chuyển hoá artemisinin từ thanh hao hoa vàng (artemisia annua l ) bằng phương pháp sinh học để tạo thành các dẫn xuất có hoạt tính sinh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - - PHẠM QUANG DƯƠNG CHUYỂN HOÁ ARTEMISININ TỪ THANH HAO HOA VÀNG (ARTEMISIA ANNUA L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC ĐỂ TẠO THÀNH CÁC DẪN XUẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC KỸ THUẬT HOÁ HỌC HÀ NỘI – 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - - PHẠM QUANG DƯƠNG CHUYỂN HOÁ ARTEMISININ TỪ THANH HAO HOA VÀNG (ARTEMISIA ANNUA L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC ĐỂ TẠO THÀNH CÁC DẪN XUẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: KỸ THUẬT HOÁ HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC KỸ THUẬT HOÁ HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS TS VŨ ĐÌNH HOÀNG PGS TS PHẠM GIA ĐIỀN CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG : PGS.TS HOÀNG XUÂN TIẾN HÀ NỘI – 2014 LỜI CAM ĐOAN Luận văn Thạc sĩ khoa học chuyên ngành Kỹ thuật Hóa học với đề tài “Chuyển hóa artemisinin từ hao hoa vàng (Artemisia annua L.) phương pháp sinh học để tạo thành dẫn xuất có hoạt tính sinh học’’ đƣợc hoàn thành dƣới hƣớng dẫn khoa học PGS.TS Vũ Đình Hoàng – Bộ môn CN Hóa dƣợc BVTV – Viện Kỹ thuật Hóa học – Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội PGS.TS Phạm Gia Điền - Phòng CN Các chất có hoạt tính sinh học – Viện Hoá học – Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Tôi xin cam đoan số liệu, kết luận nghiên cứu đƣợc trình bày luận văn trung thực không chép nội dung từ luận văn thạc sĩ hay tiến sĩ khác MỤC LỤC Trang PHẦN I: TỔNG QUAN I.1.TÌNH HÌNH SỐT RÉT Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI I.1.1 Tình hình sốt rét giới I.1.2 Tình hình sốt rét Việt Nam 10 I.1.3 Các hoạt chất có hoạt tính sinh học điều trị sốt rét 10 I.2 CHUYỂN HOÁ HOÁ HỌC CỦA ARTEMISININ 11 I.2.1 Artemisinin 11 I.2.2 Tính chất hoá học artemisinin 12 I.2.2.1 Phản ứng nhiệt phân 12 I.2.2.2 Phản ứng với kiềm 13 I.2.2.3 Phản ứng với amoniac amin 13 I.2.2.4 Phản ứng với acid .14 I.2.2.5 Phản ứng khử hoá .14 I.2.3 Phản ứng tạo dẫn xuất từ artemisinin 15 I.2.3.1 Bán tổng hợp dẫn xuất ete dihydroartemisinin (DHA) 15 I.2.3.2 Bán tổng hợp dẫn xuất este dihydroartemisinin (DHA) 16 I.2.3.3 Bán tổng hợp dẫn xuất carbohydrat DHA .16 I.2.3.4 Bán tổng hợp dẫn xuất fluoralkyl ete DHA 16 I.2.4 Hoạt tính chống sốt rét artemisinin 17 I.2.4.1 Cơ chế tác động Artemisinin-Sự hoạt hoá Fe2+ haem .17 I.2.4.2 Cơ chế tác động Artemisinin-Sự kìm hãm enzyme PfATP6 .20 I.2.5 Hoạt tính chống ung thƣ artemisinin dẫn xuất 21 I.2.5.1 Artemisinin monomer 21 I.2.5.2 Những monomer khác 22 I.2.5.3 Artemisinin dimer .23 I.2.5.4 Artemisinin liên hợp 24 I.3 CHUYỂN HOÁ SINH HỌC CỦA ARTEMISININ VÀ CÁC DẪN XUẤT 26 I.3.1 Chuyển hoá sinh học artemisinin .27 I.3.2 Chuyển hoá sinh học dẫn xuất artemisinin .31 I.4 ĐẶC ĐIỂM CHỦNG VI SINH VẬT PENICILLIUM CITRINUM 34 I.4.1 Đặc điểm hình thái 34 I.4.2 Chuyển hoá chủng Penicillium citrinum 35 PHẦN II: VẬT LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .38 II.1 VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 38 II.1.1 Hoá chất, Chủng môi trƣờng vi sinh vật .38 II.1.2 Dụng cụ, thiết bị 39 II.