TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT ACID HYDROXAMIC HƯỚNG ỨC CHẾ ENZYM HISTON DEACETYLASE

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT ACID HYDROXAMIC HƯỚNG ỨC CHẾ ENZYM HISTON DEACETYLASE. Mục tiêu của luận án 1. Thiết kế và tổng hợp được khoảng 40 50 dẫn chất acid hydroxamic mới hướng ức chế HDAC. 2. Thử tác dụng ức chế HDAC và tác dụng kháng tế bào ung thư của các chất tổng hợp được.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐÀO THỊ KIM OANH TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT ACID HYDROXAMIC HƯỚNG ỨC CHẾ ENZYM HISTON DEACETYLASE TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA DƯỢC MÃ SỐ: 62.72.04.03 HÀ NỘI, 2013 CÔNG TRÌNH ĐÃ HOÀN THÀNH TẠI: Trường đại học Dược Hà Nội NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Nguyễn Hải Nam GS.TS. Sang-Bae Han 1 I. MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Một trong những đích tác dụng phân tử đang được chú ý hiện nay là các histon deacetylase (HDAC). Nghiên cứu về các HDAC đã xác định hoạt động bất thường của HDAC có liên quan đến nhiều bệnh ung thư. Vì vậy, các chất ức chế HDAC đang trở thành các tác nhân chống ung thư đầy triển vọng. Acid suberoylanilid hydroxamic(SAHA) (Zolinza ® , 2006) và depsipeptid (Romidepsin ® , 2009) là hai chất ức chế HDAC đã được Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ (US-FDA) phê duyệt trong điều trị u lympho da tế bào T. Bên cạnh đó, một số chất ức chế HDAC khác cũng đang được nghiên cứu và trải qua các pha thử lâm sàng như NVL-LAQ824, MS-275, CI-994, PXD-101 Các chất ức chế HDAC được chia thành 5 nhóm dựa theo cấu trúc hóa học, trong đó các dẫn chất acid hydroxamic được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu nhiều nhất do cấu trúc đơn giản dễ tổng hợp, hoạt tính ức chế HDAC mạnh. Hội nhập với xu hướng nghiên cứu của thế giới và tìm kiếm chất ức chế HDAC có hoạt tính kháng tế bào ung thư tốt, luận án “Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của một số dẫn chất acid hydroxamic hướng ức chế enzym histon deacetylase” được thực hiện với 2 mục tiêu. 2. Mục tiêu của luận án 1. Thiết kế và tổng hợp được khoảng 40 - 50 dẫn chất acid hydroxamic mới hướng ức chế HDAC. 2. Thử tác dụng ức chế HDAC và tác dụng kháng tế bào ung thư của các chất tổng hợp được. 3. Những đóng góp mới của luận án Về thiết kế và tổng hợp các dẫn chất acid hydroxamic Đã thiết kế, tổng hợp và khẳng định cấu trúc của 51 acid hydroxamic mới, chưa thấy công bố trong các tài liệu tham khảo được. Về thử hoạt tính sinh học của các chất Thử tác dụng ức chế HDAC bằng phân tích Western blot của 51 dẫn chất cho thấy ở nồng độ 10 µg/ml, các chất 7a-d, 9a-h có hoạt tính. Với hoạt tính mạnh hơn, các chất 9a-h còn thể hiện tác dụng ức chế HDAC ở nồng độ 1 µg/ml. Định lượng tác dụng ức chế HDAC2 đối với các chất 9a-h, chất 23 cho thấy cả 9 chất đều ức chế HDAC2 với IC 50 mạnh hơn SAHA từ 2 – 20 lần. 51 dẫn chất được thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro theo phương pháp MTT. Kết quả 15 chất đã có khả năng ức chế sự phát triển 2 tế bào trên cả 5 dòng tế bào thử nghiệm và chất 9b, 9g tác dụng tương đương SAHA. Chất 9g với hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro và ức chế HDAC tốt