Nghiên cứu tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của một số dẫn chất benzimidazol 2 YL propanoat

Công thức cấu tạo các chất trong nghiên cứu của Parmender Singh Hình 1.10: Một số dẫn chất benzimidazol thử tác dụng kháng virus 11 Hình 1.11... Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy n

1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

3

LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn trưởng bộ môn Công nghiệp Dược

trường đại học Dược Hà Nội PGS.TS Nguyễn Đình Luyện và TS Phan Thanh Bình,

những người trực tiếp hướng dẫn tôi không chỉ tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi hoàn thành luận văn mà luôn có những hướng dẫn chính xác và kịp thời những lúc tôi gặp khó khăn, luôn động viên tôi, cho tôi niềm động lực tinh thần lớn

Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên ở Bộ môn Công nghiệp Dược đã tận tình giúp đỡ trong suốt quá trình thực hiện luận văn tại

bộ môn

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các cán bộ Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cùng các thầy cô trong trường Đại học Dược

Hà Nội, các phòng ban và thư viện trường

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và tất cả bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Hà Nội, ngày 30 tháng 8 năm 2013

Học viên

Nguyễn Thị Thanh Phúc

1.3.2.2 Phản ứng nitro hóa vào vị trí C-5 của nhân benzimidazol 18

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

5

2.3.3 Thử tác dụng sinh học kháng nấm, kháng khuẩn 26

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 27

3.1.1 Tổng hợp acid 3-(benzoimidazol-2-yl)propanoic (1) 27 3.1.2 Tổng hợp ethyl 3-(benzimidazol-2-yl)propanoat (2a) 29 3.1.3 Tổng hợp methyl 3-(benzimidazol-2-yl)propanoat (2b) 29 3.1.4 Tổng hợp ethyl 3-(1-ethoxy carbonyl methyl-benzimidazol-2-yl)

3.1.11 Tổng hợp ethyl 3-(1-benzyl-5-nitro-benzimidazol-2-yl)propanoat (9a) 38

C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Carbon-13 (13

C nuclear magnetic resonance)

EC50 Nồng độ tác dụng 50% (half maximal effective

HEPG2 Dòng tế bào ung thư gan ở người (human hepatocellular liver

carcinoma cell line)

IC50 Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử (half maximal inhibitory

concentration)

IR Phổ hồng ngoại (infrared)

MIC Nồng độ ức chế tối thiểu (minimum inhibitory concentration)

MS Phổ khối (mass spectroscopy)

PC12 Dòng tế bào pheochromocytoma thượng thận chuột (rat

adrenal pheochromocytoma cell line) SKLM Sắc kí lớp mỏng (thin layer chromatography)

Rf Hệ số lưu giữ (retension of factor)

t0nc Nhiệt độ nóng chảy

8

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Kết quả ức chế sự phát triển trên 21 dòng tế bào ung thư người của

các hợp chất 1-6, Etoposide, Doxorubicin, SN-38 và Cisplatin 6

Bảng 1.2 MIC (μg/ml) của các chất trong nghiên cứu của Rathee và cộng sự 10 Bảng 1.3.Một số phản ứng thế vào N1 của 5-nitrobenzimidazol đã được nghiên

Bảng 2.1 Danh mục nguyên liệu, dung môi và hóa chất 20 Bảng 2.2: Danh mục thiết bị thí nghiệm 21 Bảng 2.2: Danh mục dụng cụ thí nghiệm 21 Bảng 2.3: Các dẫn chất benzimidazol-2-propanoat được tổng hợp 23 Bảng 3.1 Số liệu phổ hồng ngoại của các chất 1- 7b 40 Bảng 3.2 Số liệu phổ khối của các chất 41 Bảng 3.3 Số liệu phổ 1

Bảng 3.4 Đường kính vòng vô khuẩn (mm) của các chất 1-7b 47 Bảng 3.5 Đường kính vòng vô nấm (mm) của các chất 1-7b 48 Bảng 3.6 Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư 50

9

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1.5,6-dimethyl-1-( -D-ribofiranosyl)benzimidazol 2

Hình 1.2 Cấu trúc vòng benzimidazol 2

Hình 1.3 Hiện tượng hỗ biến ở benzimidazol 3

Hình 1.4 Tổng quan tác dụng sinh học của benzimidazol 3

Hình 1.5: Các dẫn chất của acid N-methyl-1H-benzimidazol 5-carboxylic 4

Hình 1.6: Các phức hợp ion của muối

Hình 1.7: Một số dẫn chất thế ở vị trí 2, 5 của benzimidazol và benzoxazol 7

Hình 1.8: Công thức cấu tạo dẫn chất 2-methylbenzimidazol trong nghiên cứu

Hình 1.9 Công thức cấu tạo các chất trong nghiên cứu của Parmender Singh

Hình 1.10: Một số dẫn chất benzimidazol thử tác dụng kháng virus 11

Hình 1.11 Dẫn chất 5-nitrobenzimidazol có tác dụng hạ huyết áp 11

Hình 1.12: Công thức chất 12a, 12b, 12c, 12d 12

10

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1: o-Phenylenediamin ngưng tụ với acid carboxylic 13