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 II.2.1 Phƣơng pháp lên men 39 II.2.2 Phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng 40 II.2.3 Phƣơng pháp sắc kí cột 41 II.2.4 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 43 II.2.5 Phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học 45 PHẦN III: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 46 III.1 THỰC NGHIỆM 46 III.1.1 Chuẩn bị dịch lên men 46 III.1.2 Lên men thực chuyển hoá: .46 III.1.3 Tách sản phẩm 47 III.2 KẾT QUẢ .49 III.2.1 Xác định cấu trúc hoá học sản phẩm M1 .49 III.2.2 Số liệu phổ 1H, 13C NMR 4α-hydroxydeoxyartemisinin 50 III.2.3 Thử hoạt tính sinh học .53 III.2.3.1 Pha loãng mẫu thử: 53 III.2.3.2 Thử hoạt tính 53 III.2.3.3 Chất tham khảo 53 III.3 THẢO LUẬN 55 PHẦN IV: KẾT LUẬN .56 PHẦN V: TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC 63 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Vũ Đình Hoàng - Bộ môn CN Hóa dƣợc BVTV – Viện Kỹ thuật Hóa học – Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội tận tình dẫn suốt trình xây dựng đề cƣơng hoàn thành luận văn ThS Bá Thị Châm Phòng Hoá sinh ứng dụng – Viện Hoá học – Viện Hàn Lâm Khoa Học Công Nghệ Việt Nam cung cấp chủng vi sinh vật, trang thiết bị nhƣ hƣớng dẫn trình thực thí nghiệm Tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Phạm Gia Điền các anh, chị Phòng CN Các chất có hoạt tính sinh học – Viện Hoá học – Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam động viên, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho thời gian thực luận văn Nhân dịp này, xin cảm ơn tới thầy giáo, cô giáo đặc biệt thầy cô thuộc Viện Kỹ thuật Hóa Học trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội dạy cho suốt trình học tập Tôi bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, ngƣời thân giúp đỡ, động viên suốt thời gian học tập thời gian làm luận văn Hà nội, ngày tháng năm 2014 Học viên Phạm Quang Dƣơng DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN IR: Infrared Spectroscopy EI – MS: Electron Impact Mass Spectroscopy H NMR: 1H -Nuclear Magnetic Resonance 13 C NMR: 13C - Nuclear Magnetic Resonance HMQC: Heteronuclear Multiple - Quantum Coherence HMBC: Heteronuclear multiple - Bond Correlation DEPT: Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer TLC: Thin layer chromatography EtOAc: Ethyl acetate UV: ultraviolet δ(ppm): Độ dịch chuyển hóa học (parts per million) J(Hz): Hằng số tƣơng tác (Hertz) br: broad