Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của một số dẫn chất 5 (3 halogenoaryliden) 2 thiohydantoin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TÔ ÁI AN TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT 5-3’-HALOGENOARYLIDEN-2- THIOHYDANTOIN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TÔ ÁI AN

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC

CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT 5-(3’-HALOGENOARYLIDEN)-2-

THIOHYDANTOIN

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2016

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TÔ ÁI AN

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC

CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT 5-(3’-HALOGENOARYLIDEN)-2-

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS.Vũ

Trần Anh, PGS.TS Nguyễn Quang Đạt, là người thầy đã tận tình hướng dẫn,

tạo mọi điều kiện thuận lợi và động viên tôi hoàn thành luận văn này Tôi chân

thành cảm ơn PGS.TS Đinh Thị Thanh Hải, ThS Hoàng Thu Trang và toàn

thể các thầy cô giáo, kỹ thuật viên của Bộ môn Hóa hữu cơ đã động viên, giúp

đỡ tôi trong thời gian nghiên cứu tại Bộ môn

Tôi cũng xin cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của: Ths Đặng Vũ Lương

(Phòng NMR- Viện hóa học- Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam), Ths

Phạm Thị Nguyệt Hằng (Khoa Dược lý-Sinh hóa, Viện Dược liệu Việt Nam),

ThS Đỗ Thị Nhung (Bộ môn Hóa vật liệu, khoa Hóa, trường Đại học Khoa học

Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội), PGS.TS Lê Mai Hương (Viện Hóa học

các hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) và các thầy cô giáo trong trường, các phòng ban, thư viện - Trường Đại học Dược

Hà Nội

Mặc dù đã có nhiều cố gắng nhưng do hạn chế về thời gian, kiến thức cũng như tài liệu tham khảo nên luận văn của tôi không thể tránh khỏi những sai sót, khiếm khuyết trong nội dung và hình thức, tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô để luận văn được hoàn thiện hơn

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu vừa qua

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Học Viên

Tô Ái An

1.2.1.3 Phản ứng đóng vòng của các α-dicarbonyl với ure hoặc dẫn

xuất của ure

2.2 THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM 18

2.4.1 Phương pháp tổng hợp các dẫn chất thiohydantoin

5-(3’-halogenoaryliden)-2-19

27

3.1.3 Tổng hợp các dẫn chất base Mannich của hợp chất halogenoaryliden)-2-thiohydantoin (Ia-c, IIa-d, IIIa-d)

5-(3’-29

4.1.1.Về phản ứng tổng hợp 2-thiohydantoin (BT) 54

4.1.2.Về phản ứng ngƣng tụ tạo hợp chất thiohydantoin (I-III)

5-(3’-halogenobenzyliden)-2-55

4.2 VỀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA CÁC CHẤT TỔNG HỢP ĐƢỢC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ABCB1 : P-glycoprotein 1 also known as multidrug resistance

ATP-binding cassette sub-family B member 1 (Chất vận chuyển đa thuốc)

EGFR : Epidermal growth factor receptor

(Thụ thể của yếu tố tăng trưởng biểu mô) Hep-G2 : Tế bào ung thư gan ở người

HCT116 : Tế bào ung thư đại tràng ở người

HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Connectivity

(Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết) HSQC : Heteronuclear Single-Quantum coherence

(Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết)

IC50 : Half maximal Inhibitory Concentration

(Nồng độ ức chế 50%)

(Phổ hồng ngoại) LU-1 : Tế bào ung thư biểu mô phổi

MCF-7 : Tế bào ung thư biểu mô vú ở người

MS : Mass spectrometry

(Khối phổ)

RD : Tế bào ung thư mô liên kết

3.2: Kết quả phổ IR của một số dẫn chất

5-(3‟-halogenoaryliden)-2-thiohydantoin (I-III, Ia-c, IIa-d, IIIa-d)

3.5: Kết quả thử hoạt tính trên dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 của các

chất Ia-c, IIa-d, III, IIIa-d, BT (theo phương pháp SRB)

50

3.6: Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào LU-1 và RD

của các chấtIId, III, IIIa-d, BT (theo phương pháp SRB)

52

3.7: Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào HCT116 và

MCF-7của các chấtIa-c, IIa-c (theo phương pháp MTT)

Sơ đồ 3: Tổng hợp các dẫn chất base Mannich của

5-(3‟-halogenoaryliden)-2-thiohydantoin (Ia-c, IIa-d, IIIa-d)

2-Thiohydantoin là hợp chất dị vòng có cấu tạo tương tự hydantoin (imidazolidin-2,4-dion) với một nhóm carbonyl ở vị trí 2 được thay thế bằng nhóm thiocarbonyl Các dẫn chất của 2-thiohydantoin là dãy chất đã và đang được quan tâm nghiên cứu về tổng hợp hóa học, hoạt tính sinh học và ứng dụng làm thuốc Các công trình nghiên cứu đã công bố cho thấy các dẫn chất của 2-thiohydantoin, đặc biệt là các dẫn chất 5-aryliden-2-thiohydatoin, có nhiều hoạt tính sinh học đáng quan tâm như gây độc tế bào ung thư [4], [8], [10], [15], [34], [37], [38]; kháng khuẩn [6], [16]; kháng nấm [20], [22]; kháng virus [13], [19]

