, thiết bị 39

II.2.PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 39

II.2.1 Phương pháp lên men 39

II.2.2 Phương pháp sắc kí lớp mỏng 40

II.2.3 Phương pháp sắc kí cột 41

II.2.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 43

II.2.5 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 45

PHẦN III: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 46

III.1.THỰCNGHIỆM 46

III.1.1 Chuẩn bị dịch lên men 46

III.1.2 Lên men thực hiện chuyển hoá: 46

III.1.3 Tách sản phẩm 47

III.2.KẾTQUẢ 49

III.2.1 Xác định cấu trúc hoá học sản phẩm M1 49

III.2.2 Số liệu phổ 1H, 13C NMR của 4α-hydroxydeoxyartemisinin 50

III.2.3 Thử hoạt tính sinh học 53

III.2.3.1 Pha loãng mẫu thử: 53

III.2.3.2 Thử hoạt tính 53

III.2.3.3 Chất tham khảo 53

III.3.THẢOLUẬN 55

PHẦN IV: KẾT LUẬN 56

PHẦN V: TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC 63

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Phạm Gia Điền cùng các các anh, chị trong - Phòng CN Các chất có hoạt tính sinh học – Viện Hoá học – Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã động viên, giúp đỡ tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong thời gian thực hiện luận văn

Nhân dịp này, tôi xin cảm ơn tới các thầy giáo, cô giáo đặc biệt là các thầy cô thuộc Viện Kỹ thuật Hóa Học trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã chỉ dạy cho tôi trong suốt quá trình học tập

Tôi cũng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, và người thân đã giúp

đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập và thời gian làm luận văn

Hà nội, ngày tháng năm 2014

Học viên

Phạm Quang Dương

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

IR: Infrared Spectroscopy

EI – MS: Electron Impact Mass Spectroscopy

1

H NMR: 1H -Nuclear Magnetic Resonance

13C NMR: 13C - Nuclear Magnetic Resonance

HMQC: Heteronuclear Multiple - Quantum Coherence

HMBC: Heteronuclear multiple - Bond Correlation

DEPT: Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

TLC: Thin layer chromatography

EtOAc: Ethyl acetate

MIC (Minimum Inhibitory Concentration): Nồng độ ức chế tối thiểu

IC50 (The half maximal Inhibitory Concentration): Nồng độ ức chế 50% MBC (Minimum Bactericidal Concentration): Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu

DANH MỤC CÁC HÌNH , SƠ ĐỒ VÀ BẢNG

Trang

Hình 1.1 Đường hướng tác động của artemisinin gây ra bởi ferrous haem (Fe(II)

protoporphyrin IX)……… 20

Hình 1.2 Vị trí liên kiết của chất kìm hãm thapsigargin và artemisone đối với enzyme SERCA……… 20

Sơ đồ 1.1 Chuyển hoá artemisinin của chủng Penicillium chrysogenum ATCC 9480……… 28

Sơ đồ 1.2 Chuyển hoá artemisinin của chủng Nocardia corallina ATCC 19070 và chủng Aspergillus flavus……… 28

Sơ đồ 1.3 Chuyển hoá artemisinin của chủng Cunninghamella elegans ATCC 9245……… 29

Sơ đồ 1.4 Chuyển hoá artemisinin của chủng Cunninghamella echinulata AS 3.3400 và chủng Aspergillus niger AS 3.795……… 30

Sơ đồ 1.5 Chuyển hoá artemisinin của chủng Penicillium simplicissimum……… 31

Hình 1.3 Đăc điểm hình thái chủng Penicillium citrinum……… …… 34

Hình 1.4 Các dạng khuẩn lạc Penicillium citrinum nuôi cấy trên môi trường agar……… 34

Sơ đồ 1.6 Chuyển hoá caffein của chủng Penicillium citrinum……… 36

Sơ đồ 1.7 Chuyển hoá 3β-acetoxypregna-5,16 diene-20-one của chủng Penicillium citrinum……… 37

Hình 2.1 Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng……… 40

Hình 2.2 Phương pháp sắc kí cột……… 43

Hình 3.1 Kết quả theo dõi dịch lên men bằng bản sắc ký lớp mỏng……… 47

BẢNG 3.1: Hệ dung môi dùng để phân lập chất……… 48

BẢNG 3.2: Độ dịch chuyển hoá học của proton trên phổ 1H NMR của artemisinin và 4α-hydroxydeoxyartemisinin ……… 51

BẢNG 3.3: Độ dịch chuyển hoá học của cacbon trên phổ 13C NMR của

artemisinin và 4α-hydroxydeoxyartemisinin ……… 52

BẢNG 3.4: Kết quả thử hoạt tính kháng các chủng vi sinh vật kiểm định của artemisinin và 4α-hydroxydeoxyartemisinin……… 54

ĐẶT VẤN ĐỀ

Artemisinin là một sesquiterpene có cầu endoperoxide được phân lập từ cây

Thanh hoa hoa vàng (Artemisia annua L.) được trồng phổ biến ở Việt Nam và một

số nước khác trên thế giới như: Trung Quốc, Ấn Độ Artemisinin là một chất có phổ hoạt tính sinh học rộng, như hoạt tính: chống ung thư, hoạt tính chống khuẩn, hoạt tính chống sốt rét Trong đó, artemisinin được sử dụng phổ biến điều trị bệnh sốt rét

gây ra bởi loài Plasmodium falciparum kháng cloroquine, ở dạng kết hợp (ACT)

với một số loại thuốc chống sốt rét khác Tuy nhiên, do đặc điểm thể hiện độc tính cao, hấp thu kém do tính tan trong dầu và tan trong nước kém, cũng như dễ bị tái phát vì kém bền trong cơ thể người

Để khắc phục các nhược điểm trên, các nhà khoa học đã nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất của artemisinin với các tính chất sinh học tốt hơn bằng các phương pháp hóa học cũng như sinh học Chuyển hóa sinh học (Biotransformation) sử dụng

vi sinh vật và các enzyme rất hiệu quả đối với sesquiterpene Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu tổng hợp sinh học các dẫn xuất của artemisinin sử dụng nhiều chủng vi sinh vật khác nhau Một số phương pháp hiệu quả hơn hẳn so với phương pháp chuyển hóa hóa học Tại Việt Nam, những chuyển hóa sinh học artemisinin sử dụng các chủng vi sinh vật khác nhau, còn ít được quan tâm Nhằm tìm kiếm các chủng vi sinh mới có hiệu suất chuyển hóa cao, hoặc các dẫn xuất mới Chúng tôi

thực hiện đề tài: “Chuyển hóa artemisinin từ thanh hao hoa vàng (Artemisia annua L) bằng phương pháp sinh học để tạo thành các dẫn xuất có hoạt tính sinh học”

Nội dung của đề tài bao gồm:

(1) Nuôi cấy các chủng vi sinh vật

(2) Thực hiện chuyển hóa sinh học artemisinin sử dụng các chủng này

(3) Phân lập các chất tinh khiết từ hỗn hợp sản phẩm

(4) Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được bằng các phương pháp phổ