singlet s: singlet d: doublet dd: double doublet t: triplet MIC (Minimum Inhibitory Concentration): Nồng độ ức chế tối thiểu IC50 (The half maximal Inhibitory Concentration): Nồng độ ức chế 50% MBC (Minimum Bactericidal Concentration): Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu DANH MỤC CÁC HÌNH , SƠ ĐỒ VÀ BẢNG Trang Hình 1.1 Đƣờng hƣớng tác động artemisinin gây ferrous haem (Fe(II) protoporphyrin IX)………………………………………………………………… 20 Hình 1.2 Vị trí liên kiết chất kìm hãm thapsigargin artemisone enzyme SERCA…………………………………………………………………… 20 Sơ đồ 1.1 Chuyển hoá artemisinin chủng Penicillium chrysogenum ATCC 9480……………………………………………………………………………… 28 Sơ đồ 1.2 Chuyển hoá artemisinin chủng Nocardia corallina ATCC 19070 chủng Aspergillus flavus……………………………………………………… 28 Sơ đồ 1.3 Chuyển hoá artemisinin chủng Cunninghamella elegans ATCC 9245……………………………………………………………………………… 29 Sơ đồ 1.4 Chuyển hoá artemisinin chủng Cunninghamella echinulata AS 3.3400 chủng Aspergillus niger AS 3.795……………………………………… 30 Sơ đồ 1.5 Chuyển hoá artemisinin chủng Penicillium simplicissimum……… 31 Hình 1.3 Đăc điểm hình thái chủng Penicillium citrinum………………… …… 34 Hình 1.4 Các dạng khuẩn lạc Penicillium citrinum nuôi cấy môi trƣờng agar………………………………………………………………………………… 34 Sơ đồ 1.6 Chuyển hoá caffein chủng Penicillium citrinum………………… 36 Sơ đồ 1.7 Chuyển hoá 3β-acetoxypregna-5,16 diene-20-one chủng Penicillium citrinum……………………………………………………………………… 37 Hình 2.1 Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng……………………………………………… 40 Hình 2.2 Phƣơng pháp sắc kí cột………………………………………………… 43 Hình 3.1 Kết theo dõi dịch lên men sắc ký lớp mỏng…………… 47 BẢNG 3.1: Hệ dung môi dùng để phân lập chất…………………………… 48 BẢNG 3.2: Độ dịch chuyển hoá học proton phổ 1H NMR artemisinin 4α-hydroxydeoxyartemisinin ……………………………………… 51 BẢNG 3.3: Độ dịch chuyển hoá học cacbon phổ 13 C NMR artemisinin 4α-hydroxydeoxyartemisinin ……………………………………… 52 BẢNG 3.4: Kết thử hoạt tính kháng chủng vi sinh vật kiểm định artemisinin 4α-hydroxydeoxyartemisinin……………………………………… 54 Phụ lục 2: Phổ 1H NMR giãn rộng M1 65 Phụ lục 3: Phổ 1H NMR giãn rộng M1 66 Phụ lục 4: Phổ 13C NMR M1 67 Phụ lục 5: Phổ 13C NMR giãn rộng M1 68 Phụ lục 6: Phổ DEPT M1 69 Phụ lục 7: Phổ DEPT giãn rộng M1 70 Phụ lục 8: Phổ HMBC M1 71 Phụ lục 9: Phổ HMBC giãn rộng M1 72 Phụ lục 10: Phổ HMBC giãn rộng M1 73 Phụ lục 11: Phổ HSQC M1 74 Phụ lục 12: Phổ giãn rộng HSQC M1 75 Phụ luc 13 - TỔNG HỢP CHỦNG VI SINH VẬT CHUYỂN HOÁ ARTEMISININ VÀ CÁC CƠ CHẤT CHO CÁC DẪN XUẤT HYDROXY HOÁ Thời Chủng vi sinh vật Cơ chất Sản phẩm chuyển hoá hoá sinh học gian Hiệu nuôi suất cấy % (ngày) Vi khuẩn Nocardia corallina Hoạt tính chống Tài liệu tham khảo sốt rét Artemisinin deoxyartemisinin 14 24% - [25] Artemisinin deoxyartemisinin 30,5% - [48] 7β-hydroxy-9α-artemisinin 6,0% + 4α-hydroxyartemisinin 5,4% - 7β-hydroxyartemisinin 