Để góp phần nghiên cứu, tìm kiếm các dẫn chất thiohydantoin có tiềm năng về hoạt tính chống ung thư, chúng tôi thực hiện luận văn với các mục tiêu sau:

5-aryliden-2-1 Tổng hợp một số hợp chất 5-(3‟-halogenoaryliden)-2-thiohydantoin và các dẫn chất base Mannich của chúng

2 Thử sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào trên một số dòng tế bào ung thư của các chất tổng hợp được

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA DẪN CHẤT 2-THIOHYDANTOIN

2-thiohydantoin là hợp chất dị vòng được tạo thành nhờ phản ứng ngưng tụ giữa một amino acid (glycin) với một dẫn chất của thiocyanat Bản thân 2-thiohydantoin không thể hiện tác dụng sinh học, tuy nhiên các dẫn chất của 2-thiohydantoin có tác dụng sinh học đã được biết đến trong thời gian dài Nhiều công trình nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng sinh học cho thấy các dẫn chất của 2-thiohydantoin, đặc biệt là các dẫn chất 5-aryliden-2-thiohydantoin có tác dụng đa dạng như: gây độc tế bào ung thư [4], [8], [10], [15], [34], [37], [38]; kháng khẩn [6], [16]; kháng nấm [20], [22]; kháng virus [13], [19]

1.1.1 Tác dụng gây độc tế bào ung thư

Blanc và Cussac [38] đã tiến hành tổng hợp một số dẫn chất của

2-thiohydantoin (1a-d), thử tác dụng gây tăng miễn dịch và gây độc tế bào Kết quả thử nghiệm cho thấy các dẫn chất tổng hợp được 1(a-d) có tác dụng gây tăng

miễn dịch yếu, và có tác dụng trên các tế bào ung thư thử nghiệm

N

N S O

Năm 2010, một số dẫn chất của 2-thiohydantoin (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8) đã được

tác giả Al-Obaid và các cộng sự [8] nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng invitro về tác dụng chống ung thư trên 60 dòng tế bào người ở 5 nồng độ khác nhau Kết

quả thu được đáng chú ý là chất 2, 7 có tác dụng kháng tế bào ung thư trên dòng

tế bào ung thư bạch cầu, các chất 3, 4, 5, 6, 8 có tác dụng ngăn cản sự phân bào

và kìm hãm sự phát triển tế bào thử nghiệm

CH N H NH O

S

S Br

CH N H NH O

S

4

CH N H N O

S

S Br

O N

5

O OAc OAc

AcO

CH N NH O

S

S Br

6

O OAc OAc

AcO H AcO

CH N N O

S Ph

7

CH N N O

S

S Br

O N

O OAc OAc

AcO H AcO

bao gồm 3 thế hệ điều biến P-gp Các nghiên cứu cho thấy chất (9), (10) có tác

dụng ức chế bơm tống thuốc có yếu tố P-gp [34]

H N

N N

O O

H N O

H N S O

N H

H N S O

Ar

ArOH

N

H N SCH3O

Ar

CH3I

N HN

HO

N

H N O Ar

N N

HO

11c

Ar-CHO

Các tác giả đã thử tác dụng ức chế bơm tống thuốc của các dẫn chất đã tổng hợp được trên các tế bào lympho T đã kháng thuốc của chuột có gen vận chuyển thuốc ABCB1 Kết quả cho thấy một số dẫn chất có tác dụng yếu trên

bơm tống thuốc ở tế bào ung thư thử nghiệm, tác dụng yếu hơn chất 4 Hợp chất

có tác dụng mạnh nhất có 2 nhân thơm

Theo các tác giả này, phần nhân thơm không phân cực là yếu tố thuận lợi cho tác dụng ức chế bơm tống thuốc trên tế bào ung thư, còn nhóm hydroxyl là nhóm thế gây giảm tác dụng

Đặc biệt, những nghiên cứu gần đây cho thấy khung benzyl của (thio)hydantoin có khả năng gắn lên các chất vận chuyển protein Các công trình nghiên cứu của một số tác giả cho thấy tác dụng chống ung thư của các dẫn chất (thio)hydantoin rất đáng quan tâm [10], [15], [37] Dẫn chất (thio)hydantoin có tác dụng ức chế quá trình phosphoryl hóa tự động và biệt hóa một số tế bào ung thư do yếu tố EGFR (receptor của yếu tố tăng trưởng biểu mô) [10], [37]

Trong nước hiện nay, đã có công trình công bố của tác giả Trần Đức Lai [3]

về tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của một số dẫn chất thiohydantoin Trong đó, dẫn chất 5-(3‟-bromoaryliden)-2-thiohydantoin có hoạt tính ức chế trên tế bào ung thư đại tràng HCT116 và tế bào ung thư gan Hep-G2; dẫn chất 5-(3‟-cloroaryliden)-2-thiohydantoin và 5-(3‟-bromoaryliden)-2-