(5) Thử hoạt tính sinh học các chất này

PHẦN I: TỔNG QUAN

I.1.TÌNH HÌNH SỐT RÉT Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI

I.1.1 Tình hình sốt rét trên thế giới

Sốt rét còn gọi là ngã nước là một chứng bệnh gây ra bởi ký sinh trùng tên Plasmodium, lây truyền từ người này sang người khác khi những người này bị muỗi

Anophen đốt, và loài muỗi này được chuyên gia người Anh là Ronald Ross xác định như là một vật trung gian truyền ký sinh trùng sốt rét

Bệnh phổ biến ở các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới của châu Mỹ, châu Á và châu Phi Mỗi năm có khoảng 515 triệu nguời mắc bệnh, từ 1 đến 3 triệu người tử vong - đa số là trẻ em ở khu vực phía nam sa mạc Sahara, châu Phi Trong đó 90%

số ca tử vong xảy ra tại đây Sốt rét thường đi kèm với đói nghèo, lạc hậu, và là một cản trở lớn đối với phát triển kinh tế Sốt rét là một trong những bệnh truyền nhiễm phổ biến nhất và là vấn đề rất nghiêm trọng đối với sức khoẻ cộng đồng Bệnh gây

ra bởi ký sinh trùng protozoa thuộc chi Plasmodium Chi này có bốn loài làm con người nhiễm bệnh Nguy hiểm hơn cả là Plasmodium falciparum và Plasmodium vivax Hai loài còn lại (Plasmodium ovale, Plasmodium malariae) cũng gây bệnh nhưng ít tử vong hơn Nhóm các loài Plasmodium gây bệnh ở người thường được gọi chung là ký sinh trùng sốt rét Riêng loài P knowlesi, phổ biến ở Đông Nam Á,

gây bệnh sốt rét ở khỉ nhưng cũng có thể gây nhiễm trùng nặng ở người

Những biểu hiện sau khi nhiễm bệnh bắt đầu thể hiện từ ngày thứ 8 đến 25; tuy nhiên, các triệu chứng có thể thể hiện muộn hơn đối với những người đã sử dụng thuốc chống sốt rét Biểu hiện ban đầu của bệnh là các triệu chứng giống cảm cúm,

và có thể tương tự như các trường hợp khác như nhiễm trùng, viêm ruột và bệnh do virus Biểu hiện của bệnh có thể gồm đau đầu, sốt, run, đau khớp, nôn, thiếu máu tán huyết, vàng da, tiểu ra máu, tổn thương võng mạc, và co giật

Sốt rét nghiêm trọng thường gây ra bởi loài P falciparum Các triệu chứng của sốt rét do P falciparium phát triển 9–30 ngày sau khi nhiễm.Những người bị sốt rét

thể não thường thể hiện các triệu chứng thần kinh như hành vi bất thường, run giật nhãn cầu, co giật, hoặc hôn mê [1]

I.1.2 Tình hình sốt rét ở Việt Nam

Tại Việt Nam, báo cáo của TS Nguyễn Thanh Dương – Viện trưởng Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng TW cho biết: 11 tháng đầu năm 2013 cả nước ghi nhận 32.498 bệnh nhân mắc sốt rét; 80 trường hợp bệnh nhân sốt rét ác tính và 5 trường hợp tử vong do sốt rét So với cùng kỳ năm 2012 số bệnh nhân sốt rét giảm 18,5%, số bệnh nhân sốt rét ác tính giảm 41,6% và số tử vong do sốt rét giảm 16,7% Tuy nhiên nguy cơ sốt rét quay trở lại và bùng phát dịch sốt rét vẫn còn rất cao ở nhiều địa phương do số người sống trong vùng sốt rét còn cao, ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc đã xuất hiện ở một số tỉnh và có nguy cơ lan rộng ra nhiều địa phương khác, muỗi truyền bệnh kháng với hóa chất, di biến động dân cư giữa vùng

có sốt rét và vùng không có sốt rét lưu hành [2]

I.1.3 Các hoạt chất có hoạt tính sinh học trong điều trị sốt rét

Đã có rất nhiều loại chất có hoạt tính sinh học đã được sử dụng như là thuốc để dùng điều trị bệnh sốt rét Những loại thuốc này tác động lên các giai đoạn trong chu trình phát triển của ký sinh trùng số rét Tiêu biểu là nhóm thuốc họ quinolin Trong họ quinolin, quinin là loại thuốc chống sốt rét được tìm ra đầu tiên vào năm

1820, tiếp đó, tới năm 1945 chloroquine ra đời Cơ chế tác động của dòng quinolin được cho là tác động ức chế lên quá trình polyme hoá haem của ký sinh trùng sốt rét (haem là phần được giải phóng ra từ hemoglobin, haem thể hiện độc tính với ký sinh trùng sốt rét Để giải độc tính này, các ký sinh trùng gây bệnh đã chuyển hoá haem thành dạng polyme β-haematin) Tiếp đến năm 1970, pyrimethamin được tìm thấy Cơ chế tác động của pyrimethamin là ức chế enzyme trong quá trình khử dihydrofolat, một chất cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp pyrimidin

Tuy nhiên hiện tượng kháng thuốc trong các ký sinh trùng sốt rét đã đặt ra yêu cầu đối với những nhà khoa học là phải tìm ra loại thuốc mới trong điều trị sốt rét Năm 1972, trong một nghiên cứu của nhà khoa học người Trung Quốc Tu Youyou

đã tìm ra hoạt chất artemisinin trong lá khô của cây Artemisia annua Artemisinin

được ghi nhận là hoạt chất có hiệu quả trong điều trị sốt rét và thuộc trong danh sách gần 200 bài thuốc cổ truyền Trung Quốc đã được sử dụng [4]

I.2 CHUYỂN HOÁ HOÁ HỌC CỦA ARTEMISININ

Ở Việt Nam, từ thế kỷ 14, Tuệ Tĩnh đã dùng thanh hao hoa vàng để chữa sốt rét Năm 1989, nhà nghiên cứu Đinh Huỳnh Kiệt cùng cộng sự đã công bố kết quả phân tích thành phần hóa học của Thanh hao hoa vàng mọc hoang và chiết suất artemisinin để chữa sốt rét cho bộ đội Theo phương pháp này, dung môi dùng dể chiết là ether dầu hoả, xăng công nghiệp, n-hexane, dịch chiết được cô loại dung môi, artemisinin sẽ tự kết tinh trong cặn cô thu được sản phẩm thô Sản phẩm thô được tẩy mầu bằng than hoạt tính và kết tinh lại trong cồn [3]

