TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT ACID HYDROXAMIC HƯỚNG ỨC CHẾ ENZYM HISTON DEACETYLASE

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT ACID HYDROXAMIC HƯỚNG ỨC CHẾ ENZYM HISTON DEACETYLASE. Mục tiêu của luận án 1. Thiết kế và tổng hợp được khoảng 40 50 dẫn chất acid hydroxamic mới hướng ức chế HDAC. 2. Thử tác dụng ức chế HDAC và tác dụng kháng tế bào ung thư của các chất tổng hợp được.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐÀO THỊ KIM OANH

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ

DẪN CHẤT ACID HYDROXAMIC HƯỚNG ỨC CHẾ ENZYM HISTON

DEACETYLASE

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: HÓA DƯỢC

HÀ NỘI, 2013

CÔNG TRÌNH ĐÃ HOÀN THÀNH TẠI: Trường đại học Dược Hà Nội

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Nguyễn Hải Nam

GS.TS Sang-Bae Han

I MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của luận án

Một trong những đích tác dụng phân tử đang được chú ý hiện nay là các histon deacetylase (HDAC) Nghiên cứu về các HDAC đã xác định hoạt động bất thường của HDAC có liên quan đến nhiều bệnh ung thư

Vì vậy, các chất ức chế HDAC đang trở thành các tác nhân chống ung thư đầy triển vọng Acid suberoylanilid hydroxamic(SAHA) (Zolinza®, 2006) và depsipeptid (Romidepsin®, 2009) là hai chất ức chế HDAC đã được Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ (US-FDA) phê duyệt trong điều trị u lympho da tế bào T Bên cạnh đó, một số chất ức chế HDAC khác cũng đang được nghiên cứu và trải qua các pha thử lâm sàng như NVL-LAQ824, MS-275, CI-994, PXD-101 Các chất ức chế HDAC được chia thành 5 nhóm dựa theo cấu trúc hóa học, trong đó các dẫn chất acid hydroxamic được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu nhiều nhất do cấu trúc đơn giản dễ tổng hợp, hoạt tính ức chế HDAC mạnh

Hội nhập với xu hướng nghiên cứu của thế giới và tìm kiếm chất ức chế HDAC có hoạt tính kháng tế bào ung thư tốt, luận án “Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của một số dẫn chất acid hydroxamic hướng

ức chế enzym histon deacetylase” được thực hiện với 2 mục tiêu

2 Mục tiêu của luận án

1 Thiết kế và tổng hợp được khoảng 40 - 50 dẫn chất acid hydroxamic mới hướng ức chế HDAC

2 Thử tác dụng ức chế HDAC và tác dụng kháng tế bào ung thư của các chất tổng hợp được

3 Những đóng góp mới của luận án

Về thiết kế và tổng hợp các dẫn chất acid hydroxamic

Đã thiết kế, tổng hợp và khẳng định cấu trúc của 51 acid hydroxamic mới, chưa thấy công bố trong các tài liệu tham khảo được

Về thử hoạt tính sinh học của các chất

Thử tác dụng ức chế HDAC bằng phân tích Western blot của 51 dẫn chất cho thấy ở nồng độ 10 µg/ml, các chất 7a-d, 9a-h có hoạt tính Với hoạt tính mạnh hơn, các chất 9a-h còn thể hiện tác dụng ức chế HDAC ở nồng độ 1 µg/ml Định lượng tác dụng ức chế HDAC2 đối với các chất 9a-h, chất 23 cho thấy cả 9 chất đều ức chế HDAC2 với IC50 mạnh hơn SAHA từ 2 – 20 lần

51 dẫn chất được thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro theo

phương pháp MTT Kết quả 15 chất đã có khả năng ức chế sự phát triển

tế bào trên cả 5 dòng tế bào thử nghiệm và chất 9b, 9g tác dụng tương đương SAHA

Chất 9g với hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro và ức chế HDAC tốt được lựa chọn thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vivo Thử

nghiệm trên mô hình ghép dị chủng trên chuột trụi lông với dòng tế bào ung thư tiền liệt tuyến (PC-3) cho thấy ở nồng độ 30 µg/ml, chất 9g ức chế sự phát triển khối u tương đương SAHA

4 Bố cục luận án

Luận án có 152 trang, 28 bảng, 73 hình, 33 sơ đồ Bố cục gồm các phần: Đặt vấn đề (1 trang), tổng quan (46 trang), nguyên liệu, thiết bị, nội dung và phương pháp nghiên cứu (10 trang), kết quả nghiên cứu (53 trang), bàn luận (41 trang), kết luận và kiến nghị (2 trang), danh mục các bài báo đã công bố liên quan đến luận án (1 trang) Luận án có 92 tài liệu tham khảo (7 trang) và 61 phụ lục (106 trang)

II NỘI DUNG LUẬN ÁN Chương 1 TỔNG QUAN

Tổng quan đã trình bày về:

- Histon deacetylase (HDAC): phân loại, cấu trúc; mối liên quan giữa ung thư và sự bất thường hoạt động của HDAC

- Các chất ức chế HDAC: phân loại, cơ chế tác dụng và cấu trúc

- Tổng hợp tình hình nghiên cứu trên thế giới về các chất ức chế HDAC, đặc biệt chú trọng đến các hydroxamat và dẫn chất

- Các phương pháp tạo liên kết amid, tổng hợp các acid hydroxamic Chương 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, thiết bị

- Các nguyên liệu, hóa chất, dung môi: Đức, Trung Quốc, Việt Nam

- Các dụng cụ thí nghiệm thông thường dùng trong tổng hợp hữu cơ

- Các máy đo nhiệt độ nóng chảy, phổ hồng ngoại, phổ khối, phổ cộng hưởng từ hạt nhân Máy đo độ hấp thụ huỳnh quang, tủ nuôi cấy, máy điện di

- Các dòng tế bào ung thư người thử nghiệm

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Thiết kế và tổng hợp 51 dẫn chất acid hydroxamic

- Khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp dựa trên phân tích dữ liệu phổ khối (MS), phổ hồng ngoại (IR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR)

- Thử tác dụng ức chế HDAC của các chất tổng hợp được và định lượng tác dụng ức chế HDAC2 của một số chất

- Thử hoạt tính kháng dòng tế bào ung thư người in vitro của các chất

tổng hợp được

- Thử hoạt tính kháng dòng tế bào ung thư người in vivo của một chất

đại diện

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Tổng hợp hóa học và phân tích dữ liệu phổ

3.1.1 Nhóm các dẫn chất acid hydroxamic mang khung benzothiazol

Gồm 6 dãy chất 3a-f, 5a-f, 7a-f, 9a-h, 11a-d, 13a-f và chất 23 được tổng hợp theo các sơ đồ dưới đây:

a) Dãy 3a-f, 5a-f, 7a-f và 9a-h

b) Chất 23

c) Dãy 11a-d và 13a-f

O 4

Bảng 3.13 Tóm tắt kết quả tổng hợp các dẫn chất trong luận án

Dãy các chất 3a-f

1 3a

S N

7 5a

S N N O

NHOH O

72,0 0,40 149-150

8 5b

S N N O

NHOH O

66,0 0,40 189-191

10 5d

S N N O

NHOH O

C 2 H 5 O

65,0 0,41 176-177

11 5e

S N N O

NHOH O

H 3 CO 2 S

53,0 0,39 148-149

12 5f

S N N O

NHOH O

O 2 N

42,0 0,39 171-173 Dãy các chất 7a-f

13 7a

S N N O

NHOH

O

O 2 N

80,0 0,39 214-215 Dãy các chất 9a-h

19 9a

S N N O

NHOH

O Cl

78,0 0,37 196-198

26 9h

S N N O

NHOH

O

F 3 C

75,0 0,40 186-187 Dãy các chất 11a-d

27 11a

S N N O

O NH

O NH

O NH

C 2 H 5 O

NHOH

O

68,5 0,38 182-184

Dãy các chất 13a-f

31 13a

S N N O

NH O NHOH

O

86,7 0,36 187-188

32 13b

S N N O

H 3 C

NH O NHOH

O

82,4 0,39 194-195

33 13c

S N N O

H 3 CO

NH O NHOH

O

93,3 0,40 198-199

34 13d

S N N O

C 2 H 5 O

NH O NHOH

O

88,2 0,40 186-187

35 13e

S N N O

H 3 CO 2 S

NH O NHOH

O

85,0 0,36 210-211

36 13f

S N N O

O 2 N

NH O NHOH O

50,0 0,31 230-231 Dãy các chất 17a-c, f, h

37 17a

H O N O NHOH O

34,4 0,30 197-198

38 17b

H O N O NHOH O

NHOH O

NHOH O

H 3 CO

79,1 0,27 205-206

41 17h

H O N O NHOH O

NC

36,5 0,28 195-197 Dãy các chất 20a-h

42 20a

H O NH O NHOH O

50,5 0,37 189-191

43 20b

H O NH O NHOH O

F

51,2 0,27 173-174

44 20c

H O NH O NHOH O

O NHOH O Cl

42,0 0,31 162-163

46 20e

H

O NH

O NHOH O Cl

63,0 0,29 128-130

47 20f

H O NH O NHOH O

H 3 CO

55,0 0,34 178-179

48 20g

H O NH O NHOH O

NC

50,0 0,28 185-186

50 23

S N N O

* Hệ dung môi sắc ký: DCM-MeOH-AcOH (90:10:1) Các chất 9a-h, 23, 26 hệ dung môi sắc ký DCM-MeOH-AcOH (90:8:1) Dung môi kết tinh: Nước-HCl 5%

3.2 Hoạt tính sinh học

3.2.1 Tác dụng ức chế HDAC

Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp được đánh giá gián tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon H3, H4 trong tế bào ung thư đại tràng SW620 Phân tích dựa trên Western blot có thể khẳng định được tác dụng của các mẫu thử làm tăng hoặc giảm sự acetyl hóa histon H3, H4 khi so sánh với mẫu trắng Thử nghiệm được tiến hành tại khoa Dược, đại học Chungbuk (Cheongju, Hàn Quốc) Các chất được đánh giá tác dụng ức chế HDAC ở nồng độ 10 g/ml, nếu có tác dụng thì tiếp tục được đánh giá ở nồng độ 1 g/ml Kết quả các chất 7a-

f, 9a-h, chất 23 có tác dụng ức chế HDAC được trình bày trong bảng 3.14, những chất còn lại không ức chế HDAC ở nồng độ 10 g/ml

R

N

NHOH m

* Nhận xét:

Kết quả phân tích Western blot cho thấy 4 chất mang khung benzothiazol có cầu nối 4C (7a-d) ức chế HDAC ở nồng độ 10 g/ml Với tác dụng mạnh hơn, hầu hết các chất mang khung benzothiazol cầu nối 6C (9a-c, 9f-h) và chất 23 (cấu trúc vòng thiazol, cầu nối 6C) đều thể hiện tác dụng ở nồng độ 1 g/ml

Dựa trên kết quả phân tích Western blot, các chất 9a-h và chất 23 được lựa chọn để định lượng tác dụng ức chế HDAC2 Kết quả IC50 của các chất 9a-h, 23 trên HDAC2 được trình bày trong bảng 3.15

Bảng 3.15 Kết quả định lượng tác dụng ức chế HDAC2 của các chất

3.2.2 Hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro

Các chất tổng hợp được đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư người trên dòng tế bào SW620 (ung thư đại tràng) Nếu có tác dụng kháng dòng tế bào trên thì tiếp tục được thử nghiệm trên 4 dòng tế bào khác: MCF-7 (ung thư vú), PC-3 (ung thư tiền liệt tuyến), AsPC-1 (ung thư tụy), NCI-H460 (ung thư phổi) Thử nghiệm được tiến hành tại khoa Dược, đại học Chungbuk (Cheongju, Hàn Quốc) theo phương pháp MTT Kết quả giá trị IC50 của các chất có hoạt tính (dãy 5, 7, 9 và chất 23) được trình bày trong bảng 3.16 Những chất dãy 3, 11, 13, 17, 20 và chất 26 đều không kháng dòng tế bào SW620

Bảng 3.16 Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư người in vitro

SW620 MCF-7 PC-3 AsPC-1 NCI-H460

Các dẫn chất benzothiazol

S N

R

N

NHOH m

3.2.3 Hoạt tính kháng tế bào ung thư in vivo

Từ kết quả trên, chất 9g có hoạt tính tốt đã được lựa chọn để thử độc

tính in vivo Thí nghiệm được tiến hành trên mô hình ghép dị chủng ở

chuột trụi lông, sử dụng dòng tế bào PC-3 (ung thư tiền liệt tuyến người),

tại khoa Dược, đại học Chungbuk (Cheongju, Hàn Quốc) Hoạt tính

kháng tế bào ung thư được tính toán dựa trên phần trăm ức chế sự phát

triển khối u của mẫu thử ở liều xác định so với mẫu trắng đối chiếu Kết

quả thí nghiệm được trình bày trong bảng 3.17

Bảng 3.17 Sự thay đổi khối lượng của khối u trên chuột ở nhóm thử,

nhóm trắng đối chiếu và SAHA

* Chú thích: (t-TEST): a: p<0,05, b: p<0,01, c: p<0,001 so với mẫu trắng

Để sơ bộ đánh giá độc tính trên động vật của mẫu thử, chuột được cân

để xác định sự thay đổi trọng lượng trong quá trình thí nghiệm (bảng

± 2,45 102,9

± 2,34 103,1

± 2,99 106,6

± 3,25 107,4±

1,79

113,8±

2,61

114,7± 1,43

± 3,38 100,6

± 3,41 102,1

± 3,80 102,7

± 4,40 103,9±

4,34

105,9±

3,98 c

109,4± 3,14 b

0,0

102,0

± 4,35 103,6

± 3,70 100,3

± 4,11 102,5

± 3,49 105,1

± 4,50 104,9±

5,35

105,9±

3,97 c

106,8± 5,45 b

0,0

99,6±

4,57 101,4

± 4,10 103,9

± 6,49 104,0

± 5,32 102,9

± 5,45 103,0±

4,51 a

106,7±

5,11 b

108,5± 5,42 a

SAHA 30 100,0±

0,0

102,5

± 2,88 105,8

± 4,31 105,4

± 6,40 105,9

± 5,69 108,9

± 8,25 106,7±

7,37

108,8±

9,15

110,4± 9,79

* Chú thích: (t-TEST): a: p<0,05, b: p<0,01, c: p<0,001 so với mẫu trắng.

* Nhận xét:

Kết quả sau 21 ngày, với liều 30 mg/kg, chất 9g ức chế sự phát triển

khối u tương đương SAHA (bảng 3.17) Mặc dù, cân nặng của chuột ở

nhóm thử giảm nhẹ, tuy nhiên không ghi nhận độc tính nghiêm trọng nào

của nhóm thử so với nhóm trắng và không con chuột nào chết trong quá

trình thí nghiệm

Chương 4 BÀN LUẬN

4.1 Tổng hợp hóa học

Phản ứng tổng hợp 51 chất trong luận án là phản ứng thế ái nhân acyl với tác nhân thế ái nhân là nhóm amin Trong luận án này, một số tác nhân acyl hóa được sử dụng là acid carboxylic, anhydrid acid và ester 4.1.1 Tác nhân acyl hóa là anhydrid acid

Đây là tác nhân acyl hóa mạnh, dùng để tổng hợp chất 2a-f, 4a-f, 15a-c, 15f, 15h, 18a-h tạo các acid carboxylic, là chất trung gian trong quá trình tổng hợp các dãy chất 3, 5, 11, 13, 17 và 20 (sơ đồ 4.1)

Ar NH 2 +

C C

O

O O

N

DMF Ar N

OH O

R

2a-f

Ar = R

15a,b,c,f,h OH O C

O C O

S N

Acid carboxylic là tác nhân acyl hóa trung bình Trong phản ứng tạo các chất 3a-f và 5a-f (sơ đồ 4.2), các acid carboxylic trung gian phản ứng với hydroxylamin không phải là tác nhân ái nhân mạnh nên phản ứng khó xảy ra

S

N N R

OH

S

N N R

NHOH

2a-f (m=2) 4a-f (m=3)

3a-f (m=2)

m m

Sơ đồ 4.2 Tổng hợp các acid hydroxamic 3a-f và 5a-f

Để hoạt hóa acid carboxylic, một số chất được lựa chọn để tạo tác nhân hoạt hóa ngay trong phản ứng bằng cách tạo anhydrid hoạt hóa

N,N’-dicyclohexylcarbodiimid (DCC) là chất hoạt hóa nhóm carboxyl rất

hiệu quả trong tổng hợp peptid và là hóa chất sẵn có, rẻ tiền Vì vậy, DCC là lựa chọn đầu tiên để tổng hợp thử acid hydroxamic 3a-f từ acid carboxylic Tuy nhiên, kết quả tổng hợp thử cho thấy phản ứng xảy ra

không hoàn toàn Vì vậy, tác nhân isobutyl cloroformat được lựa chọn để tiến hành tổng hợp thử các chất 3a-f Kết quả sau nhiều lần tổng hợp đều chỉ thu được vết sản phẩm Sau khi tham khảo tài liệu, tác nhân hoạt hóa

khác là N,N’-carbonyldiimidazol (CDI) được lựa chọn Kết quả tổng hợp

cho thấy phản ứng xảy ra hoàn toàn, không còn vết nguyên liệu ban đầu (sơ đồ 4.6) Ưu điểm của việc sử dụng CDI là sản phẩm thu được khá tinh khiết, quá trình tinh chế đơn giản do imidazol tạo thành và CDI dư tan trong nước nên dễ dàng loại ra khỏi sản phẩm