được lựa chọn thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vivo. Thử nghiệm trên mô hình ghép dị chủng trên chuột trụi lông với dòng tế bào ung thư tiền liệt tuyến (PC-3) cho thấy ở nồng độ 30 µg/ml, chất 9g ức chế sự phát triển khối u tương đương SAHA. 4. Bố cục luận án Luận án có 152 trang, 28 bảng, 73 hình, 33 sơ đồ. Bố cục gồm các phần: Đặt vấn đề (1 trang), tổng quan (46 trang), nguyên liệu, thiết bị, nội dung và phương pháp nghiên cứu (10 trang), kết quả nghiên cứu (53 trang), bàn luận (41 trang), kết luận và kiến nghị (2 trang), danh mục các bài báo đã công bố liên quan đến luận án (1 trang). Luận án có 92 tài liệu tham khảo (7 trang) và 61 phụ lục (106 trang). II. NỘI DUNG LUẬN ÁN Chương 1. TỔNG QUAN Tổng quan đã trình bày về: - Histon deacetylase (HDAC): phân loại, cấu trúc; mối liên quan giữa ung thư và sự bất thường hoạt động của HDAC. - Các chất ức chế HDAC: phân loại, cơ chế tác dụng và cấu trúc. - Tổng hợp tình hình nghiên cứu trên thế giới về các chất ức chế HDAC, đặc biệt chú trọng đến các hydroxamat và dẫn chất. - Các phương pháp tạo liên kết amid, tổng hợp các acid hydroxamic. Chương 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu, thiết bị - Các nguyên liệu, hóa chất, dung môi: Đức, Trung Quốc, Việt Nam. - Các dụng cụ thí nghiệm thông thường dùng trong tổng hợp hữu cơ. - Các máy đo nhiệt độ nóng chảy, phổ hồng ngoại, phổ khối, phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Máy đo độ hấp thụ huỳnh quang, tủ nuôi cấy, máy điện di. - Các dòng tế bào ung thư người thử nghiệm. 2.2. Nội dung nghiên cứu - Thiết kế và tổng hợp 51 dẫn chất acid hydroxamic. - Khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp dựa trên phân tích dữ liệu phổ khối (MS), phổ hồng ngoại (IR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR, 13 C-NMR). 3 - Thử tác dụng ức chế HDAC của các chất tổng hợp được và định lượng tác dụng ức chế HDAC2 của một số chất. - Thử hoạt tính kháng dòng tế bào ung thư người in vitro của các chất tổng hợp được. - Thử hoạt tính kháng dòng tế bào ung thư người in vivo của một chất đại diện. Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Tổng hợp hóa học và phân tích dữ liệu phổ 3.1.1. Nhóm các dẫn chất acid hydroxamic mang khung benzothiazol Gồm 6 dãy chất 3a-f, 5a-f, 7a-f, 9a-h, 11a-d, 13a-f và chất 23 được tổng hợp theo các sơ đồ dưới đây: a) Dãy 3a-f, 5a-f, 7a-f và 9a-h b) Chất 23 c) Dãy 11a-d và 13a-f 4 3.1.2. Nhóm các dẫn chất của SAHA Gồm 2 dãy dẫn chất 17a-c, f, h; 20a-f và chất 26 được tổng hợp theo sơ đồ sau: a) Dãy 17a-c, f, h và 20a-f b) Chất 26 i) Acid adipic monomethyl ester CDI, DCM, DMF ii) LiOH, MeOH, DCM NaOH, MeOH NH 2 OH.HCl CDI, DMF,TEA NH 2 H N OH O H N H N O OCH 3 O O H N H N O NHOH O O 4 4 2 4 2 Alanin methyl ester Cl Cl Cl Cl 26 O Bảng 3.13. Tóm tắt kết quả tổng hợp các dẫn chất trong luận án TT Chất CTCT H (%) Rf* t nc ( o C) Dãy các chất 3a-f 1 3a S N N H NHOH O O 51,2 0,58 250-251 2 3b S N N H NHOH O OH 3 C 40,5 0,52 252-253 3 3c S N N H NHOH O OH 3 CO 40,6 0,46 215-216 4 3d S N N H NHOH O OC 2 H 5 O 32,3 0,54 232-234 5 3e S N N H NHOH O OH 3 CO 2 S 51,1 0,34 330-331 6 3f S N N H NHOH O OO 2 N 63,6 0,35 265-266 Dãy các chất 5a-f 7 5a S N N H O NHOH O 72,0 0,40 149-150 8 5b S N N H O