Từ đó, phong trào nghiên cứu trồng và chiết xuất artemisinin từ loại cây này bùng phát Chất artemisinin trong thanh hao có tác dụng diệt ký sinh trùng sốt rét thể vô tính trong hồng cầu Chất này cũng có khả năng chữa ung thư vú và bệnh bạch cầu, với điểm đặc biệt là rất ít ảnh hưởng lên trên tế bào lành xung quanh Ở liều điều trị, artemisinin và các dẫn chất của nó không độc hại, kể cả với phụ nữ có thai và người suy gan, thận Những năm 1990, các nhà khoa học Việt Nam và Công

ty Dược liệu TWI đã trồng hàng trăm hécta cây Thanh cao hoa vàng, chiết suất

hàng tấn artemisinin với hiệu suất cao và bán tổng hợp các loại thuốc chống sốt rét

từ artemisinin như artesunate, artemether, arteether, đã sản xuất hàng triệu liều thuốc chống sốt rét cung cấp cho nhu cầu trong nước và xuất khẩu, thu về hàng triệu

đô la Mỹ mỗi năm

Artemisinin Artemether Arteether Artesunate I.2.2 Tính chất hoá học của artemisinin [3]

Do trong phân tử artemisinin có cầu endoperoxide (-O-O-) là mối liên kết nhạy cảm, dễ bị phân huỷ, với các điều kiện hoá học khác nhau artemisinin bị biến đổi thành những hợp chất mà đa số không còn khung cơ bản ban đầu nữa Ngoài ra artemisinin và một số dẫn xuất còn có thể bị biến đổi dưới ánh sảng tử ngoại: mất cầu endoperoxide và thay đổi khung cơ bản ban đầu

I.2.2.1 Phản ứng nhiệt phân

Artemisinin là sesquiterpene lactone có cầu endoperoxide rất bền với nhiệt độ trong môi trường trung tính cho tới 150oC Tuy nhiên nhiệt phân ở nhiệt độ cao, cầu

endoperoxide bị phá huỷ tạo ra các sản phẩm khác 2,3,4

I.2.2.2 Phản ứng với kiềm

Trong môi trường kiềm, vòng lactone của artemisinin bị mở thành nhóm phản ứng tự do của aldehyt, xeton, và các hydroperoxit, những nhóm này tiếp tục bị ngưng tụ nội phân tử tạo ra hỗn hợp sản phẩm khác nhau Khi phản ứng với kali

cacbonate trong metanol thu được este 5, peroxylacton 6, và xeto acid chưa bão hoà

7

Tuy nhiên trong môi trường NaOH, sản phẩm tạo ra là pyran 8, với hàm lượng 15%

8

I.2.2.3 Phản ứng với amoniac và amin

Torok và Ziffer đã nghiên cứu phản ứng của artemisinin với metanol amoniac

Sản phẩm trung gian đầu tiên là một hemiaceta-amide 9, hàm lượng tương đương với hai hydroxy methyl xeton 10,11 Hỗn hợp này được xử lý bằng acid sunfuric loãng tạo thành hỗn hợp sản phẩm gồm 11-azaartemisinin 12 và deoxyazaartemisinin 13 [50]

I.2.2.4 Phản ứng với acid

Artemisinin đƣợc xử lý với acid trong methanol hoặc methanol thu đƣợc hỗn hợp chất, mà cấu trúc của nó đƣợc xác định bằng phổ khối và phổ NMR, thử

nghiệm in vitro về hoạt tính chống ký sinh trùng kháng cloroquine P falciparum

cho thấy 1,2,4-trioxane (16a và 16b) có hoạt tính nhƣ artemisinin

14a R=CH3 15 16a R=CH3

b R=C2H5 b R=C2H5I.2.2.5 Phản ứng khử hoá

Với việc thay đổi các điều kiện khử, phân tử artemisinin bị khử ở các nhóm khác nhau

17

18 19

20

I.2.3 Phản ứng tạo các dẫn xuất từ artemisinin

I.2.3.1 Bán tổng hợp các dẫn xuất ete của dihydroartemisinin (DHA)

Phương pháp thông dụng nhất được sử dụng để tổng hợp các dẫn xuất ete của DHA là cho DHA tác dụng với ancol tương ứng với sự có mặt của xúc tác Xúc tác đặc hiệu thường dùng trong phản ứng này là trifloroboro eteate (BF3.)(OC2H5)2

20 21

I.2.3.2 Bán tổng hợp các dẫn xuất este của dihydroartemisinin (DHA)

Các ester của DHA thu được bằng cách cho DHA với acid cloride hoặc anhydride acid trong pyridine hoặc với các acid trong sự có mặt của dicyclohexylcarbodiimide hoặc dimethylaminopyridin

22

I.2.3.3 Bán tổng hợp các dẫn xuất carbohydrat của DHA

Các dẫn xuất carbohydrat củ DHA được tạo thành bằng các xử lý DHA với alkyl chloroformate trong sự có mặt của triethylamine trong ethylen chloride hoặc xúc tác bởi 4-dimethylaminpyridin, sản phẩm thường là các α-epime Các hợp chất này có hoạt tính lớn hơn artemether

23

I.2.3.4 Bán tổng hợp các dẫn xuất fluoralkyl ete của DHA

Tổng hợp các dẫn xuất fluoralkyl ether của DHA cũng theo nguyên tắc chung như tổng hợp các dẫn xuất ether thông thường là cho DHA tác dụng với các ancol tương ứng trong dung môi và xúc tác thích hợp

24

Hiện có các phương pháp tổng hợp sau:

Phương pháp xúc tác trifluoroboro etheate, phương pháp sử dụng xúc tác trimethylsilyl chlorid, phương pháp sử dụng phản ứng Mitsunobu Trong đó phương pháp sử dụng phản ứng Mitsunobu được cho là ưu việt hơn cả, cho hiệu suất cao và khả năng tổng hợp lựa chọn lập thể tốt

I.2.4 Hoạt tính chống sốt rét của artemisinin

I.2.4.1 Cơ chế tác động của Artemisinin-Sự hoạt hoá bởi Fe2+ của haem

Theo Richard K Hayness và các cộng sự, „sự hoạt hoá‟ của artemisinin bởi haem

đã thể hiện ngay từ giai đoạn trưởng thành của bào tử động, ở giai đoạn này ký sinh trùng sốt rét chuyển hoá haemoglobin như một nguồn amino acids trong môi trường acid Quá trình chuyển hoá giải phóng ra ferriprotoporphyrin IX (haem), những haem này sẽ trải qua quá trình dime hoá không có xúc tác của enzyme hình thành nên dạng haemozoin, một dạng không hoà tan, là chất sắc tố sốt rét ở dạng tinh thể Trên thực tế, tất cả các haem hầu như chuyển hoá thành hết haemozoin, và có rất ít

sự phân giải theo những đường hướng khác Tổng lượng sắt có trong giai đoạn

trưởng thành của bào tử động của Plasmodium falciparum, xấp xỉ 92% là nằm trong

không bào thực, và cũng, khoảng 88% thì tham gia vào sự hình thành haemozoin

Và haemozoin là loại sắt đặc biệt chỉ được xác định trong giai đoạn trưởng thành của bào tử động, haemozoin cũng được luân chuyển trong không bào thực rất lớn Dựa theo nguồn gốc hình thành của haemozoin, haem đã được nghiên cứu như chất hoạt hoá của artemisinin [C14]-artemisinin tìm thấy ở dạng liên kết với haem, hoặc