Sơ đồ 1.2 Tổng hợp 2-alkyl và 2-aryl benzimidazol theo phương pháp vi sóng 13

Sơ đồ 1.3.O-Phenylendiamin ngưng tụ với diacid carboxylic 14

Sơ đồ 1.4: Phản ứng đóng vòng o-Phenylendiamin với andehyd 14

Sơ đồ 1.5: Phản ứng đóng vòng 4-Nitro-o-phenylendiamin với andehyd 14

Sơ đồ 1.6 Phản ứng đóng vòng monoacyl-5-nitro-o-phenylendiamin với

Sơ đồ 1.7 Phản ứng đóng vòng o-phenylendiamin với andehyd theo công nghệ vi

Sơ đồ 1.8: Phản ứng đóng vòng o-Phenylendiamin với anhydric acetic 15

Sơ đồ 1.9: o-Phenylendiamin đóng vòng với acid succinic 16

Sơ đồ 1.10 Phản ứng chung của nhân benzimidazol 16

Sơ đồ 1.11 Phản ứng thế C-2 và N-1 của benzimidazol 17

Sơ đồ 1.12 Phản ứng nitro hóa benzimidazol 18

Sơ đồ 1.13 Phản ứng nitro hóa của nhân benzimidazol 18

Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng hợp dẫn chất benzimidazol-2-yl propanoat 27

Sơ đồ 3.2 Tổng hợp 3-(benzimidazol-2-yl)propanoic 28

Sơ đồ 3.3.Tổng hợp ester ethyl 3-(benzimidazol-2-yl)propanoat (2a) 29

Sơ đồ 3.4 Tổng hợp ester methyl 3-(benzimidazol-2-yl)propanoat (2b) 30

Sơ đồ 3.5 Tổng hợp ethyl 3-(1-ethoxy carbonyl

methyl-benzimidazol-2-yl)propanoat(3a)

31

Sơ đồ 3.6 Tổng hợp ethyl-3-(1-benzyl-benzimidazol-2-yl)propanoat (4a) 32

Sơ đồ 3.7 Tổng hợp methyl 3-(1-ethoxy carbonyl

methyl-benzimidazol-2-yl)propanoat (5b)

33

Sơ đồ 3.8 Tổng hợp acid 3-(5-nitro-1H-benzimidazol-2-yl)propanoic (6) 34

Sơ đồ 3.9 Tổng hợp methyl 3-(5-nitro-1H-benzimidazol-2-yl)propanoat (7a) 35

Sơ đồ 3.10 Tổng hợp methyl 3-(5-nitro-1H-benzimidazol-2-yl)propanoat (7b) 36

Sơ đồ 3.11 Tổng hợp ethyl 3-(1-ethoxy carbonyl methyl-benzimidazol-2-yl)

Sơ đồ 3.12 Tổng hợp ethyl 3-(1-benzyl-5-nitro-benzimidazol-2-yl)propanoat

11

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Phụ lục 10 Phổ khối lượng MS của chất 1

Phụ lục 11 Phổ khối lượng MS của chất 2a

Phụ lục 12 Phổ khối lượng MS của chất 2b

Phụ lục 13 Phổ khối lượng MS của chất 3a

Phụ lục 14 Phổ khối lượng MS của chất 4a

Phụ lục 15 Phổ khối lượng MS của chất 5b

Phụ lục 16 Phổ khối lượng MS của chất 6

Phụ lục 17 Phổ khối lượng MS của chất 7a

Phụ lục 18 Phổ khối lượng MS của chất 7b

Phụ lục 19 Phổ khối lượng MS của chất 8a

Phụ lục 20 Phổ khối lượng MS của chất 9a

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Y học nói chung và ngành dược nói riêng đã đạt được những thành tựu to lớn trong việc chăm sóc, bảo vệ sức khỏe con người bằng nhiều biện pháp tân tiến, trong đó việc sử dụng các dược phẩm mới đóng một vai trò quan trọng Thuốc mới không những để thay thế các thuốc cũ đang dần mất đi hiệu lực mà còn đáp ứng việc dùng thuốc ngày càng cao của con người Việc tạo ra thuốc mới là một quá trình lâu dài và được thực hiện theo các con đường khác nhau, trong đó đáng quan tâm là con đường tổng hợp hóa dược Ngày nay những thuốc có nguồn gốc tổng hợp hóa dược chiếm tỷ lệ đáng kể trong số các thuốc đang được điều trị Để tìm được các hoạt chất có hiệu quả điều trị cao, ít độc tính, có thể ứng dụng trong lâm sàng, các nhà tổng hợp hóa dược thường dựa vào cấu trúc của các chất đang được dùng làm thuốc hoặc các chất có tác dụng sinh học triển vọng để tổng hợp, bán tổng hợp ra nhiều thuốc mới