21,0% + 6β-hydroxyartemisinin 6,5% + ATCC 19070 Aspergillus flavus Cunninghamella elegans ATCC 9245 Artemisinin 76 [37] - Penicillium chrysogenum ATCC Artemisinin 9480 deoxyartemisinin 4α-hydroxydeoxyartemisinin 13 1% 3,6% - [25] Cunninghamella echinulata Artemisinin AS 3.3400 6β-hydroxyartemisinin 4α-hydroxydeoxyartemisinin 50% + 15% - [56] Aspergillus niger AS 3.795 Mucor polymorphosporus Artemisinin 7β-hydroxyartemisinin + [57] AS 3.3443 Umbelopsis ramaniana (Mucor Artemisinin 7β-hydroxyartemisinin 6β-hydroxyartemisinin ramannianus) 77 5114 88% 1-51% + + [39] Aspergillus niger VKM F-1119 Streptomyces griseus ATCC 13273 Penicillium simplicissimun Aspergillus flavipes Beauveria bassiana Microbacterium trichotecenolyticum Artemisinin 5β-hydroxyartemisinin 80% + 7β-hydroxyartemisinin 19% + 12,5% + [26] + [14] Artemisinin Artemisinin artemisitone 3,5 4β-acetoxy and 4α-hydroxy artemisinin arteannuin B [11] arteannuin B artemisinin + 4α-hydroxydeoxy-10U ramanniana 1893 10-deoxyartemisinin deoxyartemisinin 7β-hydroxy10deoxyartemisinin 7β-hydroxy-10- Aspergillus niger 10-deoxyartemisinin [40] deoxyartemisinin 15-hydroxy-10deoxyartemisin 78 7% + 10,9% + 69% + 14 [51] [21] [36] 26% + 5β-hydroxy-10deoxyartemisin Cunninghamella elegans ATCC 9245 10-deoxyartemisinin 4α-hydroxy-10deoxyartemisin 7β-hydroxy-10deoxyartemisin (-): hoạt tính sốt rét, (+): thể hoạt tính sốt rét 79 8,8% + 4,6% + 83,9% + [38] [...]... nghốo, lc hu, v l mt cn tr ln i vi phỏt trin kinh t St rột l mt trong nhng bnh truyn nhim ph bin nht v l vn rt nghiờm trng i vi sc kho cng ng Bnh gõy ra bi ký sinh trựng protozoa thuc chi Plasmodium Chi ny cú bn loi lm con ngi nhim bnh Nguy him hn c l Plasmodium falciparum v Plasmodium vivax Hai loi cũn li (Plasmodium ovale, Plasmodium malariae) cng gõy bnh nhng ớt t vong hn Nhúm cỏc loi Plasmodium... v chng Aspergillus flavus John S Williamson v cỏc cng s trong nghiờn cu v chuyn hoỏ sinh hc artemisinin bi cỏc chng vi sinh vt ó a ra mt s kt qu ỏng quan tõm nh loi nm Cunninghamella elegans ATCC 9245 chuyn hoỏ artemisinin cho 4 sn phm khỏc nhau l 4-hydroxyartemisinin 28 (29, hiu sut 5,4 %), 7-hydroxy-9 -artemisinin (30, hiu sut 6,0 %), 7-hydroxyartemisinin (31, hiu sut 21,0 %), 6-hydroxyartemisinin (32,... (3R,5aS,6R,8aS,9R,12S,12aR)octahydro-3,6,9-trimethyl-3,12-epoxy-12H-pyrano[4,3-j]-1,2-benzodioxepin10(3H)-one, c chit tỏch t cõy thanh hao hoa vng Artemisia annua L thuc h cỳc Asteraceae [23] Phng phỏp phõn lp artemisinin ln u tiờn c cụng b bi Klayman v cỏc cng s, trong phng phỏp ny l thanh hao khụ c chit bng ete du ho, dch chit c cụ c ri ho tan trong chloroform, b xung thờm acetonitril kt ta cỏc cht tr ca cõy nh ng v sỏp Sc ký cn cụ trong silicagel vi h dung mụi ra gii cloroform/ethyl acetate,... sut 6,5 %) [37] 29 (5,4 %) 30 (6,0 %) 31 (21,0 %) 32 (6,5 %) S 1.3 Chuyn hoỏ artemisinin ca chng Cunninghamella elegans ATCC 9245 29 Ba chng Umbelopsis ramanniana (Mucor ramannianus) hydroxy hoỏ artemisinin trong 14 ngy cho cỏc sn phm 7-hydroxyartemisinin (31, hiu sut 5188 %), 6hydroxyartemisinin (32, hiu sut 151 %), v hai dng ng phõn isomer khỏc [39] Chng Aspergillus niger VKM F-1119 hydroxy hoỏ artemisinin. ..T VN Artemisinin l mt sesquiterpene cú cu endoperoxide c phõn lp t cõy Thanh hoa hoa vng (Artemisia annua L. ) c trng ph bin Vit Nam v mt s nc khỏc trờn th gii nh: Trung Quc, n Artemisinin l mt cht cú ph hot tớnh sinh hc rng, nh hot tớnh: chng ung th, hot tớnh chng khun, hot tớnh chng st rột Trong ú, artemisinin c s dng ph bin iu tr bnh st rột gõy ra bi loi Plasmodium falciparum khỏng cloroquine,... (Fe(II) protoporphyrin IX) dn n s to thnh gc t do seco C-4 (2 5) v sn phm alkyl hoỏ (2 7) (theo con ng a) hoc gi thit mt gc t do seco C-4 (2 6) t haem (theo con ng b) alkyl hoỏ protein thit yu ca ký sinh trựng st rột I.2.4.2 C ch tỏc ng ca Artemisinin- S kỡm hóm enzyme PfATP6 Artemisinin th hin cu trỳc tng t i vi thapsigargin, m l cht kỡm hóm c hiu enzyme sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA) Sanjeev... 15-hydroxy-10-deoxoartemisinin ( hiu sut 26 %) [36] Cunninghamella elegans ATCC 9245 chuyn hoỏ 10-deoxoartemisinin (3 8) cho 3 sn phm l cỏc dn xuõt dng hydroxy hoỏ 5-hydroxy-10-deoxoartemisinin (39, hiu sut 8,8 %), 4-hydroxydeoxy-10-deoxoartemisinin (40, hiu sut 4,6 %) v 7-hydroxy-10 deoxoartemisinin (41, hiu sut 83,9 %) [38] 38 39 41 40 Artemisitene (4 2) c chuyn hoỏ bi chng A niger NRRL 599 thnh 9artemisinin (4 3), 7-hydroxydeoxy-9 -artemisinin. .. 1,0 %) v 4- hydroxydeoxyartemisinin (30, hiu sut 3,6 %) trong 13 ngy [25] 27 28 (1 %) 29 (3,6 %) S 1.1 Chuyn hoỏ artemisinin ca chng Penicillium chrysogenum ATCC 9480 Kt qu tng t thu c bi nhúm Suchita Srivastava v cng s khi dựng cnh trng ca chng Aspergillus flavus trong 2 ngy chuyn hoỏ artemisinin thnh deoxyartemisinin vi hiu sut 30,5% [48] 28 (30,5 %) S 1.2 Chuyn hoỏ artemisinin ca chng Nocardia corallina... tng ng l 5-hydroxyartemisinin (hiu sut 80 %) v 7-hydroxyartemisinin (31, hiu sut 19 %) [40] Dean Guoa v cỏc cng s ó s dng chng Cunninghamella echinulata AS 3.3400 v chng Aspergillus niger AS 3.795 trong 4 ngy chuyn hoỏ artemisinin thnh cỏc sn phm tng ng 6-hydroxyartemisinin (32, hiu sut 50 %) v 4hydroxydeoxyartemisinin (29, hiu sut 15 %) [56] Chng Mucor polymorphosporus AS 3.3443 to thnh 7-hydroxyartemisinin... simplicissimum bin i artemisinin to ra sn phm l nhng dn xut 4acetoxy and 4-hydroxy ca artemisinin [14] 30 34 35 S 1.5 Chuyn hoỏ artemisinin ca chng Penicillium simplicissimum I.3.2 Chuyn hoỏ sinh hc ca dn xut artemisinin Mt vi sequiterpenoid t nhiờn khỏc ó c kho sỏt cho kh nng chuyn hoỏ sinh hc Arteanuin B (3 6), v nhng terpenoid khỏc c to ra t Artemisia annua khi c chuyn hoỏ bi loi nm Aspergillus flavipes