ở trong ký sinh trùng hoặc ở in vitro trong môi trường có chứa ferriprotoporphyrin

IX chloride ở pH 7,5-7,8 Đó là bằng chứng về sự hình thành một phức hợp

haem-artemisinin đã được tạo ra Điều này cũng xác nhận rằng haem phải ở trạng thái

Fe2+ để phản ứng với artemisinin, mặc dù có quan điểm cho rằng Fe2+ của haem có thể gây nên xúc tác quá trình phá huỷ artemisinin, dù cho ý này đã không được kiểm chứng Phức hợp haem-artemisinin tạo thành được tìm thấy không thể hiên độc tính với ký sinh trùng sốt rét Cũng theo một nghiên cứu khác tìm thấy rằng một lượng đáng kể [C14]-artemisinin khi được ủ với ký sinh trùng sốt rét trở thành dạng kết hợp với những dimer, và bản chất của quá trình liên kết này trong haemozoin cũng không được xem xét thêm

Về mặt nghiên cứu hoá học, Bernad Meunier và các cộng sự đã xác định được một phức hợp liên kết hoá trị giữa haem-artemisinin tách ra với hàm lượng tương đối cao khoảng 80-85% từ quá trình khử ferriprotoporphyrin IX dimethyl ester dưới điều kiện nghiêm ngặt [47] Tuy nhiên, liên quan đến quá trình hình thành của phức

hợp haem-artemisinin trong in vivo vẫn cần được xác định thêm Phổ khối nghiên

cứu của phức hợp tách ra từ quá trình ủ của artemisinin với hồng cầu bị nhiễn

Plasmodium xấp xỉ tổng khối lượng phân tử của các chất phản ứng (haem và

artemisinin) xong có rất ít sự hiểu biết về cấu trúc của chúng Một vài đường hướng liên quan đến sự phá huỷ cấu trúc phân tử artemisinin thông qua Fe2+

đưa đến sự alkyl hoá của haem đã được đưa ra bởi Bernard Meunier và các cộng sự [46] Sự alkyl hoá haem được đề xuất để thể hiện tầm quan trọng đối với hoạt tính chống sốt rét của artemisinin nói chung Điều này đã được sử dụng để làm cơ sở đánh giá mối quan hệ giữa hoạt tính chống sốt rét của các trioxanes tổng hợp và dạng cấu hình không gian của những nhóm thế bên ngoài trioxanes, và dùng để chế tạo ra một nhóm thuốc chống sốt rét được biết đến như trioxaquines

Richard Hayness và các cộng sự dựa trên ý tưởng về sự hoạt hoá của haem đối với của artemisinin như một chất chống sốt rét đã dưa ra các bước chuyển hoá diễn

ra như sau:

i-sự tương tác của artemisinin với haem ở dạng khử trong không bào thực, nơi xảy ra quá trình phá vỡ haemoglobin và sự hình thành của haemozin đã chưa bao giờ được thể hiện

ii-sự liên kết của peroxide đối với nguyên tử iron của haem-ở trạng thái Fe2+-để gây ra quá trình vận chuyển điện tử bên trong phân tử

iii-sự tạo thành của gốc tự do seco C-4 (25)

iv-sự phân cắt của ligand oxygen của gốc tự do seco C-4 đối với Fe3+ trong haem

v-sự giải phóng của gốc tự do seco C-4 (26) từ môi trường của Fe2+ haem

vi-sự di chuyển và va chạm của gốc tự do seco C-4 với những protein của ký sinh trùng

Theo quan điểm đó, quá trình vận chuyển điện tử trong nguyên tử sắt được sắp xếp xung quanh bởi các nguyên tử oxy thông qua quá trình phân cắt Dẫn đến, sự trao đổi ligand với giả thiết ligand bên ngoài (nước) cần cho sự giải phóng những gốc tự do từ haem (theo đường hướng b) thì nhanh hơn phản ứng nội phân tử giữa các gốc tự do và haem Điều này không chứng minh được khả năng tóm bắt các gốc

tự do seco C4 với cysteine, khi tại đây điễn ra quá trình khử Fe3+ haem thành Fe2+haem cần cho sự tạo thành của gốc tự do

Đường hướng khác cũng được đưa ra giải thích là do chính sự hình thành phức hợp haem-artemisinin sẽ kìm hãm sự hình thành của hemozoin hay những gốc tự do C-4 alkyl hoá những protein giàu histidine mà được giả định là xúc tác sự hình thành của hemozoin Các quá trình này sẽ tạo ra những monomer haem, mà thể hiện độc tính đối với ký sinh trùng bởi hoạt tính oxy hoá mạnh gây ra hay/hoặc sự liên kết với những protein cần thiết trong không bào thực [24]

Hình 1.1 Đường hướng tác động của artemisinin gây ra bởi ferrous haem (Fe(II)

protoporphyrin IX) dẫn đến sự tạo thành gốc tự do seco C-4 (25) và sản phẩm alkyl hoá (27) (theo con đường a) hoặc giả thiết mất gốc tự do seco C-4 (26) từ haem

(theo con đường b) để alkyl hoá protein thiết yếu của ký sinh trùng sốt rét

I.2.4.2 Cơ chế tác động của Artemisinin-Sự kìm hãm enzyme PfATP6

Artemisinin thể hiện cấu trúc tương tự đối với thapsigargin, mà là chất kìm hãm đặc hiệu enzyme sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA) Sanjeev Krishna và các cộng sự vì thế đã đưa ra giả thiết rằng khi mà hoạt động, artemisinin

tác dụng có tính đặc hiệu và chọn lọc sự kìm hãm enzyme SERCA of P falciparum

PfATP6 chí là một enzyme SERCA dạng Ca+2-ATPase có trong hệ gene của ký sinh trùng [12,52]

Hình 1.2 Vị trí liên kiết của chất kìm hãm với enzyme SERCA:

(a) So sánh chuỗi M3, M5, M7 của SERCA (b) Vị trí liên kiết của thapsigargin và artemisone trong miền SERCA

I.2.5 Hoạt tính chống ung thư của artemisinin và các dẫn xuất

Hiện nay, artemisinin đang được nghiên cứu phát triển như chất dùng trong điều trị ung thư Một trong những ưu điểm của artemisinin trong việc được lựa chọn là một chất dùng trong điều trị không những bởi độc tính đối với dòng tế bào ung thư,

mà còn thể hiện ở tính chọn lọc của nó trong việc tiêu điệt các tế bào ung thư, đồng thời nó cũng thể hiện độc tính thấp với những tế bào thường Trong một bài viết được công bố năm 1995 [27], Narendra P Singh và các cộng sự đã phát hiện rằng dihydroartemisinin có độc tính đối với những tế bào bạch cầu ở người, gấp hơn 100 lần so với độc tính đối với những tế bào lymphocytes thường Kết quả này cũng được lặp lại đối trong những tế bào ung thư vú và những tế bào vú bình thường Tuy nhiên, artemisinin và những monomer tương tự của nó thường thể hiện độc tính thấp đối với những tế bào ung thư và thời gian bán huỷ ngắn do đó không có hiệu quả trong điều trị Điều này đã thúc đẩy việc nghiên cứu ra những hợp chất mới từ artemisinin nhằm làm tăng khả năng gây độc đối với những tế bào ung thư Nhiều dạng phân tử có chứa artemisinin/ phần endoperoxide như artemisinin ở dạng dimer, artemisinin ở dạng lai hợp artemisinin-transferrin (Art-Tf) đã được phát triển với những hiệu quả trong điều trị ung thư

I.2.5.1 Artemisinin monomer

Tác dụng chống ung thư của artemisinin đã được đưa ra từ sớm bởi Herman J Woerdenbag và các cộng sự từ năm 1990 [54] Những nghiên cứu ban đần này tập trung chủ yếu vào dạng monomer tương tự artemisinin Những monomer artemisinin phổ biến (artemisinin, dihydroartemisinin, artesunate, và artemeter) đã được thử nghiệm đối với nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau Kết quả chỉ ra chúng thể hiện độc tính với những tế bào ung thư với IC50s thay đổi từ trong khoảng 10-20

µM Nhìn chung, những hợp chất artemisinin này đã thể hiện độc tính đối với những tế bào ung thư nhiều hơn là thể hiện độc tính với những tế bào thường liên quan Nhiều cơ chế phân tử đã được nghiên cứu, theo đó artemisinin tác động lên nhiều đường hướng khác nhau mà tham gia vào quá trình phát triền trong tế bào, sự nhân rộng tế bào, và quá trình chết của tế bào theo một chương trình đã định Tuy

nhiên, sự chết của tế bào theo chương trình-apoptosis do artemisinin gây ra là ảnh hưởng đưa ra phổ biến, cũng như sự phong toả trong chu trình tế bào, đặc biệt ở giai đoạn Go/G1 Bởi vậy, xuất hiện cả tế bào bị tiêu diệt và tế bào bị kìm hãm phát triển Nhưng những vị trí tác động chưa được đưa ra rõ ràng Đã có những báo cáo về màng ti thể và con đường apoptotic Cũng có những báo cáo đưa ra phương pháp tác động bên ngoài màng ti thể Sự tham gia của Fe/heme và những dạng oxy hoá hoạt động (ROS) đã được đưa ra như giả thuyết trước đó của nhóm Narendra P Singh Những nghiên cứu cũng tập trung vào đường hướng phân tử trong sự phát triển của tế bào và quá trình phát triển của tế bào ung thư Hai quá trình đã nhiều lần xuất hiện trên những báo cáo về tác động của artemisinin đó là do sự kìm hãm yếu

tố nhân NF-κB và làm giảm sự hoạt động của nhân tố phát triển VEGF Những tác động khác nhau lên những con đường khác cũng được đưa ra bao gồm: NOXA , mitogen-activated protein kinase (MAPK), hypoxia inducible factor 1α (HIFα), Wnt/β − catenin, survivin, COX, c-MYC oncoprotein, epidermal growth factor (EGF), and tumor necrosis factor α (TNFα) Từ những tác động ở cấp độ phân tử có thể giải thích hiện tượng tự huỷ-apoptotic, chống tạo mạch, chống viêm, chống di căn, ảnh hưởng kìm hãm trong chu trình tế bào của những hợp chất artemisinin Tuy nhiên, hầu hết những thay đổi của hoạt động phân tử tế bào có thể là kết quả của sự tăng lên hoạt động gốc tự do trong tế bào ung thư do phản ứng giữa artemisinin với

Fe

I.2.5.2 Những monomer khác

Tiếp đến, những hợp chất monomer cơ bản, những hợp chất tương tự artemisinin cũng đã được nghiên cứu Hợp chất deoxoartemisinin đã được nghiên cứu ở Đại học Yansei- Hàn Quốc Một nhóm deoxoartemisinin đã được tổng hợp và tìm thấy khả năng chống sốt rét mạnh hơn artemisinin Nhóm nghiên cứu Weontae Lee và các cộng sự [28] đã thử hoạt tính tế bào ung thư của deoxoartemisinin và carboxypropyldeoxoartemisinin trên các dòng tế bào ung thư Kết quả, những hợp chất này thể hiện độc tính khác nhau lên những dòng tế bào khác nhau Chúng thể hiện rằng hoạt tính chống các khối u của những hợp chất artemisinin không phụ

thuộc vào phần ưa béo và những dẫn xuất artemisinin hướng đến một protein đặc biệt trong mỗi kiểu tế bào ung thư Tuy nhiên khơng cĩ thêm thơng tin nào về giả thuyết này được đưa ra Nhĩm nghiên cứu Mankil Jung và các cộng sự [17] đã thử một dãy các mono, di, trimer của deoxoartemisinin trên các dịng tế bào ung thư Một vài hợp chất đã thể hiện hoạt tính tiêu diệt các tế bào ung thư mạnh hơn adramycin, mitomycin, và taxol Trong đĩ một trimer, đặc biệt, đã thể hiện hoạt tính mạnh Tuy nhiên, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng những dịng tế bào khác nhau cĩ phản ứng đáp lại khác nhau với những hợp chất này Sự thay đổi cĩ thể lên đến 100 lần Với những dimer, liên kết với một nhĩm amide hay một nhĩm sulfur ở trung tâm hai nhĩm ethylene cần thiết cho hoạt tính mạnh chống ung thư Hoạt tính chống tạo khối u của deoxoartemisinin ở dạng dimer cũng được nghiên cứu bởi nhĩm Paul

M O'Neill [18] và nhĩm Gary H Posner [41]

I.2.5.3 Artemisinin dimer

Nghiên cứu đầu tiên về artemisinin ở dạng dimer được đưa ra bởi Aäron C Beekman và các cộng sự vào năm 1998 [8] Trong đĩ, điểm nổi bật trong việc phát triển artemisinin ở dạng dimer được nghiên cứu bởi phịng thí nghiệm của Gary H Posner ở Đại học Johns Hopkins Artemisinin ở dạng dimer đã được thử nghiệm với rất nhiều dịng tế bào ung thư và cho hiệu quả hoặc làm chậm sự phát triển hoặc nguyên nhân gây chết tế bào-apoptosis Nhìn chung, khả năng gây độc tế bào ung thư của những dimer thì mạnh hơn dạng monomer Sự tăng hiệu quả tác động thay đổi từ 10 đến 200 lần Artemisinin ở dạng dimer đã thể hiện là hiệu quả thậm chí hơn cả những chất dùng trong điều trị, giống như doxorubicin và độc tính thấp hơn lên những tê bào thường so với những tế bào ung thư Nhĩm nghiên cứu Gary H Posner đã đưa ra chỉ số điều trị cao đối với một vài hợp chất dạng dimer mà nhĩm