5-halogenoaryliden-2-thiohydantoin có hoạt tính kháng chủng vi khuẩn B.subtilis Trong nước hiện

nay, chưa có công trình công bố về tổng hợp của một số dẫn chất Mannich của (3‟-halogenoaryliden)-2-thiohydantoin

5-1.1.2 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm

Tác giả Herba [16] đã tiến hành tổng hợp một số dẫn chất của thiohydantoin

và thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm trên các chủng vi khuẩn:

Staphylococcus aureus (RCMB 000108) và Bacillus subtilis (RCMB 000109)

(Gram dương), Pseudomonas aeruginosa (RCMB 000103) và Escherichia coli

5-oxo-2-thioxo-1-(2-p-tolyl-ethylideneamino)-imidazolidin-4-yl acetat (12) có tác dụng tốt nhất trên chủng vi

khuẩn và nấm thử nghiệm Chất

N S O

N

N H

N S O

Năm 2010, tác giả Abd E.l, [6] đã tổng hợp một số dẫn chất của

thiohydantoin và thử hoạt tính trên 4 dòng vi khuẩn là: Bacillus subtilis,

Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas species và 1 dòng vi

nấm là Candida albicans Kết quả thu đƣợc cho thấy các hợp chất 16, 17, 18 tác dụng tốt trên dòng vi khuẩn Pseudomonas sp; các hợp chất 16, 17, 18 tác dụng yếu trên dòng Escherichia coli; 18, 19 tác dụng rất tốt trên vi khuẩn

Staphylococcus aureus; 16, 17, 19, 20 tác dụng rất tốt trên dòng vi nấm Candida

albicans

N N N

N Br

N H Br

19

NH N

N Br

S

20

S

1.1.3 Các tác dụng khác

Trong US patent 6.826.924 tác giả Pfahl [27] đã tổng hợp các dẫn chất của 2-thioxo-4-imidazolidindion có tác dụng trong điều trị các bệnh liên quan đến chuyển hóa lipid và carbonhydrat như đái tháo đường typ 2, biệt hóa tế bào mô

mỡ, bệnh Hodgkin, bệnh bạch cầu, ung thư vú, ung thư tiền liệt tuyến…

tác dụng ức chế sự nhân lên của virus Herpes typ 1 Tác giả El-Barbary [13] đã

sử dụng 5-methylen-2-thiohydantoin là dị vòng 5 cạnh để tiến hành phản ứng với 2‟-deoxyuridin nhằm tạo ra các chất mới để nghiên cứu tác dụng kháng virus theo sơ đồ sau:

HN

N

H

N HN

OTol

HN N

N HN O

O

O

O TolO

OTol

HN N

O

O

CHO 1.(Me3Si)2NH/(NH4)2SO4

1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP 2-THIOHYDANTOIN VÀ DẪN CHẤT

1.2.1.2 Phản ứng của các α-amino acid với amonium thiocyanat

Năm 1913, Treat Johson và Water Scott [18] tìm ra phản ứng giữa α-amino acids với amonium thiocyanat trong môi trường anhydrid acetic khan Sản phẩm trung gian thu được là acylthiohydantoin, sản phẩm trung gian này bị thủy phân trong môi trường acid ở nhiệt độ cao sẽ sinh ra 2-thiohydantoin

Sơ đồ phản ứng:

N H

H N S O

Trong bài báo này, tác giả đã thực hiện phản ứng tổng hợp thiohydantoin và

dẫn chất từ 7 acid khác nhau là: acid aceticphtalamic, acid p-methoxyhippuric, acid carbethoxyaminoacetic, acid m-nitrohippuric, acetyldibromphenylalanin,

benzoylalanin, acid phenylsulfonaminoacetic

Năm 2006, Samuel Reyes và cộng sự [28] đã tiến hành tổng theo phương pháp trên và thu được 2-thiohydantoin Năm 2011, Sandrine Gosling và cộng sự [14] cũng đã xây dựng qui trình tổng hợp 2-thiohydantoin theo sơ đồ như trên và chúng tôi thực hiện theo qui trình này

1.2.1.3 Phản ứng của glycin ethyl ester thiocyanat với acid amin

Glycin ethyl ester thiocyanat kết hợp với acid amin, đun hồi lưu trong cloroform trong 4 giờ được dẫn chất thế ở vị trí 3 của uredoacetic ethyl ester, sau

đó đun hồi lưu trong ethanol/acid hydrochloric (nồng độ 10N, tỷ lệ 1:1) thu được 2-thiohydantoin có nhóm thế ở vị trí 3 như mong muốn [36]