Dẫn chất Benzimidazol được quan tâm từ rất sớm vì chúng có tác dụng sinh học và ứng dụng lâm sàng đa dạng Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy nhóm hợp chất dị vòng này có tác dụng kháng tế bào ung thư, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng HIV, kháng viêm, tác dụng hạ huyết áp, trị giun, chống co giật …

Với hy vọng góp phần làm phong phú thêm các nghiên cứu về tổng hợp và thử tác dụng sinh học của các dẫn chất benzimidazol, chúng tôi đã chọn đề tài:

“Nghiên cứu tổng hợp và thử hoạt tính sinh học một số dẫn chất

benzimidazol-2-yl-propanoat” với 2 mục tiêu chính:

1 Tổng hợp được một số dẫn chất benzimidazol-2-yl-propanoat

2 Thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng tế bào ung thư của một số dẫn chất benzimidazol-2-yl-propanoat tổng hợp được

2

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Khái quát chung về benzimidazol và dẫn chất

Năm 1944, Wooley suy đoán rằng benzimidazol có thể hoạt động tương tự như purin về tác dụng sinh học [22] Năm năm sau, Brink xác định 5,6-dimethylbenzimidazol là sản phẩm phân hủy của vitamin B12 và sau đó tìm thấy một số các dẫn xuất của nó có hoạt động như vitamin B12 [8]

Hình 1.1.5,6-dimethyl-1-( -D-ribofiranosyl)benzimidazol

Cấu trúc benzimidazol là một hệ vòng bicyclic mà benzen kết hợp với vị trí 4-và 5- của imidazol Các hợp chất benzimidazol nói chung, và benzimidazol carbamat nói riêng là những chất rắn kết tinh với điểm nóng chảy khá cao và tương đối khó tan trong nước [21]

Hình 1.2 Cấu trúc vòng benzimidazol

Bezimidazol có chứa một nguyên tử hydro được gắn với nitơ ở 1 vị trí dễ dàng hỗ biến:

3

Hình 1.3 Hiện tượng hỗ biến ở benzimidazol

Hiện tượng này cũng được tìm thấy tương tự trong imidazol và amidin [10],[23]

1.2 Tác dụng sinh học của dẫn chất Benzimidazol

Đã có rất nhiều nghiên cứu về tác dụng sinh học của dẫn chất Benzimidazol

Hình 1.4 Tổng quan tác dụng sinh học của benzimidazol

Zn2+ Các hợp chất này được nghiên cứu tác dụng ức chế sự phát triển trên 21 dòng

tế bào ung thư người [18] Dưới đây là một số dẫn chất thuộc nhóm này:

N

H N O

3

Hình 1.5: Các dẫn chất của acid N-methyl-1H-benzimidazol 5-carboxylic

Tất cả các hợp chất từ 1-3 đã được kiểm tra là ổn định khi sử dụng trong nghiên cứu tế bào Kết quả của nghiên cứu tác dụng invitro của các hợp chất 1-3 ức

chế sự phát triển của 21 dòng tế bào ung thư người (8 dòng tế bào ung thư phổi, 7

dòng tế bào ung thư đại tràng, 6 dòng tế bào ung thư dạ dày) được trình bày ở Bảng

5

1.1 Nghiên cứu invitro tác dụng ức chế sự phát triển của hợp chất từ 1-3 cho thấy

hợp chất 3 là chất có hiệu lực đáng kể với GI50 = 0,095 µM (GI50 là nồng độ cần thiết để làm giảm sự phát triển những tế bào được xử lý xuống còn một nửa so với

sự phát triển của những tế bào không được xử lý) Hợp chất 1d và 2 cho thấy không

có tác dụng ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư thử nghiệm với GI50 >

100 µM Mặt khác, các hợp chất 1a-1c cho thấy tác dụng trung bình

Thực nghiệm cho thấy, acid benzimidazol-5-carboxylic liên kết với muối pyridinum thông qua cầu nối methylen là hợp chất có hoạt tính cao Vì vậy, các tác

giả tiếp tục tổng hợp phức hợp ion 4-6 của phối tử 3 :

N

H N O

O

N+

ClZn

Nghiên cứu còn chứng minh các hợp chất 4-6 có tác dụng này gấp khoảng

7-13 lần so với hiệu lực của etoposid và yếu hơn hiệu lực của doxorubicin và SN-38

(7-Ethyl-10-hydroxycamptothecin) So sánh với hợp chất 3, hợp chất 4 và 6 cho

này ở nồng độ thấp hơn 10 lần so với etoposide

Bảng 1.1: Kết quả ức chế sự phát triển trên 21 dòng tế bào ung thư người của các

hợp chất 1-6, Etoposide, Doxorubicin, SN-38 và Cisplatin

7

kháng khuẩn được thử với 3 dòng vi khuẩn Gram (+) là: Staphylococcus aureus ATCC 6538, Streptococcus faecalis ATCC 10541, Bacillus subtilis ATCC 6033 và 3 dòng vi khuẩn Gram (–) là: Escherichia coli ATCC 10536, Klepsiella pneumoniae NTCC 52211, Pseudomonas aeruginosa RSKK 355 Kết quả cho thấy các chất tổng hợp được có tác dụng kháng khuẩn yếu trên S aureus, S feacalis với MIC nằm

trong khoảng 25-50 µg/ml Riêng 5-nitro-2-cyclohexylmethylbenzimidazol (X=NH, Y=CH2, R=NO2) có tác dụng tốt hơn trên S aureus với MIC = 12,5 µg/ml

X

N R

Y

X= O, NH; -R= -H, -Cl, -NO2, -CH3; Y= CH2 hoặc không có

Hình 1.7: Một số dẫn chất thế ở vị trí 2, 5 của benzimidazol và benzoxazol

Đối với tác dụng kháng nấm, hầu hết các chất tổng hợp được (hình 1.7) đều

có tác dụng tốt trên Candida albicans RSKK 628 với MIC trong khoảng 12,5-50

µg/ml [5]

Năm 2002, Zygmunt và cộng sự đã thử tác dụng kháng protozoa và kháng khuẩn của dẫn chất 5,6-dinitro-benzimidazol Các dẫn chất 5,6-dinitrobenzimidazol gần như không có tác dụng kháng khuẩn, nhưng trong phép thử tính nhạy cảm của

protozoa kỵ khí (Giardia duodenalis, Trichomonas vaginalis và Entamoeba

histolytica), chất 7a, 7b, 7c và mức độ ít hơn của 7d đều là những chất có hiệu quả

nhất trên T vaginalis Nhóm nitro của những chất

5,6-dinitro-1-(aminoethyl)benzimidazol này có thể bị khử bởi ferredoxin giống như cơ chế của metronidazol, nhưng không ức chế trùng hợp tubulin như albendazol bởi vì dòng đối kháng metronidazol F1623-M1 không nhạy cảm với những chất này Đây chính

Nghiên cứu in vitro thực hiện trên các dòng vi khuẩn: Bacillus subtilis, Escherichia coli, Streptococcus aureus, Klebsiella pneumoniae và trên các loại nấm: Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Fusarium oxisporium, Trichoderma viride Tất cả các chất nghiên cứu và các chất chứng: Streptomycin (đối với kháng

khuẩn) và Griseofulvin (đối với kháng nấm) đều sử dụng ở 2 nồng độ 50 và 100ppm

Hình 1.8: Công thức cấu tạo dẫn chất 2-methylbenzimidazol trong nghiên cứu

của Rajiv Dua và cộng sự

Kết quả nghiên cứu cho thấy các chất đều có tác dụng kháng nấm và kháng khuẩn ở cả 2 nồng độ 50 và 100 ppm trong đó các chất có chứa halogen trên nhân phenyl, đặc biệt là các chất có chứa brom, có tác dụng tốt

Năm 2011, Parmender Singh Rathee và cộng sự đã nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của một số dẫn chất 2-methylbenzimidazol bằng phương pháp pha loãng [17]

10

Kết quả cho thấy các chất này không có tác dụng kháng khuẩn ngay cả ở nồng độ cao nhất sử dụng trong nghiên cứu Tuy nhiên các chất cũng có tác dụng chống nấm và được thể hiện trong bảng sau thông qua nồng độ ức chế tối thiểu

Bảng 1.2 MIC (μg/ml) của các chất trong nghiên cứu của Rathee và cộng sự

1.2.3 Tác dụng trên virus

Năm 2008, Fatma E.Goda và cộng sự đã tổng hợp và thử tác dụng kháng

virus của một số dẫn chất benzimidazol [9] Kết quả nghiên cứu in vitro đối với

Herpes simplex virus type 1 ( HSV-1) cho thấy chất 11c và 11d có tác dụng không đáng kể trong khi chất 11a và 11b có tác dụng tốt với EC50% = 2,9 và 3,4 μg/ml

11

Hình 1.10: Một số dẫn chất benzimidazol thử tác dụng kháng virus

1.2.4 Tác dụng hạ huyết áp

Năm 2010, Sharma và cộng sự đã nghiên cứu một loạt dẫn chất thế ở vị trí số

2, trên nhân 5-nitrobenzimidazol chứa vòng biphenyl tetrazol và đánh giá tác dụng đối kháng với receptor angiotensin II, trong hoạt tính chống tăng huyết áp theo phương pháp insasive (phương pháp trực tiếp) và tail-cuff (phương pháp gián tiếp)

Hệ renin-angiotensin đóng vai trò quan trọng trong điều hòa huyết áp động mạch và angiotensin II (AngII) là thành phần hoạt tính sinh học của hệ đảm nhiệm hầu hết các tác động ngoại vi Chất đối kháng với receptor AngII làm mất tác dụng của AngII, gây hạ huyết áp tương tự như chất ức chế enzym chuyển hóa AngII (ECA), nhưng không gây ra tác dụng phụ (những tác dụng liên quan đến ức chế các ECA

12

trong con đường trung gian khác như giáng hóa bradykinin) Bằng việc so sánh với các chất chuẩn Losartan và Telmisartan, nghiên cứu này đã chỉ ra rằng hầu hết các

dẫn chất 5-nitrobenzimidazol tổng hợp được (Hình 1.11) đều có tác dụng hạ huyết

áp tốt Sự có mặt của nhóm nitro ở vị trí số 5 trên nhân benzimidazol đã làm tăng tác dụng hạ huyết áp Điều này gợi ý rằng: nhóm nitro có lẽ đóng vai trò như chất nhận liên kết hydro tại vị trí gắn với receptor AngII [20]

R= alkyl (methyl, ethyl, propyl, butyl), aryl (benzyl, phenyl, halogeno-phenyl, methoxyl-phenyl)

Hình 1.11 Dẫn chất 5-nitrobenzimidazol có tác dụng hạ huyết áp

1.2.5 Tác dụng chống co giật

Ngoài các tác dụng trên, năm 2010, Jitender Singh và cộng sự đã tổng hợp và

thử tác dụng chống co giật in vitro của một số dẫn chất thế ở vị trí 1,2,5 của

benzimidazol Tác dụng chống co giật của các chất được đánh giá thông qua thời gian tác dụng vào pha co giật và phần trăm phục hồi khi dùng Pentylenetetrazol để

gây co giật trên động vật thử Trong số 30 chất tổng hợp được, chất 12a, 12b, 12c,

12d (Hình 1.12) làm tăng thời gian tác dụng vào pha co giật và phần trăm phục hồi

của động vật Nghiên cứu mối liên quan cấu trúc-tác dụng cho thấy, những chất có nhóm hút electron ở vị trí số 5 cho tác dụng chống co giật tốt hơn [11]

O-Phenylendiamin được ngưng tụ với hầu hết acid mono carboxylic tạo

thành nhân benzimidazol với nhóm thế khác nhau ở vị trí số 2 Tuy nhiên, khi sử dụng tác nhân yếu đặc biệt acid Lewis, muối vô cơ (clays vô cơ) hoặc acid vô cơ cải thiện cả hiệu suất và độ tinh khiết của sản phẩm [13]

NH2

NH2

+ RCOOH

N H

N

R + 2 H2 O

Sơ đồ 1.1: o-Phenylenediamin ngưng tụ với acid carboxylic

Phương pháp Phillips dùng HCl 4N và đun hồi lưu trong một số trường hợp cho phép thực hiện phản ứng ở nhiệt độ thấp hơn và hiệu suất phản ứng lại tăng lên Với các acid thơm như acid benzoic, hiệu suất thường thấp, để tăng hiệu suất cần thực hiện phản ứng trong ống kín với nhiệt độ 180-185oC [12]

Blatt và cộng sự đã tổng hợp benzimidazol bằng phản ứng đun hồi lưu phenylendiamin với acid formic 90%, hiệu suất phản ứng đạt 83-85% Tương tự, rất nhiều acid monocarboxylic đã được ngưng tụ với o-phenylenediamin trong điều kiện thích hợp [7]

o-14

Từ năm 1995, nhiều dẫn chất benzimidazol đã được tổng hợp theo công nghệ

vi sóng Năm 2007, Dubey và Moorthy đã tổng hợp các chất 2-alkyl và 2-aryl benzimidazol theo phương pháp này Thời gian phản ứng giảm đến phút, hiệu suất tăng 10-50% so với phương pháp trước đây

R= H, Methyl, Phenyl, 4-C6H4 NH2

Sơ đồ 1.2 Tổng hợp 2-alkyl và 2-aryl benzimidazol theo phương pháp vi sóng

Khi o-phenylen diamin phản ứng với diacid thì phụ thuộc vào tỷ lệ các chất

tham gia phản ứng và điều kiện phản ứng sẽ thu được các sản phẩm khác nhau [12] Khi hai hay nhiều hơn o-phenylendiamin phản ứng với một diacid thì sản

phẩm chính thu được sẽ là bisbenzimidazol

Sơ đồ 1.3.O-Phenylendiamin ngưng tụ với diacid carboxylic

1.3.1.2 Phản ứng với andehyd

Phản ứng của o-phenylendiamin với andehyd cần có chất oxy hóa để tạo ra nhân benzimidazol Những chất oxy hóa được sử dụng như: nitrobenzen, benzoquinon, natri metabisulfit, thủy ngân oxid, chì tetraacetat, iod, đồng (II) acetat, indium perfluorooctan sulfonat…

Sơ đồ 1.4: Phản ứng đóng vòng o-Phenylendiamin với andehyd

15

h

ồi lưu

Weidenhagen là người đầu tiên thực hiện phản ứng giữa diamin và andehyd

sử dụng đồng acetat là chất oxy hóa trong dung môi nước hoặc alcol Theo phương pháp của Weidenhagen, nhiều dẫn chất benzimidazol thế ở vị trí số 2 đã được tổng hợp [12]

Trong nghiên cứu tổng hợp dẫn chất benzimidazol có tác dụng chống co giật, Priyal Jain và cộng sự đã thực hiện một phản ứng hồi lưu của 4-nitro-o-phenylenediamin với các andehyd khác nhau thu được dẫn chất 5-nitrobenzimidazol [15] Sơ đồ phản ứng:

R= 4-clorophenyl, 4-fuorophenyl, 2-pyridyl, 4-methoxyphenyl

Sơ đồ 1.5: Phản ứng đóng vòng 4-Nitro-o-phenylendiamin với andehyd

Trong nghiên cứu tổng hợp một số dẫn chất benzimidazol có tác dụng kháng nấm, Ayhan Kilchigil và Altanlar đã tổng hợp 5-nitrobenzimidazol bằng phản ứng đóng vòng của monoacyl-5-nitro-o-phenylenediamin với andehyd [6]

N

N R

O2N

R'

NH2

N H

O2N

R' + RCHO Na2S2O5

Sơ đồ 1.6 Phản ứng đóng vòng monoacyl-5-nitro-o-phenylendiamin với andehyd

Gần đây, Navarte và cộng sự đã sử dụng công nghệ vi sóng trong phản ứng đóng vòng của o-phenylendiamin với andehyd trong tổng hợp dẫn chất 2-(alkyloxyaryl)-1H-benzimidazol với hiệu suất cao Phản ứng có 3 thành phần và không cần dung môi [13]

NH2

H

N R

+ ArCHO Na2S2O5

MW, 36-60 s

Sơ đồ 1.7 Phản ứng đóng vòng o-phenylendiamin với andehyd theo công nghệ vi sóng

16

1.3.1.3 Phản ứng với anhydrid

Phản ứng giữa anhydrid acid với o-Phenylendiamin sẽ tạo ra benzimidazol hoặc N,N-diacylphenylendiamin phụ thuộc vào điều kiện khác nhau [11] Thông thường, anhydrid acetic được sử dụng, ngoài ra hỗn hợp anhydrid formic-acetic và anhydride benzoic cũng tạo nhân benzimidazol thành công Sau đây là phản ứng tạo

benzimidazol từ phản ứng giữa o-Phenylendiamin với aicd acetic anhydrid trong

điều kiện đun hồi lưu trong vài giờ

Sơ đồ 1.8: Phản ứng đóng vòng o-Phenylendiamin với anhydric acetic

Các anhydrid của diacid như acid succinic phản ứng với o-phenylendiamin

cho acid β-(2-benzimidazole) propionic hay anhydrid phthalic cho acid benzimidazole)benzoic

o-(2-Sau đây là phản ứng tạo acid β-(2-benzimidazole) propionic:

Sơ đồ 1.9: o-Phenylendiamin đóng vòng với acid succinic

Ngoài ra, nhân benzimidazol có thể được tổng hợp bằng phản ứng đóng vòng

của o-phenylenendiamin hoặc dẫn chất với các dẫn chất khác nhau của acid

carboxylic như: nitril, imidat, orthoesterlacton [22]

1.3.2 Phản ứng của nhân benzimidazol

1.3.2.1 Phản ứng alkyl hóa

TLTK

N H

N

CH3

O2N

C6H5CH2Cl ClCOCH2Cl

Aceton/

K2CO3/khuấy nhiệt

độ phòng, 8 giờ

[14] ClCH2CN

DMF/NaH/khuấy nhiệt độ phòng, 8

giờ

N H

N R

N R

O2N

Cl

NC Br

N R

18

N H

N

O2N

BrCH2C6H5COOC2H5

THF/NaH/ủ qua đêm, điều kiện khí

argon

[23]

Năm 2009, K F Ansari, C Lal đã mô tả phương pháp tổng hợp một số dẫn chất benzimidazol mang nhóm thế ở vị trí C-2 và N-1 theo sơ đồ sau

N

HN

Một hỗn hợp gồm dung dịch kiềm NaOH 4N, 1H-benzimidazol 13a trong

methanol, và ethylcloroacetat trong methanol được đun nóng nhẹ trong nồi cách thủy trong 0,5 giờ Chất rắn thu được sau khi làm lạnh khối phản ứng được kết tinh

từ cloroform thu được hợp chất 13c

Ethylcloroacetat được thêm vào dung dịch của 2-methyl-1H-benzimidazol

13b trong aceton khan Sau đó K2CO3 được thêm vào và hỗn hợp phản ứng được đun hồi lưu trong 10 giờ Sau khi phản ứng xảy ra hoàn toàn, loại aceton và thu lấy

chất rắn, kết tinh lại trong ethanol thu được hợp chất 13d

1.3.2.2 Phản ứng nitro hóa vào vị trí C-5 của nhân benzimidazol

Thông thường, nitro hoá benzimidazol và dẫn chất thế C-2 benzimidazol thu được 5(6)-nitrobenzimidazol và dẫn chất theo sơ đồ phản ứng sau:

19

N H

N R HNO3/ H2SO4

N H

N R

O2N

R= H, alkyl, aryl, halogen

Sơ đồ 1.12 Phản ứng nitro hóa benzimidazol

Để thu được dẫn chất mono nitro phản ứng thường được thực hiện ở nhiệt độ không quá 35oC Khi nhiệt độ cao (khoảng 70o-80oC) dẫn chất 5,6dinitrobenzimidazol dễ được tạo ra

Năm 2010, M C Sharma và cộng sự đã mô tả phương pháp tổng hợp dẫn chất 5-nitrobenzimidazol có nhóm thế ở C-2, bằng cách nitro hóa dẫn chất benzimidazol mang nhóm thế ở vị trí C-2 bằng hỗn hợp sulfonitric (H2SO4 đặc : HNO3 đặc = 1 : 1) thu được dẫn chất 5-nitrobenzimidazol mong muốn [19]

Phương trình phản ứng như sau:

N

HN

RHNO3/H2SO4

N

HN

R

O2N

Sơ đồ 1.13 Phản ứng nitro hóa của nhân benzimidazol

Ngoài ra, nhân benzimidazol còn tham gia một số phản ứng acyl hóa, phản ứng halogen hóa, phản ứng sulfo hóa, phản ứng với hợp chất cơ kim [7],[12],[22]

20

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị dụng cụ

2.1.1 Nguyên liệu

Các hóa chất, dung môi dung trong quá trình thực nghiệm là loại dành cho tổng hợp của Công ty Hóa chất Đức Giang (Việt Nam), Trung Quốc, Đức

Bảng 2.1 Danh mục nguyên liệu, dung môi và hóa chất

STT Tên hóa chất Xuất xứ

21

2.1.2 Thiết bị

Bảng 2.2: Danh mục thiết bị thí nghiệm

6 Máy đo phổ 1

H-NMR Bruker AV-500MHz (Viện

HH - Viện Hàn lâm KH& CN Việt Nam)

Mỹ

7 Máy đo phổ IR Impact 410 (Viện Hóa học - Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam)

Mỹ

8 Máy đo phổ MS LC-MSD Trap SL (Viện HH - Viện

Hàn lâm KH& CN Việt Nam)

Mỹ

22

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Tổng hợp một số dẫn chất benzimidazol-2-yl propanoat và một số dẫn chất theo sơ đồ sau:

23

Bảng 2.3: Các dẫn chất benzimidazol-2-propanoat được tổng hợp

Công thức Danh pháp

Acid 3-(benzimidazol-2-yl)propanoic (1)