đã tổng hợp được [42] In-Ho Cha và các cộng sự đã đưa ra những hợp chất deoxoartemisinin dimer và trimer cĩ hiệu quả tác động lên những tế bào ung thư hơn những monomer [33] Deoxoartemisinin trimer thậm chí cĩ tác dụng hiệu quả hơn cả pacilitaxel, 5-fluorouracil, và cisplatin lên những dịng tế bào ung thư miệng Dạng dimer artemisinin-guanidine của nhĩm nghiên cứu của Ping Gong và các

cộng sự [55] đưa ra hiệu quả tác động hơn dạng monomer của nó và có IC50s 20–60

nM đối với những tế bào ung thư ruột kết ở người HT-29 Độc tính tế bào có tính chọn lọc cao của những artemisinin dạng dimer đối với những tế bào ung thư đã làm chúng được quan tâm nhằm phát triển thành nhóm chất dùng trong điều trị ung thư Tuy nhiên cơ chế tác động của artemisinin dạng dimer vẫn chưa được biết I.2.5.4 Artemisinin liên hợp

Trong những tế bào động vật có vú, Fe được vận chuyển vào trong màng tế bào chất theo một quá trình nhập bào thông qua một thụ thể Sự liên kiết với transferrin-protein vận chuyển Fe ở màng plasma hướng đến thụ thể transferrin của bề mặt tế bào, nên gây thúc đẩy quá trình nhập bào Sự giảm pH trong nội bào là nguyên nhân giải phóng Fe từ transferrin Tế bào ung thư cần một lượng lớn Fe như là cofactor trong tổng hợp deoxyribose trước khi phân chia tế bào, chủng biểu hiện một số lượng lớn thụ thể transferrin trên bề mặt tế bào của chúng Ví dụ, tế bào ung thư vú

có nhiều gấp 5-15 lần thụ thể transferrin trên bề mặt của chúng so với những tế bào thường Nhóm nghiên cứu Narendra P Singh đã dự đoán rằng nếu artemisinin được liên kiết hoá trị với holotransferrin (transferrin vận chuyển Fe), nó sẽ được vận chuyển trong cùng một gói vào bên trong tế bào, và phản ứng với Fe trong nội màng, nơi mà Fe được giải phóng ra từ holotransferrin Điều này có thể tăng cường khả năng gây độc và tính chọn lọc của artemisinin lên những tế bào ung thư

Những nghiên cứu trước đã thể hiện transferrin là một glycoprotein Phần protein của nó thì chủ yếu tham gia liên kết với thụ thể transferrin của bề mặt tế bào, tuy nhiên phần chuỗi carbohydrate thì không tham gia vào việc liên kết với thụ thể này Transferrin có hai nhóm N-glycoside gắn trên phần Asn trong miền đầu C

Sự oxy hoá bởi periodate của chuỗi carbohydrate tạo ra nhóm aldehyde chưa hoạt động mà có thể biến đổi với một dãy các dẫn xuất hydrazine và aminoxy của artemisinin Giả sử rằng, tất cả các phần 1,2-diol bị oxy hoá tạo ra nhóm aldehyde, nhóm nghiên cứu Narendra P Singh đã ước tính rằng có ít nhất 10 dẫn xuất artemisinin có thể gắn trên một phân tử transferrin Theo đó, nhóm đã gắn phân tử acid artelinic- phân tử tương tự artemisinin đối với phần gycosylate của

holotransferrin bằng một quá trình tương đối đơn giản Holotransferrin đầu tiên được xử lý với NaIO4 để oxy hoá chuỗi N-glycoside tạo ra nhóm aldehyde trên bề mặt Artelinic acid hydrazide được cho phản ứng với holotransferrin đã bị oxy hoá tạo ra dạng liên hợp hoá trị (Art-Tf) Trung bình, nhiều hơn 16 phần artelinic acid

có thể gắn trên một phân tử transferrin

Sử dụng phương pháp „Trojan Horse‟, những loại thuốc dùng trong điều trị đã được gắn nhãn đối vởi phân tử transferrin cho sự vận chuyển đặc hiệu cho tế bào ung thư Tuy nhiên, việc gắn đối với phân tử artemisinin cần nghiên cứu phát triển thêm Trong trường hợp này, artemisinin là một loại siêu thuốc, và trở nên hoạt động sau khi nó được vận chuyển vào bên trong tế bào khi Fe giải phóng từ transferrin trong môi trường acid của nội bào Nhóm Narendra P Singh và các cộng

sự [29] thử nghiệm đầu tiên Art-Tf với dòng tế bào bạch cầu người (Molt-4) và dòng tế bào lymphocytes của người thường và so sánh nó với sự ảnh hưởng của dihydroartemisinin Kết quả cho thấy Art-Tf mạnh gần gấp hai lần so với hiệu quả tiêu điệt các tế bào ung thư Tuy nhiên, độc tính của nó với dòng tế bào lymphocytes thường thì thấp hơn (IC50s: Molt-4-Tagged-compound 0,98 μM; Molt-4-DHA 1,64 μM; lymphocyte-tagged compound 33 mM; lymphocyte-DHA 58,4 μM) Việc tăng tỉ lệ độc tính đối với tế bào ung thư so với tế bào thường được khảo sát thêm bởi rất nhiều thí nghiệm của những nhóm nghiên cứu độc lập Họ thử Art-Tf lên trên dòng tế bào ung thư vú ở người (MCF-7) và dòng tế bào bình thường (NHB) (IC50s: MCF-7/ART-Tf 0,08 μM; MCF-7/DHA 0,20 μM; HNB/ART-Tf 22,89 μM; HNB/DHA 0,69 μM) Vì thế, theo những dữ liệu nhóm Narendra P Singh và cộng sự thử nghiệm trên dòng tế bào bạch cầu ở người và lyphocytes, những nhà nghiêm cứu đã chỉ ra rằng Art-Tf thì thể hiện độc tính tế bào

và tính chọn lọc trong việc tiêu diệt các tế bào ung thư hơn các tế bào vú bình thường Một nghiên cứu khác cũng đã đưa ra sự khác nhau trong siêu cấu trúc màng plasma mà được xử lý với Art-Tf và dihydroartemisinin Những lỗ lớn đã được quan sát trên màng sau khi xử lý với Art-Tf, tuy nhiên những lỗ nhỏ có hình dạng không theo quy tắc đã được quan sát với màng xử lý dihydroartemisinin

Một số nghiên cứu đã được tiến hành để khoả sát cơ chế tác động của Art-Tf Trong dòng tế bào ung thư tiền liệt tuyến (DU-145), Art-Tf gây chết tế bào theo chu trình xác định thông qua sự hoạt hoá theo con đường tự phân huỷ thuộc ty thể Sự

giải phóng cytochrome c từ ty thể, sự phân cắt của procaspase-9 và caspase-3, sự

phân giải –PARP được quan sát Hơn nữa, độc tính còn liên quan đến số phần phân

tử được gắn và sự phụ thuộc của nồng độ tế bào trong môi trường (hiệu quả tác động của dihydroartemisinin giảm với sự tăng của nồng độ tế bào) Gần đây, một nghiên cứu đã tìm thấy rằng phân tử transferrin được gắn artemisinin ở dạng dimer thì hiệu quả tác dụng tiêu diệt tế bào ung thư vú nhiều hơn những phân tử transferrin được gắn artemisinin ở dạng monomer

Trong nghiên cứu khác đối với sự vận chuyển đặc hiệu của artemisinin trong những tế bào ung thư, nhóm nghiên cứu Narendra P Singh đã thực hiện liên kiết hoá trị artemisinin với đoạn pepitide HAIYPRH mà hướng đến thụ thể transferrin bởi liên kết với một khoang trên bề mặt của thụ thể transferrin Điều này cho phép artemisinin gắn kiết cùng với thụ thể mà liên kiết với transferrin Một (ART1-peptide) và hai (ART2-peptide) phần artemisinin đã được gắn lên phân tử peptide Đạng liên hợp artemisinin-peptide thể hiện hoạt tính chống ung thư hiệu quả đối với dòng tế bào bạch cầu Molt-4 với sự chọn lọc tế bào ung thư/tế bào thường được cải thiện đáng kể ( giá trị IC50s của ART-peptide và ART2-peptide lên dòng tế bào Molt-4 là 1,06±0,08 và 0,61±0,05 μM ở 72 h, tương ứng) ART2-peptide thì hiệu quả hơn dáng kể so với ART-peptide, điều này phù hợp với hoạt tính chống ung thư mạnh của các dẫn xuât dimer artemisinin với các dẫn xuât monomer artemisinin [30]

I.3 CHUYỂN HOÁ SINH HỌC CỦA ARTEMISININ VÀ CÁC DẪN XUẤT Artemisinin là một chất có hoạt tính chống sốt rét quan trọng nhất được sử dụng

và có tác dụng hiệu quả của thuốc đối với hầu hết những loài P falciparum kháng

cloroquine Tuy nhiên, có vấn đề liên quan đến artemisinin, là sự hoà tan kém trong nước và thậm trí là cả trong dầu, điều này đã đưa đến việc thúc đẩy các nhà khoa học tìm ra những dẫn xuất artemisinin mới, một vài loại thuốc dẫn xuất artemisinin

được báo cáo thể hiện độc tính thần kinh đối với một số loài động vật khi tiêm Cùng với sự phát triền kháng thuốc của một số loại ký sinh trùng sốt rét đối với

một số loại thuốc sử dụng hiện nay, bao gồm sự kháng thuốc của loài P vivax đối

với chloroquine và primaquine trong khu vực New Guinea, Asia, Africa [43], và sự

kháng thuốc của loài P falciparum đối với artemisinin ở khu vực Combodia,

Thailand, và một vài khu vực lân cận [9,32,34,53] cũng là một lý do quan trọng khác đối với sự cần thiết phát triển ra những loại thuốc chống sốt rét mới

Một số hợp chất tương tự artemisinin có thể thu được bởi quá trình bán tổng hợp, ví dụ, artemisinin có thể dễ dàng bị khử bởi phản ứng hoá học tạo thành chất

có hiệu quả hơn, nhưng có độc tính thần kinh, là dihydroartemisinin [5] Tuy nhiên, một vài thay đổi về mặt cấu trúc trong phân tử artemisinin vẫn còn thách thức lớn đối với những nhà hoá học bởi những khó khăn trong việc đưa ra những nhóm chức riêng biệt bằng con đường tổng hợp hoá học thông thường

Chuyển hoá hoá sinh của artemisinin đã được định hướng bởi những nghiên cứu liên quan đến cấu trúc và hoạt tính về lượng, để đưa ra những biến đổi của phân tử artemisinin mà làm tăng hoạt tính chống sốt rét [6] Mặc dù rất nhiều hợp chất terpenoid chuyển đổi theo con đường hoá sinh tạo ra nhiều sản phẩm trao đổi chất với hoạt tính chống sốt rết thấp hơn, những hợp chất không có hoạt tính có thể chuyển đổi thành những hợp chất có hoạt tính bởi những chuyển đổi bởi những chủng vi sinh vật

I.3.1 Chuyển hoá sinh học của artemisinin

Nhóm nghiên cứu của Charles D Hufford và cộng sự công bố những kết quả đầu

tiên về chuyển hoá sinh học artemisinin bởi việc sử dụng vi khuẩn Nocardia

corallina ATCC 19070 chuyển hoá artemisinin thành deoxyartemisinin (28), mà

thiếu mất hoạt tính chống sốt rét, trong 14 ngày Chủng Penicillium chrysogenum

ATCC 9480 chuyển hoá artemisinin thành 2 hợp chất mất hoạt tính chống sốt rét là

deoxyartemisinin (28, hiệu suất 1,0%) và 4α- hydroxydeoxyartemisinin (30, hiệu

suất 3,6%) trong 13 ngày [25]

28 (1%)

29 (3,6%)

Sơ đồ 1.1 Chuyển hoá artemisinin của chủng Penicillium chrysogenum ATCC

9480

Kết quả tương tự thu được bởi nhóm Suchita Srivastava và cộng sự khi dùng

cảnh trường của chủng Aspergillus flavus trong 2 ngày chuyển hoá artemisinin

thành deoxyartemisinin với hiệu suất 30,5% [48]

28 (30,5%)

Sơ đồ 1.2 Chuyển hoá artemisinin của chủng Nocardia corallina ATCC 19070 và

chủng Aspergillus flavus

John S Williamson và các cộng sự trong nghiên cứu về chuyển hoá sinh học

artemisinin bởi các chủng vi sinh vật đã đưa ra một số kết quả đáng quan tâm như

loài nấm Cunninghamella elegans ATCC 9245 chuyển hoá artemisinin cho 4 sản

phẩm khác nhau là 4α-hydroxyartemisinin (29, hiệu suất 5,4%),

7β-hydroxy-9α-artemisinin (30, hiệu suất 6,0%), 7β-hydroxyartemisinin (31, hiệu suất 21,0%), 6β-hydroxyartemisinin (32, hiệu suất 6,5%) [37]

Ba chủng Umbelopsis ramanniana (Mucor ramannianus) hydroxy hoá artemisinin

trong 14 ngày cho các sản phẩm 7β-hydroxyartemisinin (31, hiệu suất 51–88%),

6β-hydroxyartemisinin (32, hiệu suất 1–51%), và hai dạng đồng phân isomer khác [39]

Chủng Aspergillus niger VKM F-1119 hydroxy hoá artemisinin cho các sản phẩm

tương ứng là 5β-hydroxyartemisinin (hiệu suất 80%) và 7β-hydroxyartemisinin (31,

hiệu suất 19%) [40]

Dean Guoa và các cộng sự đã sử dụng chủng Cunninghamella echinulata AS 3.3400 và chủng Aspergillus niger AS 3.795 trong 4 ngày chuyển hoá artemisinin

thành các sản phẩm tương ứng 6β-hydroxyartemisinin (32, hiệu suất 50%) và

4α-hydroxydeoxyartemisinin (29, hiệu suất 15%) [56] Chủng Mucor

polymorphosporus AS 3.3443 tạo thành 7β-hydroxyartemisinin (31) và hai sản

khuẩn Streptomyces griseus ATCC

13273 cũng oxy hoá artemisinin tạo ra

34

35

Sơ đồ 1.5 Chuyển hoá artemisinin của chủng Penicillium simplicissimum

I.3.2 Chuyển hoá sinh học của dẫn xuất artemisinin

Một vài sequiterpenoid tự nhiên khác đã đƣợc khảo sát cho khả năng chuyển hoá

sinh học Arteanuin B (36), và những terpenoid khác đƣợc tạo ra từ Artemisia

annua khi đƣợc chuyển hoá bởi loài nấm Aspergillus flavipes và Beauveria bassiana cho ba sản phẩm khác nhau [11] Dịch chiết Microbacterium trichotecenolyticum chuyển hoá arteannuin B thành artemisinin [51]

Artediffusin (37), sequiterpene lactone gần đây đƣợc tìm ra từ Artemisia diffusa

[45], có hoạt tính chống sốt rét và cũng có khả năng chuyển hoá sinh học

Một số dẫn xuất của artemisinin cũng đƣợc quan tâm nghiên cứu để tìm kiến khả

năng chuyển hoá bởi các loài vi sinh vật.Ví dụ U ramanniana 1839 chuyển hoá

thuốc chống sốt rét dạng bán tổng hợp 10-deoxoartemisinin (38) thành dạng mất

hoạt tính 4α-hydroxydeoxy-10-deoxoartemisinin (40, hiệu suất 7,0%) và một phẩn

ở dạng hoạt động 7β-hydroxy-10-deoxoartemisinin (41, hiệu suất 10,9%) trong 14

ngày [21] John S Williamson và các cộng sự [31] đã tối ƣu hoá những điều kiện và

thu đƣợc sản phẩm 41 đạt hiệu suất 45%, mà với hoạt tính chống sốt rét thấp có thẻ

sử dụng cho việc chuyển hoá thêm, trong 14 ngày Aspergillus niger hydroxy hoá

10-deoxoartemisinin (38) thành 7β-hydroxy-10-deoxoartemisinin (41, hiệu suất

69%) và 15-hydroxy-10-deoxoartemisinin ( hiệu suất 26%) [36] Cunninghamella

elegans ATCC 9245 chuyển hoá 10-deoxoartemisinin (38) cho 3 sản phẩm là các dẫn xuât dạng hydroxy hoá 5β-hydroxy-10-deoxoartemisinin (39, hiệu suất 8,8%), 4α-hydroxydeoxy-10-deoxoartemisinin (40, hiệu suất 4,6%) và 7β-hydroxy-10

deoxoartemisinin (41, hiệu suất 83,9%) [38]

42 43 44

I.4 ĐẶC ĐIỂM CHỦNG VI SINH VẬT PENICILLIUM CITRINUM

Penicillium citrinum là một loài nấm sợi xuất hiện phổ biến, và có sự phân bố rộng

khắp

I.4.1 Đặc điểm hình thái

Chúng có một số đặc điểm như sau: là nhóm có cấu tạo nhân chuẩn, cấu trúc tế bào tính từ ngoài vào trong gồm: thành tế bào, màng sinh chất, chất nguyên sinh và nhân phân hoá Tế bào nấm không có diệp lục tố

Hình 1.3 Đặc điểm hình thái chủng Penicillium citrinum theo Hoog, G.S de 2000 Atlas of clinical fungi

Hình 1.4 Các dạng khuẩn lạc P citrinum nuôi cấy trên môi trường agar

Hệ sợi nấm gồm khuẩn ti cơ chất và khuẩn ti khí sinh Trên khuẩn ti khí sinh sẽ hình thành nên cơ quan sinh sản, đó chính là cuống sinh bào tử Từ cuống sinh bào

tử sẽ hình thành nên bào tử là một tế bào sinh sản, thường có dạng hình cầu Khi bào tử được phát tán từ cơ thể mẹ đến nguồn cơ chất thích hợp nó sẽ nảy mầm, phát triển theo cả 3 chiều thành hệ sợi nấm mới Sau vài ngày, số lượng sợi nấm tăng lên rất nhiều tạo thành một đám Hệ sợi phát triển đến giai đoạn này gọi là khuẩn lạc

Ở nấm sợi tồn tại hai dạng sinh sản: là sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính

Đặc điểm sinh lý-sinh hoá

Quá trình sinh trưởng, phát triển và phân bố của nấm chịu tác động vào các yếu tố môi trường xung quanh như nhiệt độ, pH, nguồn dinh dưỡng cacbon, nitơ, oxy

I.4.2 Chuyển hoá của chủng Penicillium citrinum

Một số kết quả nghiên cứu về Penicillium citrinum

P citrinum được sử dụng trong quá trình lên men để tạo ra sản phẩm như

compactin, pravastalin – nhóm thuốc chống tăng lipid máu, do kìm hãm quá trình sinh tổng hợp cholesterol dẫn đến làm giảm hàm lượng cholesterol trong gan, kích thích quá trình tổng hợp thụ thể lipoprotein tỉ trọng thấp, làm tăng quá quá trình vận chuyển LDL từ máu [7,20]

In-Jung Lee và các cộng sự đã đưa ra kết quả nghiên cứu về môi trường dạng lỏng

chứa P citrinum có khả năng thúc đẩy sự phát triển của cây như chiều dài rễ, hàm

lượng clorophyl [19]

Nhóm nghiên cứu của Tingzhou Z đã sử dụng P citrinum được hoàn tan trong nước với nồng độ thay đổi 76-304 mgGE/L rồi phun lên lá của cây Paris polyphylla, kết quả thu được là hàm lượng steroid saponin trong cây Paris polyphylla đã tăng lên

đáng kể [16]

P citrinum có khả năng chuyến hoá một số cơ chất, như chuyển hoá caffein (45)

thành nhóm chất: paraxanthine (46), theobromine (47), theophyline (48), làm tăng lên cảm quan, chất lượng sản phẩm [49]

45

Sơ đồ 1.6 Chuyển hoá caffein của chủng Penicillium citrinum

P citrinum có khả năng chuyển hoá các hợp chất steroids nhƣ:

3β-acetoxypregna-5,16-diene-20-one (49) cho một hỗn hợp các chất gồm: 5,16(17)-dien-20-one (50); 3β,7β,11α-trihydroxy-pregn-5,16(17)-dien-20-one (51); 3β-hydroxy-7α-methoxy-pregn-5,16(17)-dien-20-one (52) và chất đã biết 3β,7α-

3β,7β-dihydroxy-pregn-dihydroxy-pregn-5,16(17)-dien-20-one (53) [13]