H N

O

H N R S

a: đun hồi lưu 4 giờ trong CHCl3

b: đun hồi lưu 3 giờ trong ethanol: HCl 10N tỷ lệ 1:1

1.2.2 Phản ứng tổng hợp dẫn chất 5-aryliden-2-thiohydantoin

Công thức cấu tạo 2-thiohydantoin (2-thioxoimidazolidin-4-on) như sau:

N H

H N S

O

1 2

3 4 5

Từ cấu trúc phân tử 2-thiohydantoin cho thấy nhiều khả năng phản ứng chuyển hóa để tạo thành nhiều dẫn chất khác nhau của 2-thiohydantoin [11], [22], [36]… Các phản ứng thực hiện theo hướng chính sau:

H R OH

S

O C

H R

Phản ứng ngưng tụ với aldehyd thơm có thể thực hiện ở các điều kiện khác nhau: xúc tác natri acetat, acid acetic băng [20], [35]; xúc tác ethanolamin/EtOH [22], [25], xúc tác piperidin/EtOH [13], dưới điều kiện vi sóng [26]…

Về cơ chế phản ứng Knoevenagel [24]

Phản ứng ngưng tụ các aldehyd thơm và một số hợp chất dị vòng chứa nhóm aldehyd với 2-thiohydantoin xảy ra theo cơ chế phản ứng Knoevenagel tương tự như với các hợp chất có nhóm methylen hoạt động khác

Với xúc tác ethanolamin là amin bậc 1, có thể trình bày cơ chế phản ứng

ngưng tụ aldehyd thơm với 2-thiohydantoin theo cơ chế Knoevenagel theo các bước sau:

- Aldehyd thơm ngưng tụ với ethanolamin tạo arylidenimin:

Ar C

H O H2N CH2CH2OH Ar

H C

HN NO

S

O H

C Ar N

H

NH S

O H

C Ar NH

C Ar NH

Nhóm methylen ở vị trí 5 của 2-thiohydantoin rất hoạt động, nguyên tử H ở đây dễ dàng tách khỏi carbon (khi có xúc tác base) và anion (II) được tạo thành

là một tác nhân ái nhân mạnh:

N H

NH S

O

N H

NH S

O

+ BH (II)

Anion (II) tấn công vào carbon mang điện tích dương phần Cδ(+) của nhóm carbonyl của aldehyd tạo sản phẩm cộng hợp (IV):

HC N H

NH S

O H CH Ar O

Ion alcolat (IV) tạo thành lại lấy một proton của BH, trả lại xúc tác B(-)

:

N

NH S

O H HC Ar

O (IV)

H

NH S

O H HC Ar OH (V)

+

- Giai đoạn ngưng tụ loại nước:

N H

NH S

NH CH

Ar

O

S (V)

NH C

H Ar

O

S

Năm 1911, Wheeler và Hoffman [34] là những người đầu tiên nhận thấy hydantoin có thể ngưng tụ với aldehyd thơm tạo thành dẫn chất có nối đôi gắn ở

C-5 của hydantoin Phản ứng được thực hiện trong acid acetic băng, với natri acetat khan, anhydrid acetic Các aldehyd thơm đã được sử dụng là benzaldehyd, 2-hydroxybenzaldehyd, furfural, vanillin…

N H

NH O

O Ar-CHO

1 23 4 5

N H

NH O

O

1 3 4 5Ar

Năm 1992, Chazeau V., và cộng sự [39] đã xây dựng qui trình tổng hợp một số dẫn chất 5-aryliden-2-thiohydantoin dựa trên nghiên cứu của Wheeler và Hoffman

Năm 1993, János Marton [22] sử dụng xúc tác có tính base mạnh là ethanolamin để tiến hành phản ứng ngưng tụ aldehyd thơm với 2-thiohydantoin, thiohydantoin trong dung môi là hỗn hợp nước: ethanol (1:1), phản ứng tiến hành ở nhiệt độ hồi lưu trong 4 giờ Tác giả đã sử dụng một số aldehyd thơm (p-clorobenzaldehyd, p-nitrobenzaldehyd, p-hydroxybenzaldehyd ), hiệu suất phản ứng 44-89%

NH O O

Trong môi trường acid, phản ứng xảy ra qua hai bước theo cơ chế sau:

- Bước 1: Amin phản ứng với formaldehyd tạo dẫn chất hydroxymethyl, dẫn xuất này gắn proton và loại một phân tử nước để tạo ra cation aminomethyl:

+ Trường hợp hợp chất có hydro linh động không có khả năng enol hóa (như trường hợp hydro linh động ở các liên kết N-H, S-H, Se-H, P-H hoặc ở liên kết C-H ở nhân indol, pyrol…) thì cation aminomethyl tấn công vào nguyên tử mang H linh động tạo ra sản phẩm base Mannich:

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, DUNG MÔI

- Các hóa chất, dung môi dùng trong quá trình thực nghiệm là loại dùng trong

tổng hợp được nhập từ công ty Merck, Sigma-Aldrich, Trung Quốc

3 3-Clorobenzaldehyd Sigma Aldrich ≥98%

4 3-Bromobenzaldehyd Sigma Aldrich ≥98%

5 3-Fluorobenzaldehyd Sigma Aldrich ≥98%

15 Ethanol tuyệt đối Đức Giang (VN) 99,5%

16 Bản mỏng Silicagel 60 F254 Merck

- Hợp chất 2-thiohydantoin tự tổng hợp từ glycin và amoni thiocyanat (xem

mục 3.1.1)