Methyl 3-(5-nitro-benzimidazol-2-yl) propanoat

25

– Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được

– Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của chất 1,2a, 2b, 3a, 4a, 5b, 6, 7a, 7b – Thử hoạt tính chống ung thư của các chất 2a, 2b, 3a, 4a, 5b, 7a, 7b

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Tổng hợp hóa học

– Sử dụng phương pháp tổng hợp hóa học, dựa trên phản ứng:

 Phản ứng đóng vòng tạo dẫn chất ester 3-(benzimidazol-2-yl)propanoat

 Phản ứng nitro hóa bằng tác nhân HNO3/H2SO4

 Phản ứng tổng hợp ester bằng tác nhân SOCl2

 Phản ứng thế N1 của ester 3-(benzimidazol-2-yl)propanoat

– Dùng SKLM để theo dõi quá trình tiến triển của phản ứng

– Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng SKLM và nhiệt độ nóng chảy

* Phổ khối lượng (MS): phổ khối lượng các chất được ghi tại Viện Hóa học

và Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, máy đo LC/MSD Trap Agilent hoặc Agilent 6310 với chế độ đo ESI hoặc LC-MS [5,[28]

Gram(-Tất cả các chất tổng hợp được đem thử hoạt tính theo phương pháp khuếch tán trên thạch và sau đó đo kích thước vòng vô khuẩn Chọn chất đối chiếu là penicillin và streptomycin với kháng khuẩn Chọn intraconazol là chất đối chiếu với phương pháp kháng nấm

- Mẫu thử được pha vào dung môi thích hợp (ethanol) với nồng độ 100 µg/ml Các chất đối chiếu cũng được pha vào dung môi thích hợp gồm Penicilin (Peni) 27 UI/ml, Streptomycin (Strep) 14 µg/ml và Intraconazol (Intra) 50 µg/ml

- Các khoanh giấy lọc vô trùng, đã sấy khô được tẩm 3 lần với dung dịch mẫu thử Sau mỗi lần tẩm, các khoanh giấy lọc có chứa mẫu thử đều được sấy <

600C đến khô hết dung môi Làm tương tự với các chất đối chiếu

- Với vi khuẩn: VSV kiểm định được cấy vào môi trường canh thang, ủ ở 37°C trong 18 – 24h để tạo thành hỗn dịch VSV có nồng độ 107 tế bào/ml (kiểm tra bằng pha loãng và dãy dịch chuẩn) Môi trường thạch vô trùng (tiệt trùng ở

1180C/30 phút) được làm lạnh về 45 – 500C và được cấy giống VSV kiểm định vào với tỷ lệ 2,5 ml/ 100 ml Lắc tròn để VSV kiểm định phân tán đều vào môi trường thạch thường, rồi đổ vào các đĩa petri vô trùng với thể tích 20 ml/đĩa và để cho thạch đông lại

- Với vi nấm: vi nấm kiểm định được cấy vào môi trường Sabouraud lỏng, rồi nuôi cấy cho phát triển trong tủ ấm 28 – 300C trong 18 – 24h đến nồng độ 107 tế

bào/ml (kiểm tra bằng pha loãng và dãy dịch chuẩn) Đối với Aspergillus niger thì

27

sử dụng dung dịch Tween 80 nồng độ 0,2% vô trùng Môi trường Sabouraud đặc vô trùng (tiệt trùng ở 1180C/30 phút) được làm lạnh về 45 – 500C và được cấy giống VSV kiểm định vào với tỷ lệ 2,5 ml/ 100 ml Lắc tròn để VSV kiểm định phân tán đều trong môi trường thạch, rồi đổ vào các đĩa petri vô trùng với thể tích 20 ml/đĩa

và để cho thạch đông lại

- Đặt khoanh giấy lọc: khoanh giấy lọc (đường kính Φ = 6,0 mm) đã được tẩm chất thử và xử lý như trên được đặt lên bề mặt môi trường thạch chứa VSV kiểm định theo sơ đồ định sẵn

- Các đĩa petri có mẫu thử được ủ trong tủ ấm ở 37ºC trong 18 – 24h (đối với

vi khuẩn) và ở 28 – 300C trong 24 – 48h (đối với vi nấm) Mỗi mẫu được thử song song trên 3 đĩa với cùng 1 loại VSV kiểm định

- Đánh giá kết quả: Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẹp Palmer có

độ chính xác 0,02 mm Kết quả được đánh giá dựa trên đường kính vòng vô khuẩn

và được xử lý theo công thức:

2.2.4 Thử hoạt tính chống tế bào ung thư