NHOH O H 3 C 68,0 0,40 180-182 9 5c S N N H O NHOH O H 3 CO 66,0 0,40 189-191 5 10 5d S N N H O NHOH O C 2 H 5 O 65,0 0,41 176-177 11 5e S N N H O NHOH O H 3 CO 2 S 53,0 0,39 148-149 12 5f S N N H O NHOH O O 2 N 42,0 0,39 171-173 Dãy các chất 7a-f 13 7a S N N H O NHOH O 78,0 0,44 176-177 14 7b S N N H O NHOH OH 3 C 78,0 0,48 204-205 15 7c S N N H O NHOH OH 3 CO 84,0 0,41 189-190 16 7d S N N H O NHOH OC 2 H 5 O 86,0 0,42 193-194 17 7e S N N H O NHOH OH 3 CO 2 S 74,0 0,39 220-221 18 7f S N N H O NHOH OO 2 N 80,0 0,39 214-215 Dãy các chất 9a-h 19 9a S N N H O NHOH O 83,3 0,42 176-177 20 9b S N N H O NHOH OH 3 C 80,9 0,45 204-205 21 9c S N N H O NHOH OH 3 CO 90,3 0,43 189-190 22 9d S N N H O NHOH OC 2 H 5 O 83,3 0,46 193-194 23 9e S N N H O NHOH OH 3 CO 2 S 90,5 0,40 220-221 24 9f S N N H O NHOH OO 2 N 80,0 0,38 214-215 25 9g S N N H O NHOH OCl 78,0 0,37 196-198 26 9h S N N H O NHOH OF 3 C 75,0 0,40 186-187 Dãy các chất 11a-d 27 11a S N N H O O NH NHOH O 90,6 0,39 178-180 28 11b S N N H O O NH H 3 C NHOH O 89,9 0,40 189-190 29 11c S N N H O O NH H 3 CO NHOH O 74,5 0,42 194-196 30 11d S N N H O O NH C 2 H 5 O NHOH O 68,5 0,38 182-184 6 Dãy các chất 13a-f 31 13a S N N H O NH O NHOH O 86,7 0,36 187-188 32 13b S N N H O H 3 C NH O NHOH O 82,4 0,39 194-195 33 13c S N N H O H 3 CO NH O NHOH O 93,3 0,40 198-199 34 13d S N N H O C 2 H 5 O NH O NHOH O 88,2 0,40 186-187 35 13e S N N H O H 3 CO 2 S NH O NHOH O 85,0 0,36 210-211 36 13f S N N H O O 2 N NH O NHOH O 50,0 0,31 230-231 Dãy các chất 17a-c, f, h 37 17a H N O N H O NHOH O 34,4 0,30 197-198 38 17b H N O N H O NHOH O F 50,2 0,30 195-196 39 17c H N O N H O NHOH O Cl 42,1 0,32 189-190 40 17f H N O N H O NHOH O H 3 CO 79,1 0,27 205-206 41 17h H N O N H O NHOH O NC 36,5 0,28 195-197 Dãy các chất 20a-h 42 20a H N O NH O NHOH O 50,5 0,37 189-191 43 20b H N O NH O NHOH O F 51,2 0,27 173-174 44 20c H N O NH O NHOH O Cl 42,2 0,29 172-173 45 20d H N O NH O NHOH O Cl 42,0 0,31 162-163 46 20e H N O NH O NHOH O Cl 63,0 0,29 128-130 47 20f H N O NH O NHOH O H 3 CO 55,0 0,34 178-179 48 20g H N O NH O NHOH O O 2 N 56,0 0,32 175-176 49 20h H N O NH O NHOH O NC 50,0 0,28 185-186 50 23 S N N H O NHOH O 47,8 0,37 166-167 51 26 Cl H N N H NHOH O O O 81,5 0,41 187-188 7 * Hệ dung môi sắc ký: DCM-MeOH-AcOH (90:10:1). Các chất 9a-h, 23, 26 hệ dung môi sắc ký DCM-MeOH-AcOH (90:8:1). Dung môi kết tinh: Nước-HCl 5%. 3.2. Hoạt tính sinh học 3.2.1. Tác dụng ức chế HDAC Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp được đánh giá gián tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon H3, H4 trong tế bào ung thư đại tràng SW620. Phân tích dựa trên Western blot có thể khẳng định được tác dụng của các mẫu thử làm tăng hoặc giảm sự acetyl hóa histon H3, H4 khi so sánh với mẫu trắng. Thử nghiệm được tiến hành tại khoa Dược, đại học Chungbuk (Cheongju, Hàn Quốc). Các chất được đánh giá tác dụng ức chế HDAC ở nồng độ 10 g/ml, nếu có tác dụng thì tiếp tục được đánh giá ở nồng độ 1 g/ml. Kết quả các chất 7a- f, 9a-h, chất 23 có tác dụng ức chế HDAC được trình bày trong bảng 3.14, những chất còn lại không ức chế HDAC ở nồng độ 10 g/ml. Bảng 3.14. Tác dụng ức chế HDAC của một số chất tổng hợp TT Chất Tác dụng ức chế HDAC 10  g/ml 1  g/ml Các dẫn chất benzothiazol S N R N H O O NHOH m Các chất có cầu nối 4C (m = 4) 1 7a (R = - H) + - 2 7b (R = - CH 3 ) + - 3 7c (R = - OCH 3 ) + - 4 7d (R = - OC 2 H 5 ) + - 5 7e (R = - SO 2 CH 3 ) - - 6 7f (R = - NO 2 ) - - Các chất có cầu nối 6C (m = 6) 7 9a (R = - H) + + 8 9b (R = - CH 3 ) + + 9 9c (R = - OCH 3 ) + + 10 9d (R = - OC 2 H 5 ) + - 11 9e (R = - SO 2 CH 3 ) + - 12 9f (R = - NO 2 ) + + 13 9g (R = - Cl) + + 14 9h (R = - CF 3 ) + + 15 23 (vòng thiazol) + + SAHA** KT + * KT: Không thử; ** Chuẩn dương tính 8 * Nhận xét: Kết quả phân tích Western blot cho thấy 4 chất mang khung benzothiazol có cầu nối 4C (7a-d) ức chế HDAC ở nồng độ 10 g/ml. Với tác dụng mạnh hơn, hầu hết các chất mang khung benzothiazol cầu nối 6C (9a-c, 9f-h) và chất 23 (cấu trúc vòng thiazol, cầu nối 6C) đều thể hiện tác dụng ở nồng độ 1 g/ml. Dựa trên kết quả phân tích Western blot, các chất 9a-h và chất 23 được lựa chọn để định lượng tác dụng ức chế HDAC2. Kết quả IC 50 của các chất 9a-h, 23 trên HDAC2 được trình bày trong bảng 3.15. Bảng 3.15. Kết quả định lượng tác dụng ức chế HDAC2 của các chất 9a-h, 23 TT Chất IC 50 KLPT (g/ml) (M) 1 9a (R = -H) 0,013 0,040 321,39 2 9b (R = -CH 3 ) 0,036 0,107 335,42 3 9c (R = -OCH 3 ) 0,039 0,102 351,42 4 9d (R = -OC 2 H 5 ) 0,159 0,435 365,45 5 9e (R = -SO 2 CH 3 ) 0,120 0,300 399,49 6 9f (R = -NO 2 ) 0,009 0,024 366,39 7 9g (R = -Cl) 0,050 0,140 355,84 8 9h (R = -CF 3 ) 0,262 0,673 389,39 9 23 (vòng thiazol) 0,157 0,578 271,34 SAHA 0,530 2,005 264,30 * Nhận xét: Cả 9 chất đều có khả năng ức chế HDAC2 mạnh hơn cả SAHA với giá trị IC 50 từ 0,013 – 0,262 g/ml. 3.2.2. Hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro Các chất tổng hợp được đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư người trên dòng tế bào SW620 (ung thư đại tràng). Nếu có tác dụng kháng dòng tế bào trên thì tiếp tục được thử nghiệm trên 4 dòng tế bào khác: MCF-7 (ung thư vú), PC-3 (ung thư tiền liệt tuyến), AsPC-1 (ung thư tụy), NCI-H460 (ung thư phổi). Thử nghiệm được tiến hành tại khoa Dược, đại học Chungbuk (Cheongju, Hàn Quốc) theo phương pháp MTT. Kết quả giá trị IC 50 của các chất có hoạt tính (dãy 5, 7, 9 và chất 23) được trình bày trong bảng 3.16. Những chất dãy 3, 11, 13, 17, 20 và chất 26 đều không kháng dòng tế bào SW620. [...]... phép khẳng định chất 23 đã được tổng hợp và sản phẩm tinh khiết 4.3 Hoạt tính sinh học Dựa trên cấu trúc của acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA), 51 dẫn chất acid hydroxamic của luận án được thiết kế với đích tác dụng hướng ức chế HDAC 4.3.1 Các acid hydroxamic mang khung benzothiazol Từ cấu trúc của SAHA và qua tham khảo nhiều bài báo, dãy dẫn chất đầu tiên được tổng hợp có cấu trúc nhân phenyl thay... HDAC và ức chế sự phát triển tế bào Mặt khác, không quan sát thấy ảnh hưởng của tính chất hút - đẩy điện tử của các nhóm thế đến hoạt tính sinh học của các acid benzothiazol -hydroxamic Lựa chọn được độ dài cầu nối, tổng hợp chất 23 có vòng thiazol thay cho vòng benzothiazol Độc tính của chất 23 trên 5 dòng tế bào thử nghiệm đều lớn hơn so với chất 9a (bảng 3.16) Từ kết quả thử hoạt tính sinh học có thể... âm tính trên thử nghiệm Western blot, độc tính trên 5 dòng tế bào cũng rất kém Hoạt tính ức chế sự phát triển tế bào của 2 chất này yếu hơn cả 9a là chất không 20 gắn nhóm thế Như vậy, việc gắn các nhóm thế nhỏ vào vị trí 6 trên vòng benzothiazol đem lại hoạt tính tốt Các nhóm thế cồng kềnh có vẻ không thích hợp cho tương tác với phần vành của túi enzym, từ đó dẫn đến giảm hoạt tính ức chế HDAC và ức. .. Thị Mỹ Huệ, Nguyễn Hải Nam (2011), Tổng hợp N1(benzo[d]thiazol-2-yl)-N8-hydroxyoctandiamid và dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase , Tạp chí dược học 51 (424), 45-49 4 Đào Thị Kim Oanh, Sang-Bae Han, Trần Thị Oanh, Nguyễn Hải Nam (2011), Tổng hợp một số dẫn chất phenylsuccinamid và phenylglutaramid hướng ức chế histon deacetylase , Tạp chí nghiên cứu dược và thông tin thuốc 2 (3), 88-93 5 Đào... Han, Nguyễn Hải Nam (2011), Tổng hợp N1-(benzo[d]thiazol-2-yl)-N4-hydroxysuccinamid và dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase , Tạp chí dược học 51 (420), 47-51 2 Đào Thị Kim Oanh, Sang-Bae Han, Hoàng Văn Hải, Trần Văn Nam, Văn Thị Mỹ Huệ, Nguyễn Hải Nam (2011), Tổng hợp N1(benzo[d]thiazol-2-yl)-N6-hydroxyadipamid và dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase , Tạp chí dược học 51 (423), 55-59 3 Đào... Với hoạt tính mạnh hơn, các chất 9a-h còn thể hiện tác dụng ức chế HDAC ở nồng độ 1 µg/ml Định lượng tác dụng ức chế HDAC2 đối với các chất 9a-h, chất 23 cho thấy cả 9 chất đều ức chế HDAC2 với IC50 mạnh hơn SAHA từ 2 – 20 lần - 51 dẫn chất được thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro theo phương pháp MTT Kết quả các chất 7a-f đã có khả năng ức chế sự phát triển tế bào trên cả 5 dòng tế bào thử. .. hóa cho phản ứng tổng hợp acid hydroxamic từ acid carboxylic, một loạt các phản ứng tạo liên kết amid để tổng hợp các ester trung gian của các dãy chất 7, 9, 11, 13, 17 và 20 và chất 22 được tiến hành cũng dùng CDI 13 4.1.3 Tác nhân acyl hóa là ester Phản ứng tổng hợp các acid hydroxamic từ ester và hydroxylamin chỉ xảy ra ở pH > 10 Phương pháp tổng hợp chủ yếu là dùng xúc tác base và ester trong alcol... cứu sâu hơn và rất có triển vọng để trở thành ứng viên thử nghiệm lâm sàng KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1 Kết luận 1) Về tổng hợp và khẳng định cấu trúc của các chất Đã tổng hợp được 51 dẫn chất acid hydroxamic mới, chưa thấy công bố trong các tài liệu tham khảo được 51 dẫn chất này được chia thành 2 nhóm cấu trúc: - Các acid hydroxamic mang khung benzothiazol (dãy chất 3, 5, 7, 9, 11 và 13) (36 chất) có cấu... khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp nhờ phân tích các dữ liệu của phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR) 2) Về thử hoạt tính sinh học của các chất - Thử tác dụng ức chế HDAC bằng phân tích Western blot cho thấy ở nồng độ 10 µg/ml, các chất 7a-d, 9a-h có hoạt tính Kết quả thể hiện bằng sự không xuất hiện của các dải protein acetyl histon H-3, H-4 trên... thể thấy các acid benzothiazolhydroxamic cầu nối 6 carbon cho tác dụng tốt nhất Điều này một lần nữa khẳng định sự phù hợp của vòng benzothiazol cho vai trò nhóm khóa hoạt động và cầu nối 6 carbon trong thiết kế các acid hydroxamic hướng ức chế HDAC của luận án 4.3.2 Các acid hydroxamic mạch alkyl có liên kết amid Qua tham khảo nhiều bài báo, việc thay đổi cầu nối alkyl cũng là hướng tổng hợp được nhiều