2.2 THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM

- Dụng cụ thủy tinh (bình cầu 3 cổ dung tích 100ml, sinh hàn, phễu nhỏ

giọt, ống đong, cốc thủy tinh các loại, bình lọc hút, phễu Buchner…)

- Cân kỹ thuật điện tử Shimadzu (Nhật)

- Bơm hút chân không DIVAC.1.21 (Mỹ)

- Bơm hút chân không VRL mode 200- 7.0 (Mỹ)

- Máy cất quay Büchi R- 210 (Thụy Sĩ)

- Tủ sấy Memmert (Đức)

- Tủ sấy chân không Shellab (Đức)

- Mấy khuấy từ IKA – RCT (Đức)

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt (Mỹ)

- Phổ hồng ngoại (IR) ghi trên máy Perkin Elmer, tại Bộ Môn Hoá vật liệu,

Khoa Hóa học, Đại học Khoa học tự nhiện, Đại học Quốc gia Hà Nội

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, HQSC, HMBC) ghi trên máy AVANCE, Bruker AV500 tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Phổ khối lượng ghi trên máy LTQ Orbitrap XL™ Hybrid Ion Trap tại Phòng Hóa vật liệu, khoa Hóa học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Tổng hợp và xác định cấu trúc của:

+ Hợp chất 2-thiohydantoin

+ Một số hợp chất 5-(3‟-halogenoaryliden)-2-thiohydantoin và các dẫn chất base Mannich

- Thử hoạt tính gây độc tế bào trên một số dòng tế bào ung thư của các chất tổng hợp được

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1 Phương pháp tổng hợp các dẫn chất thiohydantoin

5-(3’-halogenoaryliden)-2 Sử dụng các phương pháp thực nghiệm trong hóa hữu cơ để tổng hợp các

chất dự kiến

- Dùng phương pháp kết tinh lại để tinh chế sản phẩm thu được

- Theo dõi quá trình tiến triển của phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM)

- Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng SKLM, đo nhiệt độ nóng chảy

2.4.3 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư

Thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các chất tổng hợp được theo 2 phương pháp:

- Phương pháp MTT [9], [24]

- Phương pháp SRB [17], [29], [33]

Nguyên tắc:

Đây là phương pháp thử nghiệm in vitro để đo sự tăng sinh và sống sót của tế

bào Tế bào ung thư được nuôi cấy trong đĩa 96 giếng

- Phương pháp MTT: Hợp chất MTT 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5 diphenyltetrazolium bromid, có màu vàng được thêm vào mỗi giếng và tế bào được ủ ở 37o

C, 5% CO2 Màu vàng này bị biến đổi thành formazan tím trong ty thể của những tế bào sống Khả năng hấp thụ của dung dịch có màu này có thể

được định lượng bằng máy quang phổ kế ở bước sóng 540 – 600 nm Sự biến đổi màu chỉ xảy ra khi enzym reductase trong ty thể là hoạt động, và do đó sự chuyển đổi có thể liên quan trực tiếp đến số lượng tế bào sống sót Chúng tôi sử dụng phương pháp này để nghiên cứu độc tính của chất tổng hợp được đối với 2 dòng tế bào ung thư người: tế bào ung thư biểu mô vú MCF-7 và tế bào ung thư

đại tràng HCT116

- Phương pháp SRB: Hợp chất Sulphorhodamin B (SRB) biến đổi thành aminoxanthin có màu hồng, được các acid amin cần thiết trong tế bào sống hấp thu Càng nhiều tế bào sống, sự hấp thu càng nhiều Các tế bào sống, sau đó được cố định Định lượng các chất màu được tế bào hấp thu bằng máy quang phổ

kế ở bước sóng 495-515 nm Từ đó tính được số lượng tế bào sống sót Chúng tôi sử dụng phương pháp này để nghiên cứu độc tính của chất tổng hợp được đối với 3 dòng tế bào ung thư người: tế bào ung thư gan Hep-G2, tế bào ung thư biểu

mô phổi LU-1, tế bào ung thư mô liên kết RD Phương pháp này hiện đang được

áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thư quốc gia Mỹ (National Cancer Institution -

NCI)

Dòng tế bào thử nghiệm:

5 dòng tế bào:

- Dòng tế bào MCF-7 (tế bào ung thư vú)

- Dòng tế bào HCT116 (tế bào ung thư đại tràng)

- Dòng tế bào Hep-G2 (tế bào ung thư gan)

- Dòng tế bào LU-1 (tế bào ung thư biểu mô phổi)

- Dòng tế bào RD (tế bào ung thư mô liên kết)

Chất chuẩn dương tính

Sử dụng chất chuẩn có khả năng diệt tế bào:

- Phương pháp MTT: Doxorubicin của hãng Sigma

- Phương pháp SRB: Ellipticin của hãng Sigma

Tiến hành thử hoạt tính

a/ Chuẩn bị tế bào

- Tế bào ung thư được duy trì ở điều kiện tiêu chuẩn Sau khi tế bào được hoạt hóa phát triển đến phase log sẽ được sử dụng cho thử với các chất thử

đã chuẩn bị sẵn ở 4 - 10 thang nồng độ khác nhau, lặp lại ba lần trên phiến

vi lượng 96 giếng đối với phương pháp SRB và lặp lại hai lần đối với phương pháp MTT

- Mẫu thử nghiệm bao gồm: tế bào + môi trường nuôi cấy + mẫu thử được ủ trong tủ ấm CO2/370C để tế bào tiếp tục phát triển

- Ủ đĩa nuôi cấy từ 48 giờ-72 giờ (37oC, 5% CO2)cho phép chất thử phát huy tác dụng

b/ Quy trình thử nghiệm độc tính tế bào theo phương pháp MTT [9], [24]

- Chuẩn bị dung dịch MTT nồng độ 5mg/ml

- Thêm 20 μl dung dịch MTT vào mỗi giếng của đĩa nuôi cấy Lắc nhẹ cho MTTkhuếch tán đều trong môi trường nuôi cấy

- Ủ 37oC trong 3 giờ để MTT được chuyển hóa

- Loại bỏ môi trường trong các giếng của đĩa nuôi cấy

- Hoàn trả formazan (sản phẩm chuyển hóa MTT) bằng 100 μl DMSO Lắc

kỹ để formazan có thể tan hoàn toàn

- Đọc mật độ quang ở bước sóng 540 nm Mật độ quang sẽ phản ánh số lượng tế bào sống sót

c/ Quy trình thử nghiệm độc tính tế bào theo phương pháp SRB [17], [29]

- Tế bào sau khi được ủ từ 48 giờ-72 giờ được cố định bằng TCA ở 40C

trong 1 giờ, sau đó rửa sạch bằng nước và để khô tự nhiên

- Thêm 50 μl dung dịch sulphorhodanin B (SRB) vào mỗi giếng của đĩa nuôi cấy, nhuộm ở nhiệt độ phòng trong 30 phút

- Rửa sạch dung dịch sulphorhodanin B (SRB) dư bằng dung dịch acid acetic 1% 5 lần

- Hoàn trả sulphorhodanin B đã được nhuộm vào tế bào Lắc kỹ để hòa tan hoàn toàn

- Đọc mật độ quang ở bước sóng 492-515 nm Mật độ quang sẽ phản ánh số lượng tế bào sống sót

d Tính kết quả

* Tính tỷ lệ tế bào sống sót (giá trị CS)

Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của chất thử tính theo % so với đối chứng Dựa trên kết quả đo được của chứng OD (ngày 0), DMSO 10% và so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu để tìm giá trị CS (%) theo công thức sau:

Giá trị CS% sau khi tính theo công thức trên được đưa vào tính toán Excel để tìm ra % trung bình  độ lệch tiêu chuẩn của phép thử được lặp lại 3 lần theo công thức của Ducan như sau

Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS<50%) sẽ được chọn ra để thử nghiệm tiếp tìm giá trị IC50

Giá trị IC50: dùng giá trị CS của 10 thang nồng độ, dựa vào chương trình Table curve theo thang giá trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng

độ chất thử để tính giá trị IC50

Công thức 1/Y = a + blnX

Trong đó Y: nồng độ chất thử; X: giá trị CS (%)

a, b: hệ số tính toán được theo giá trị thực nghiệm

- Phương pháp SRB: Mẫu chất tinh khiết có IC50  10 g/ml là có hoạt tính

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 TỔNG HỢP HÓA HỌC

Để chủ động về nguyên liệu và giảm kinh phí, chúng tôi tự tổng hợp thiohydantoin Tiếp đến, thực hiện phản ứng ngưng tụ tổng hợp các hợp chất 5-(3‟-halogenoaryliden)-2-thiohydantoin và phản ứng Mannich của chúng để tạo ra các dẫn chất 5-(3‟-halogenoaryliden)-2-thiohydantoin chưa thấy công bố trong TLTK

2-Trong luận văn này chúng tôi tiến hành tổng hợp một số dẫn chất halogenoaryliden)-2-thiohydantoin bao gồm các công việc sau:

5-(3‟ Tổng hợp 25-(3‟ thiohydantoin bằng phản ứng giữa glycin và amonithiocyanat trong anhydrid acetic theo sơ đồ phản ứng sau:

N

OH O

N H

N S O

Glycin

Sơ đồ 1: Tổng hợp 2-thiohydantoin (BT)

- Tổng hợp các hợp chất 5-(3‟-halogenoaryliden)-2-thiohydantoin bằng phản ứng ngưng tụ 2-thiohydantoin với 3-halogenobenzaldehyd theo sơ đồ phản ứng sau:

N H

NH O S CHO

NH O S AcOH, AcONa

X = -Br (I), -Cl (II), -F (III)

Sơ đồ 2: Tổng hợp hợp chất 5-(3’-halogenoaryliden)-2-thiohydantoin (I-III)

Đun hồi lưu

Đun hồi lưu, 1 giờ

1-acetyl-2-thiohydantoin (A) 2-thiohydantoin (BT)

- Tổng hợp các dẫn chất base Mannich thiohydantoin bằng phản ứng Mannich giữa 5-(3‟-halogenoaryliden)-2-thiohydantoin với formaldehyd và các amin bậc 2 bằng 2 phương pháp theo sơ

5-(3‟-halogenoaryliden)-2-đồ phản ứng sau:

X

CH

N H

NH O

S

X

CH N H

N O

S

CH2

R1N

R2

X

CH N H

N O

S

CH2

R1N

R2

Sơ đồ 3: Tổng hợp các dẫn chất base Mannich của

5-(3’-halogenoaryliden)-2-thiohydantoin (Ia-c, IIa-d, IIIa-d)

EtOH, hồi lưu

Ia-c, IIa-c, IIIa-b

Amin

X

H N S O

O

1 5 3 4 2

CTPT: C5H6N2O2S, KLPT: 158,18

Tiến hành:

Cho vào bình cầu 46,00g (0,613mol) glycin, 46,60g (0,613mol) amoni thioacetat, thêm 174 ml anhydrid acetic, đun cách dầu và khuấy đều hỗn hợp phản ứng Theo dõi phản ứng bằng SKLM với dung môi khai triển là Hexan/EtOAc (7:3) Phản ứng được tiến hành ở 1000C trong 30 phút Kết thúc phản ứng, hỗn hợp được rót vào 500 ml nước đá, để lạnh trong 4 giờ Chất rắn màu vàng xuất hiện được lọc, rửa bằng nước lạnh 3 lần, mỗi lần 150ml

Khối lượng sản phẩm: 59,27g Hiệu suất: 61,09%

Nhiệt độ nóng chảy: 172-1730C (tài liệu [22], t0

H N S

O

1 2

3 4 5CTPT: C3H4N2OS, KLPT: 116,14

Tiến hành:

59,27g (0,375mol) chất A được phân tán trong 294ml HCl 10% Đun hồi lưu

trong vòng 1 giờ Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi khai triển là

CH2Cl2/MeOH (14:1) Kết thúc phản ứng cho than hoạt vào hỗn hợp phản ứng

và lọc nóng Dịch lọc được để lạnh qua đêm, thu được kết tủa, lọc tủa, rửa nước đến hết acid (thử bằng giấy quỳ) Sấy khô tủa thu được Kết tinh lại trong nước Khối lượng sản phẩm: 19,12g chất rắn màu cam Hiệu suất: 43,99%

Nhiệt độ nóng chảy: 229-2300C (tài liệu [22], t0

C= 230-2320C; Catalogue Sigma Aldrich, t0C= 229-2310C)

Rf = 0,68 (TLC, silicagel 60 F254, hệ dung môi CH2Cl2/MeOH (14:1))

5-(3’-halogenoaryliden)-2-qui trình tác giả Chazeau V., và cộng sự [39]

Cho vào bình cầu phản ứng 0,020mol chất BT, 0,020mol

3-halogenobenzaldehyd, 0,092mol natri acetat khan và 44ml acid acetic băng Khuấy đều cho hỗn hợp tan hoàn toàn, đun hồi lưu Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi khai triển CH2Cl2 : MeOH (14:1) với hợp chất I, II, hệ

dung môi khai triển CH2Cl2 : MeOH (28:1) với hợp chất III Xác định thời gian

phản ứng là 2 giờ Để nguội, đổ hỗn hợp ra cốc có mỏ, ngâm lạnh 15 phút sau đó

để hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Rửa tủa vài lần bằng cồn lạnh Lọc hút kiệt, rửa tủa nhiều lần bằng nước cất cho đến khi hết acid acetic (thử bằng giấy quỳ) Sấy khô sản phẩm thô thu được Kết tinh lại sản phẩm thô bằng EtOH Sau đây là kết quả cụ thể:

1) 5-(3’-bromobenzyliden)-2-thiohydantoin (I)

Công thức

Br

CH

N H

NH O

S

1 2 3 4 5 1'

2' 3'

4'

5' 6'

CTPT: C10H7BrN2OS;KLPT: 283,14

Tiến hành:

3,70g (0,020 mol) 3-bromobenzaldehyd, 2,32g (0,020 mol) chất BT, 7,54g

(0,092mol) natri acetat khan, 44ml acid acetic, đun hồi lưu 2 giờ

Sản phẩm thu được là 4,41g chất rắn màu vàng Hiệu suất: 77,92%

Nhiệt độ nóng chảy: 216-2170

C

Rf = 0,82 (TLC, silicagel 60 F254, hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH (14:1))