Sơ đồ 4.6 Tổng hợp 3a-f sử dụng tác nhân hoạt hóa CDI CDI được dùng làm tác nhân hoạt hóa cho các phản ứng tạo liên kết amid Các chất 3a-f, 5a-e được tổng hợp (hiệu suất 32,3 – 72,0%) Riêng chất 5f phải tổng hợp bằng phản ứng giữa acid carboxylic với hydroxylamin đã được bảo vệ nhóm OH Đây là phương pháp rất hay được sử dụng Tuy nhiên, giá thành các hydroxylamin có chứa nhóm bảo

vệ rất cao Lựa chọn NH2OTHP làm tác nhân ái nhân cho phản ứng tổng hợp acid hydroxamic 5f (sơ đồ 4.7) Sau khi sản phẩm trung gian được tạo thành, loại bỏ nhóm bảo vệ -OH bằng phản ứng thủy phân với acid para-toluensulfonic thu được acid hydroxamic 5f (hiệu suất 42%)

S N

O ONH2

CDI, Et 3 N, DMF O

3

S N

17 và 20 và chất 22 được tiến hành cũng dùng CDI

4.1.3 Tác nhân acyl hóa là ester

Phản ứng tổng hợp các acid hydroxamic từ ester và hydroxylamin chỉ xảy ra ở pH > 10 Phương pháp tổng hợp chủ yếu là dùng xúc tác base và ester trong alcol Qua tham khảo tài liệu và để phù hợp với khả năng hòa tan trong dung môi của các chất, phản ứng tổng hợp các chất dãy 7, 9,

11, 13, 17 và 20, chất 23, 26 từ ester và hydroxylamin được tiến hành với xúc tác NaOH, dung môi methanol (một số chất khó tan thì sử dụng hỗn hợp dung môi MeOH - DMF) ở 0oC trong thời gian từ 30 phút đến 1giờ 30 phút Phản ứng diễn ra nhanh với hiệu suất 34,4 – 93,3% 4.2 Khẳng định cấu trúc

51 chất trong luận án đều được nhận dạng cấu trúc bằng các phương pháp phổ hồng ngoại (IR), phổi khối lượng (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR) Sau đây là một số bàn luận về việc nhận dạng cấu trúc thông qua các dữ liệu phổ

4.2.1 Phổ hồng ngoại

Việc phân tích phổ hồng ngoại trong luận án chủ yếu tập trung vào vùng nhóm chức để xác định sản phẩm phản ứng đã tạo thành với các nhóm chức đặc trưng

- 51 chất đều là acid hydroxamic nên đều có vân hấp thụ của dao động hóa trị O-H acid mạnh và tù từ 3500 - 2400 cm-1

- Toàn bộ 51 chất trong cấu trúc có 2 hoặc 3 liên kết -NH-CO- nên trong phổ đồ một số chất xuất hiện 2 - 3 vân hấp thụ của dao động hóa trị N-H amid cũng như vân hấp thụ của dao động hóa trị C=O amid (5a, 5b, 5e, 5f, 7b-7e, 9b, 9e, 9g, 11a, 11b, 13b, 13c, 17f, 20b, 20g, 20h), còn một

số chỉ xuất hiện 1 vân hấp thụ của NH, 1 vân hấp thụ C=O (3a-3f, 5c, 9c, 9d, 9h) Dao động NH có số sóng từ 3361–3124 cm-1 Dao động C=O có

số sóng từ 1707–1625 cm-1

- Cầu nối alkyl cũng cho thấy sự có mặt với dao động hóa trị bất đối xứng CH2 từ 2993–2912 cm-1 và dao động đối xứng từ 2875–2789 cm-1 Bên cạnh đó, phổ đồ hồng ngoại còn thể hiện sự có mặt của các nhóm thế gắn trên vòng benzothiazol hay vòng phenyl

4.2.2 Phổ khối lượng

Quá trình phân tích phổ khối được thực hiện qua 2 bước: phân tích cụm pic ion phân tử và biện giải các phân mảnh xuất hiện trên phổ đồ

4.2.2.1 Phân tích cụm pic ion phân tử

Pic ion phân tử của các hợp chất hữu cơ nói chung không phải là vạch riêng lẻ mà là một cụm pic vì các nguyên tố chứa trong hợp chất đều tồn tại các đồng vị như 13C là đồng vị của 12C, 2H là đồng vị của 1H, 33S, 34S

là đồng vị của 32S, 15N là đồng vị của 14N, 37Cl là đồng vị của 35C, 18O là