Rf = 0,60 (TLC, silicagel 60 F254, hệ dung môi Hexan: Aceton (3:2))

NH O

S

1 2 3 4 5 1'

2' 3'

4'

5' 6'

CTPT: C10H7ClN2OS;KLPT: 238,69

Tiến hành:

2,81g (0,020mol) 3-clorobenzaldehyd, 2,32g (0,020 mol) chất BT, 7,54g

(0,092mol) natri acetat khan, 44ml acid acetic, đun hồi lưu 2 giờ

Sản phẩm thu được là 2,81g chất rắn màu vàng Hiệu suất: 58,91%

Nhiệt độ nóng chảy: 235-2360

C

Rf = 0,80 (TLC, silicagel 60 F254, hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH (14:1))

Rf = 0,58 (TLC, silicagel 60 F254, hệ dung môi Hexan: Aceton (3:2))

NH O

S

1 2 3 4 5 1'

2' 3'

4'

5' 6'

CTPT: C10H7FN2OS;KLPT: 222,24

Tiến hành:

2,48g (0,020 mol) 3-fluorobenzaldehyd, 2,32g (0,020 mol) chất BT, 7,54g

(0,092mol) natri acetat khan, 44ml acid acetic, đun hồi lưu 2 giờ

Sản phẩm thu được là 2,44g chất kết tinh màu vàng Hiệu suất 55,20% Nhiệt độ nóng chảy: 256-2570

3.1.3.1 Tổng hợp dẫn chất base Mannich của hợp chất halogenoaryliden)-2-thiohydantoin sử dụng dung môi ethanol (Ia-c, IIa-c, IIIa-b)

5-(3’-Trong phần tổng quan, chúng tôi đã trình bày về phản ứng Mannich Căn cứ trên các kết quả nghiên cứu đã công bố, chúng tôi chọn điều kiện tiến hành phản

ứng Mannich của các hợp chất 5-(3‟-halogenoaryliden)-2-thiohydantion (I-III)

là nhiệt độ hồi lưu với tỷ lệ số mol hợp chất thiohydantion: formaldehyd : amin là 1:1:1 Chúng tôi tiến hành tổng hợp một số

5-(3‟-halogenoaryliden)-2-dẫn chất Mannich của chất I-III bằng cách cho chất I-II tác dụng với formaldehyd và 3 amin (morpholin, piperidin, N-methylpiperazin), chất III tác

dụng với formaldehyd và 2 amin (morpholin, piperidin)

Quy trình tổng hợp chung:

Cho vào bình phản ứng 0,0025 mol chất I-III, thêm 15ml EtOH, khuấy ở

nhiệt độ phòng cho phân tán đều trong 15 phút Cho tiếp 0,0025 mol formaldehyd (0,21ml formol) và 0,0025 mol amin, 3-4 giọt CH3COOH băng, khuấy ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ Sau đó đun cách thủy nâng dần nhiệt độ tới nhiệt độ hồi lưu để hỗn hợp tan hoàn toàn Sau đó, tiếp tục khuấy và giữ nhiệt độ hồi lưu Theo dõi bằng SKLM với hệ dung môi phù hợp trên bản mỏng silicagel

60 GF254, phát hiện vết bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm Khi phản ứng đạt tối ưu, đổ hỗn hợp phản ứng ra cốc có mỏ, để nguội đến nhiệt độ phòng, để tủ lạnh trong 24 giờ Sau đó cạo thành cốc thật kỹ để tạo tủa tốt Lọc hút, rửa tủa bằng EtOH lạnh thu được sản phẩm thô Kết tinh lại trong dung môi EtOH, sấy khô ở 600C trong tủ sấy chân không trong 3h thu được sản phẩm

Sau đây là các trường hợp cụ thể:

1) 5-(3’-bromobenzyliden)-3-morpholinomethyl-2-thiohydantoin (Ia)

Công thức

CH

N H

N O

S

CH2 N O

1 2 3 4 5 1'

2' 3'

4'

5' 6'

1''

2'' 3'' 4''

5'' 6''

CTPT: C15H16BrN3O2S;KLPT: 382,28

Tiến hành:

0,71g (0,0025mol) chất I, 0,21ml formol (0,0025mol formaldehyd), 0,22g

(0,0025mol) morpholin Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi khai triển CH2Cl2/MeOH (14:1), đun hồi lưu 6 giờ

Sản phẩm thu được là 0,45g chất kết tinh màu vàng Hiệu suất 46,75%

Nhiệt độ nóng chảy: 159-1600

C

Rf = 0,94 (TLC, silicagel 60 F254, hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH (14:1))

Rf = 0,77 (TLC, silicagel 60 F254, hệ dung môi H2O: AcOH: MeOH (5:1:4))

N O

S

CH2 N

1'

2' 3'

4'

5' 6'

1'' 2'' 3''

4''

5'' 6''

1 2 3 4 5

CTPT: C16H18BrN3OS;KLPT: 380,30

Tiến hành: