Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của một số dẫn chất 5 aryliden 2 thiohydantoin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN ĐỨC LAI TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT 5-ARYLIDEN-2-THIOHYDANTOIN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHU

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN ĐỨC LAI

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT 5-ARYLIDEN-2-THIOHYDANTOIN

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN ĐỨC LAI

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT 5-ARYLIDEN-2-THIOHYDANTOIN

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS.Vũ

Trần Anh và PGS.TS Nguyễn Quang Đạt đã hết lòng hướng dẫn, chỉ bảo,

tạo mọi điều kiện thuận lợi và động viên tôi hoàn thành luận văn này Tôi xin

chân thành cảm ơn PGS.TS Đinh Thanh Hải và toàn thể các thầy cô giáo,

kỹ thuật viên của Bộ môn Hóa hữu cơ đã động viên giúp đỡ tôi trong thời gian nghiên cứu tại bộ môn

Tôi cũng xin cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của : Ths Đặng Vũ Lương

(Phòng NMR- Viện hóa học- Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam), TS

Phan Thị Nguyệt Hằng (Viện Dược liệu), TS Trần Thị Như Hằng (Viện

Hóa học các hợp chất thiên nhiên), TS Nguyễn Thị Sơn (Bộ môn Hóa vật

liệu, khoa Hóa, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà

Nội), PGS.TS Lê Mai Hương (Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên-Viện

Hàn lâm khoa học Việt Nam) và các thầy cô giáo trong trường, các phòng ban, thư viện - Trường Đại học Dược Hà Nội

Mặc dù đã có nhiều cố gắng nhưng do hạn chế về thời gian, kiến thức cũng như tài liệu tham khảo nên luận văn của tôi không thể tránh khỏi những sai sót, khiếm khuyết trong nội dung và hình thức, tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô để luận văn được hoàn thiện hơn

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu vừa qua

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Học Viên

Trần Đức Lai

MỤC LỤC

Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

1.1 Tác dụng sinh học của các dẫn chất 2-thiohydantoin 2

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp tổng hợp 2-thiohydantoin, các

5-aryliden-2-thiohydantoin

16

4.1.1 Về phản ứng tổng hợp 2-thiohydantoin 50

4.2 Về xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được 54

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

13

1

(thụ thể của yếu tố tăng trưởng biểu mô)

(Heteronuclear Multiple Bond Connectivity)

(Heteronuclear Single-Quantum coherence)

thử nghiệm của các chất tổng hợp được (theo phương pháp SRB)

45

3.8 Kết quả xác định giá trị IC50 (µg/ml) của một số chất tổng hợp

được trên 3 dòng tế bào ung thư thử nghiệm của các chất tổng

hợp được (theo phương pháp SRB)

46

µg/ml trên một số dòng tế bào ung thư người (theo phương pháp

MTT)

47

3.10 Kết quả xác định giá trị IC50 (µg/ml) của một số chất tổng hợp

được trên một số dòng tế bào (theo phương pháp MTT)

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Phụ lục 16 : Phiếu trả lời kết quả thử hoạt tính gây độc

tế bào (cytotoxicity assay)

Phụ lục 17 : Phiếu trả lời kết quả thử hoạt tính kháng vi

sinh vật kiểm định (antimicrobial assay)

ĐẶT VẤN ĐỀ

Thuốc sử dụng trong công tác phòng và chữa bệnh có nhiều nguồn gốc khác nhau Bên cạnh thuốc có nguồn gốc thiên nhiên và vi sinh, thuốc được tạo ra bằng con đường tổng hợp và bán tổng hợp đóng vai trò quan trọng Tổng hợp hóa dược là một chuyên ngành hóa học quan trọng, đã và đang được quan tâm nghiên cứu và phát triển nhằm tạo ra các thuốc có hiệu quả trong công tác phòng và chữa bệnh

Trong lĩnh vực tổng hợp thuốc, để nhanh chóng tạo ra các thuốc mới, các nhà nghiên cứu thường dựa trên cấu trúc của các chất đang được dùng làm thuốc hoặc các chất có hoạt tính sinh học có triển vọng để tạo ra các chất mới

dự đoán có tác dụng tốt hơn, ít độc tính hơn và có hiệu quả hơn trong điều trị Các dẫn chất 2-thiohydantoin là dãy chất đã được quan tâm nghiên cứu

về tổng hợp hoá học, tác dụng sinh học và ứng dụng làm thuốc Trong đó nhiều dẫn chất của 2-thiohydantoin có tác dụng chống ung thư, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus và ức chế aldose reductase,… đáng quan tâm [6], [7], [16], [20], [21], [23], [35], [39]

Các thành tựu nghiên cứu tổng hợp và hoạt tính sinh học của các dẫn chất 2-thiohydantoin nêu trên cho thấy việc nghiên cứu tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của các dẫn chất 2-thiohydantoin là rất cần thiết và có nhiều triển vọng Để góp phần nghiên cứu về hoá học và hoạt tính sinh học của các dẫn chất 2-thiohydantoin, chúng tôi thực hiện đề tài này với các mục tiêu sau:

thư và tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của các chất tổng hợp được

CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN 1.1 Tác dụng sinh học của các dẫn chất 2-thiohydantoin

2-thiohydantoin là hợp chất dị vòng được tạo thành nhờ phản ứng ngưng

tụ giữa một amino acid với một dẫn chất của thiocyanat Bản thân thiohydantoin không thể hiện tác dụng sinh học, tuy nhiên các dẫn chất của 2-thiohydantoin có tác dụng sinh học đã được biết đến trong thời gian dài Nhiều công trình nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng sinh học cho thấy các dẫn chất của 2-thiohydantoin có tác dụng đa dạng như: kháng tế bào ung thư [8], [9], [39], [40], kháng đột biến gen [31], kháng virus [14], [17], kháng virus HIV [20], kháng khuẩn [21], [23], ức chế enzyme aldose reductase [35]

2-… Ngoài ra 2-thiohydantoin còn được sử dụng nhiều trong các lĩnh vực khác như sản xuất thuốc trừ sâu [36], thuốc nhuộm [36]…

1.1.1 Tác dụng ức chế tế bào ung thư

Merbaron là một dẫn chất của 2-thiobarbituric, có tác dụng gây độc tế bào với tế bào ung thư máu và một số tế bào ung thư khác

HN N H

H N O

O

Merbaron

Dựa trên sự tương tự về cấu trúc của 2-thiohydantoin, Blanc và Cussac

[39] đã tiến hành tổng hợp một số dẫn chất của 2-thiohydantoin (1a-d), thử

tác dụng gây tăng miễn dịch và gây độc tế bào Kết quả thử nghiệm cho thấy

các dẫn chất tổng hợp được 1(a-d) có tác dụng gây tăng miễn dịch yếu, và có

tác dụng trên các tế bào ung thư thử nghiệm

N

N

S O

Năm 2010, một số dẫn chất của 2-thiohydantoin (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8) đã

được tác giả Al-Obaid và các cộng sự [8] nghiên cứu thử nghiệm invitro về tác dụng chống ung thư trên 60 dòng tế bào người ở 5 nồng độ khác nhau Kết

quả thu được đáng chú ý là chất 2, 7 có tác dụng kháng tế bào ung thư trên dòng tế bào ung thư bạch cầu, các chất 3, 4, 5, 6, 8 có tác dụng ngăn cản sự

phân bào và kìm hãm sự phát triển tế bào thử nghiệm

CH

N H NH O

CH

N H NH O

S

3

Acid 4-ylidenemethyl)-thiophen-2-ylsulfanyl]-benzoic

O

CH

N H NH O

S

4

cyclopenta[b]naphthalen-2-ylmethylen)-2-thioxo-imidazolidin-4-on

5-(4-oxo-4H-1,9-dithia-CH

N H N O

S

S

Br

O N

5

morpholin-4-ylmethyl-2-thioxo-

5-(5-bromo-thiophen-2-ylmethylen)-3-imidazolidin-4-on

O OAc OAc

AcO

CH

N NH O

3-acetoxy-6-acetoxymethyl-2-[4-(5-O OAc OAc

AcO H AcO

CH

N N O

S Ph

7

2-{5-[5-oxo-1-phenyl-2-(3,4,5-pyran-2-ylsulfanyl)-1,5-dihydro-

triacetoxy-6-acetoxymethyl-tetrahydro-ylsulfanyl}-benzoic

imidazol-4-ylidenemethyl]-thiophen-2-CH

N N O

S

S

Br

O N

O OAc OAc

AcO H AcO

8

2-ylmethylene)-1-morpholin-4-ylmethyl-5-oxo-4,5-dihydro-1H-imidazol-2-

3,4,5-triacetoxy-6-[4-(5-bromo-thiophen-ylsulfanyl]-tetrahydro-pyran-2-ylmethyl acetat

Nguyên nhân chính của ung thư kháng thuốc là do nồng độ quá cao của bơm tống thuốc phụ thuộc ATP khiến cho giảm nồng độ thuốc, trong đó có nồng độ quá cao của chất vận chuyển đa thuốc ABC (ví dụ P-glycoprotein) Nhiều nhóm chức hóa học có khả năng ức chế loại bơm tống thuốc (loại có chứa P-gp), bao gồm 3 thế hệ điều biến P-gp Các nghiên cứu cho thấy chất 5-(3-methoxy-benzyliden)-3-{3-[4-(2-methoxy-phenyl)-piperazin-1-yl]-

5-(biphenyl-4-yl)methylen-2-thioxo-imidazolidin-4-on (10) có tác dụng ức chế bơm tống thuốc có yếu tố P-gp

[33]

N

H N

N N

O O

H N O

S

10

Tác giả Spengler và Hadzlik [16] đã tiến hành tổng hợp một số dẫn chất của 5-aryliden-2-(thio)hydantoin và thử tác dụng ức chế bơm tống thuốc của các dẫn chất này Chất 5-(biphenyl-4-yl)methylen-2-thioxo-imidazolidin-4-on

(10) có tác dụng ức chế chất điều biến P-Glycoprotein trong tế bào ung thư

H N S O

Ar

ArCHO

N

H N SCH3O

Ar

CH3I

N HN

HO

N

H N O

bơm tống thuốc ở tế bào ung thư thử nghiệm, tác dụng yếu hơn chất 4 Hợp

Escherichia coli (RCMB 000106) (Gram âm) Các chất tổng hợp được thử tác

dụng kháng nấm trên các chủng Aspergillus fumigates (RCMB 002006),

Geotrichum candidum (RCMB 005008), Candida albicans (RCMB 005003), Syncephalastrum racemosum (RCMB 005004) Kết quả cho thấy các chất

tổng hợp được đều có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm Chất

5-oxo-2-thioxo-1-(2-p-tolyl-ethylideneamino)-imidazolidin-4-yl acetat (12) có tác

dụng tốt nhất trên chủng vi khuẩn và nấm thử nghiệm Chất

1-acetyl-3-[(p-tolylethyliden)amino]-2-thiohydantoin (13) và chất tolylethyliden)amino]-2-thiohydantoin (14) có tác dụng trung bình Chất 1-

có tác dụng tốt trên chủng vi khuẩn và tác dụng trung bình trên chủng nấm thử nghiệm

N H

N S O

N

CH3

N H

N S O

Năm 2010, tác giả Abd E.l và cộng sự [6] đã tổng hợp một số dẫn chất

của thiohydantoin và thử hoạt tính trên 4 dòng vi khuẩn là: Bacillus subtilis,

Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas species và 1 dòng vi

nấm là Candida albicans Kết quả thu được cho thấy các hợp chất 16, 17, 18 tác dụng tốt trên dòng vi khuẩn Pseudomonas sp; các hợp chất 16, 17, 18 tác dụng yếu trên dòng Escherichia coli; 18, 19 tác dụng rất tốt trên vi khuẩn

Staphylococcus aureus; 16, 17, 19, 20 tác dụng rất tốt trên dòng vi nấm

Candida albicans

N N N

2-[(3-acetyl-5-oxo-2-thioxo-NH N

N Br

5-acetyl-3-[(5-bromo-2-hydroxy-N N N

oxo-2-thioxo-imidazolidin-1-

4-bromo-2-[(3,4-diacetyl-4-bromo-5-ylimino)-methyl]-phenyl acetat

NH N

N H Br

OH H2NHN

H2NHN

19

imidazolidin-1-ylamino)-methyl]-phenol

4-bromo-2-[(2,5-dihydrazino-NH N

N Br

3-[(5-bromo-2-hydroxy-benzyliden)-1.1.3 Các tác dụng khác

Trong US patent 6.826.924 tác giả Pfahl [28] đã tổng hợp các dẫn chất của 2-thioxo-4-imidazolidindion có tác dụng trong điều trị các bệnh liên quan đến chuyển hóa lipid và carbonhydrat như đái tháo đường typ 2, biệt hóa tế bào mô mỡ, bệnh Hodgkin, bệnh bạch cầu, ung thư vú, ung thư tiền liệt tuyến…

Các dẫn chất thế ở vị trí 5 của 2’-deoxyuridin bởi các dị vòng 5 cạnh đã được nghiên cứu để thử tác dụng kháng virus [14], trong đó có dẫn chất 5-(5-

bromothien-2-yl)-2’-deoxyuridin và 5-(5-clorothien-2-yl)-2’-deoxyuridin (21)

có tác dụng ức chế sự nhân lên của virus Herpes typ 1 Tác giả El-Barbary [14] đã sử dụng 5-methylen-2-thiohydantoin là dị vòng 5 cạnh để tiến hành phản ứng với 2’-deoxyuridin nhằm tạo ra các chất mới để nghiên cứu tác dụng kháng virus theo sơ đồ sau:

OTol

HN N

N HN O

O

O

O TolO

OTol

HN N

O

O

CHO 1.(Me3Si)2NH/(NH4)2SO4

trong bình phản ứng, đun hồi lưu dưới 4 điều kiện khác nhau:

+ sử dụng bình áo

+ đun cách dầu

+ trong lò phản ứng không gỉ kín, được trang bị khuấy từ và đun nóng bằng dầu

+ thiết bị đun cách acid ở nhiệt độ không đổi

Phản ứng này cho hiệu suất khác nhau ứng với các amino acid khác nhau

và điều kiện phản ứng khác nhau Hiệu suất cao nhất khi sử dụng điều kiện đun cách dầu, dao động từ 70% đến gần như 100%

1.2.1.2 Phản ứng của các α-amino acid với ammonium thiocyanat

Năm 1913, Treat Johson và Water Scott [19] tìm ra phản ứng giữa amino acid với amonium thiocyanat trong môi trường anhydrid acetic khan Sản phẩm trung gian thu được là acetylthiohydantoin, sản phẩm trung gian này bị thủy phân trong môi trường acid ở nhiệt độ cao sẽ sinh ra 2-thiohydantoin

N H

H N S O

CH3O

Trong bài báo này, tác giả đã thực hiện phản ứng tổng hợp thiohydantoin

và dẫn chất từ 7 acid khác nhau là: acid aceticphtalamic, acid

acetyldibromphenylalanin, benzoylalanin, acid phenylsulfonaminoacetic Năm 2006, Samuel Reyes và cộng sự [29] đã tiến hành tổng theo phương pháp trên và thu được 2-thiohydantoin Năm 2011, Sandrine Gosling và cộng

sự [15] cũng đã xây dựng qui trình tổng hợp 2-thiohydantoin theo sơ đồ như trên và chúng tôi thực hiện theo qui trình này

1.2.1.3 Phản ứng của glycin ethyl ester thiocyanat với acid amin

Glycin ethyl ester thiocyanat kết hợp với acid amin, đun hồi lưu trong cloroform trong 4 giờ được dẫn chất thế ở vị trí 3 của uredoacetic ethyl ester, sau đó đun hồi lưu trong ethanol/acid hydrochloric (nồng độ 10N, tỷ lệ 1:1) thu được 2-thiohydantoin có nhóm thế ở vị trí 3 như mong muốn [27]

H N

O

H N R S

b: Đun hồi lưu 3 giờ trong EtOH/HCl 10N tỷ lệ 1:1

1.2.2 Phản ứng tổng hợp dẫn chất 5-aryliden-2-thiohydantoin

Công thức cấu tạo 2-thiohydantoin (2-thioxoimidazolidin-4-on) như sau:

S O

Từ cấu trúc phân tử 2-thiohydantoin cho thấy nhiều khả năng phản ứng chuyển hóa để tạo thành nhiều dẫn chất khác nhau của 2-thiohydantoin [12], [23], [36]… Các phản ứng thực hiện theo hướng chính sau:

O C

H R OH

HN NHS

O C

H R

- H2O

Phản ứng ngưng tụ có thể thực hiện ở các điều kiện khác nhau: dưới điều kiện phản ứng với aldehyd thơm, xúc tác natri acetat, acid acetic băng [21], [35], [40]; ngưng tụ với các aldehyd thơm, xúc tác ethanolamin/EtOH [23], [26], xúc tác piperidin/EtOH [12], [14], dưới điều kiện vi sóng [27]…

Về cơ chế phản ứng Knoevenagel [2], [24]

Phản ứng ngưng tụ các aldehyd thơm và một số hợp chất dị vòng chứa nhóm aldehyd với 2-thiohydantoin xảy ra theo cơ chế phản ứng Knoevenagel tương tự như với các hợp chất có nhóm methylen hoạt động khác

Với xúc tác ethanolamin là amin bậc 1, có thể trình bày cơ chế phản ứng ngưng tụ aldehyd thơm với 2-thiohydantoin theo cơ chế Knoevenagel theo các bước sau:

- Aldehyd thơm ngưng tụ với ethanolamin tạo arylidenimin:

H C

HN NO

S

R

HN NHO

S

HN NHO

S

O H

C Ar N

H

NH S

O H

C Ar NH

5-aryliden-2-HN NHS

O H

C Ar NH

H

Ar

- 2 HO(CH2)2NH2

Với xúc tác natri acetat trong dung môi acid acetic

Phản ứng ngưng tụ của aldehyd thơm với 2-thiohydantoin là phản ứng ngưng tụ kiểu aldol xảy ra theo cơ chế sau [24]:

- Giai đoạn cộng hợp:

Nhóm methylen ở vị trí 5 của 2-thiohydantoin rất hoạt động, nguyên tử

H ở đây dễ dàng tách khỏi carbon (khi có xúc tác base) và anion (II) được tạo thành là một tác nhân ái nhân mạnh:

N H

NH S

O

N H

NH S

O

(II)

nhóm carbonyl của aldehyd tạo sản phẩm cộng hợp (IV):

HC N H

NH S

N

NH S

O H HC Ar

O (IV)

H

NH S

O H HC Ar OH (V)

NH

CH Ar

NH C

H Ar O

S

Năm 1911, Wheeler và Hoffman [34] là những người đầu tiên nhận thấy hydantoin có thể ngưng tụ với aldehyd thơm tạo thành dẫn chất có nối đôi gắn

ở C-5 của hydantoin Phản ứng được thực hiện trong acid acetic băng, với natri acetat khan, anhydrid acetic Các aldehyd thơm đã được sử dụng là benzaldehyd, 2-hydroxybenzaldehyd, furfural, vanillin,…

N H

NH O

O Ar-CHO

1 23 4 5

N H

NH O

O

1 3 4 5

Ar

+

- H2O AcOH, AcONa

Phương pháp của Wheeler và Hoffman được sử dụng để tổng hợp nhiều dẫn chất thế ở C-5 của hydantoin Một nhược điểm của phương pháp trên là phải sử dụng một lượng lớn acid acetic và natri acetat

Năm 1992, Chazeau V., và cộng sự [40] đã xây dựng qui trình tổng hợp một số dẫn chất 5-aryliden-2-thiohydantoin dựa trên nghiên cứu của Wheeler

và Hoffman

Năm 1993, János Marton [23] sử dụng xúc tác có tính base mạnh là ethanolamin để tiến hành phản ứng ngưng tụ aldehyd thơm với thiohydantoin trong dung môi là ethanol, phản ứng tiến hành ở nhiệt độ hồi lưu trong 30 phút Tác giả đã sử dụng một số aldehyd thơm (p-clorobenzaldehyd, p-nitrobenzaldehyd, p-hydroxybenzaldehyd, ), hiệu suất phản ứng 44-89%

R = H, -OH, -OCH3, -N(CH3)2, -Cl, -NO2

CHƯƠNG 2.NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất, dung môi

Các hóa chất, dung môi dùng trong quá trình thực nghiệm là loại dùng trong tổng hợp được nhập từ công ty Merck, Sigma-Aldrich, Trung Quốc Các hóa chất này được sử dụng trực tiếp không qua tinh chế thêm Bao gồm:

- 4-hydroxybenzaldehyd -4-methoxybenzaldehyd

ethanolamin, cloroform, dicloromethan, ethylacetat, methanol, natri acetat, ethanol tuyệt đối, HCl, nước cất

2.2 Thiết bị thí nghiệm

- Dụng cụ thủy tinh (bình cầu 3 cổ dung tích 100, 250, 500ml, sinh hàn, phễu nhỏ giọt, ống đong, cốc thủy tinh các loại, bình lọc hút, phễu

Buchner…)

- Cân kỹ thuật điện tử Shimadzu (Nhật)

- Bơm hút chân không DIVAC.1.21 (Mỹ)

- Bơm hút chân không VRL mode 200- 7.0 (Mỹ)

- Máy cất quay Büchi R- 210 (Thụy Sĩ)

- Tủ sấy Memmert (Đức)

- Tủ sấy chân không Shellab (Đức)

- Mấy khuấy từ IKA – RCT (Đức)

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt (Mỹ)

- Phổ hồng ngoại (IR) ghi trên máy Perkin Elmer, tại Phòng Hóa vật liệu, khoa Hóa học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia

Hà Nội

trên máy AVANCE, Bruker AV500 tại Viện Hóa học, Viện Khoa học

và Công nghệ Việt Nam

- Phổ khối lượng (LC/MS) ghi trên máy LS-MSD-Trap-SL và

LC/MS/MS-Xevo TQMS tại Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp tổng hợp 2-thiohydantoin, các

5-aryliden-2-thiohydantoin

các chất dự kiến

2.3.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học

2.3.3.1 Thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư

Thử tác dụng gây độc tế bào ung thư của các chất tổng hợp được theo 2 phương pháp:

- Phương pháp MTT [25], [37]

- Phương pháp SRB [18], [30]

Nguyên tắc:

Đây là phương pháp thử nghiệm in vitro để đo sự tăng sinh và sống sót

của tế bào Tế bào ung thư được nuôi cấy trong đĩa 96 giếng

- Phương pháp MTT: Hợp chất MTT 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5 diphenyltetrazolium bromid, có màu vàng được thêm vào mỗi giếng và tế bào

ty thể của những tế bào sống Khả năng hấp thụ của dung dịch có màu này có thể được định lượng bằng máy quang phổ kế ở bước sóng 540 – 600 nm Sự biến đổi màu chỉ xảy ra khi enzym reductase trong ty thể là hoạt động, và do

đó sự chuyển đổi có thể liên quan trực tiếp đến số lượng tế bào sống sót Chúng tôi sử dụng phương pháp này để nghiên cứu độc tính của các chất tổng hợp được đối với 2 dòng tế bào ung thư người: tế bào ung thư phổi A549 và tế

bào ung thư đại tràng HCT116

- Phương pháp SRB: Hợp chất Sulphorhodamin B (SRB) biến đổi thành aminoxanthin có màu hồng, được các acid amin cần thiết trong tế bào sống hấp thu Càng nhiều tế bào sống, sự hấp thu càng nhiều Các tế bào sống, sau

đó được cố định Định lượng các chất màu được tế bào hấp thu bằng máy quang phổ kế ở bước sóng 495-515 nm Từ đó tính được số lượng tế bào sống sót Chúng tôi sử dụng phương pháp này để nghiên cứu độc tính của chất tổng hợp được đối với 3 dòng tế bào ung thư người: tế vào ung thư tuyến tiền liệt

PC 3, tế bào ung thư gan Hep-G2, tế bào ung thư biểu mô vú MCF7 Phương pháp này hiện đang được áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thư quốc gia Mỹ

(National Cancer Institution - NCI)

Dòng tế bào thử nghiệm:

5 dòng tế bào:

- Dòng tế bào MCF-7 (tế bào ung thư vú)

- Dòng tế bào Hep-G2 (tế bào ung thư gan)

- Dòng tế bào A549 (tế bào ung thư phổi)

- Dòng tế bào HCT116 (tế bào ung thư đại tràng)

- Dòng tế bào PC3 (tế bào ung thư tuyến tiền liệt)

Chất chuẩn dương tính

Sử dụng chất chuẩn có khả năng diệt tế bào:

- Phương pháp MTT: Adriamycin của hãng Sigma

- Phương pháp SRB: Ellipticin của hãng Sigma

Tiến hành thử hoạt tính

a/ Chuẩn bị tế bào

- Tế bào ung thư được duy trì ở điều kiện tiêu chuẩn Sau khi tế bào được hoạt hóa phát triển đến phase log sẽ được sử dụng cho thử test với các chất thử đã chuẩn bị sẵn ở 4 - 10 thang nồng độ khác nhau, lặp lại ba lần trên phiến vi lượng 96 giếng đối với phương pháp SRB và lặp lại hai lần đối với phương pháp MTT

- Mẫu thử nghiệm bao gồm: tế bào + môi trường nuôi cấy + mẫu thử

- Loại bỏ môi trường trong các giếng của đĩa nuôi cấy

- Hoàn trả formazan (sản phẩm chuyển hóa MTT) bằng 100 µl DMSO Lắc kỹ để formazan có thể tan hoàn toàn

- Đọc mật độ quang ở bước sóng 540 nm Mật độ quang sẽ phản ánh số lượng tế bào sống sót

c/ Quy trình thử nghiệm độc tính tế bào theo phương pháp SRB [18],[30]

trong 1 giờ, sau đó rửa sạch bằng nước và để khô tự nhiên

- Thêm 50 µl dung dịch sulphorhodanin B (SRB) vào mỗi giếng của đĩa nuôi cấy, nhuộm ở nhiệt độ phòng trong 30 phút

- Rửa sạch dung dịch sulphorhodanin B (SRB) dư bằng dung dịch acid acetic 1% 5 lần

- Hoàn trả sulphorhodanin B đã được nhuộm vào tế bào Lắc kỹ để hòa tan hoàn toàn

- Đọc mật độ quang ở bước sóng 492-515 nm Mật độ quang sẽ phản ánh

Giá trị CS% sau khi tính theo công thức trên được đưa vào tính toán Excel

theo công thức của Ducan như sau

OD (mẫu) – OD (ngày 0)

OD (DMSO) – OD (ngày 0)

Table curve theo thang giá trị logarit của đường cong phát triển tế bào và

Bước 1: Sàng lọc sơ bộ tìm chất có hoạt tính

Bước 2: Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chất có hoạt tính

* Chứng dương tính:

+ Streptomycin cho vi khuẩn Gr(-) + Penicillin cho vi khuẩn Gr(+) + Nystatin cho nấm sợi và nấm men

Kháng sinh pha trong DMSO10% với nồng độ thích hợp: Streptomycin: 4mM; Penicillin: 50mM; Nystatin: 4mM

* Chứng âm tính:

Vi sinh vật kiểm định không trộn kháng sinh và chất thử

* Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm:

- Vi khuẩn Gr(-): Escherichia coli (ATCC 25922)

Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923)

- Vi khuẩn Gr(+): Bacillus subtillis (ATCC 27212)

Staphylococcus aureus (ATCC 12222)

- Nấm sợi: Aspergillus niger (439)

Môi trường thí nghiệm: Mycophil cho vi nấm, Eugon Broth cho vi khuẩn

+ Chuẩn bị mẫu thử: Chất thử được hoà tan trong DMSO nguyên chất + Từ dung dịch gốc pha loãng thành 4 - 10 thang nồng độ rồi nhỏ sang phiến vi lượng 96 giếng

+ Nhỏ vào mỗi giếng đã có sẵn dung dịch VSV đã hoạt hoá và được pha loãng bằng môi trường dinh dưỡng cho tới nồng độ tương đương 0,5 đơn

+ Đối chứng dương:

Dãy 1: Môi trường

Dãy 2: Kháng sinh (Penicillin) + vi khuẩn Gr(+);

Kháng sinh (Streptomycin) + vi khuẩn Gr(-);

Kháng sinh (Nystatin) + vi nấm

+ Đối chứng âm: Chỉ có vi nấm, vi khuẩn kiểm định

+ Kết quả dương tính là nồng độ mà ở đó không có vi sinh vật phát triển Khi nuôi cấy lại nồng độ này trên môi trường thạch đĩa để kiểm tra, có giá trị CFU<5

- Bước 2: Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chất có hoạt tính

Các mẫu đã có hoạt tính được sàng lọc ban đầu được pha loãng theo các thang nồng độ thấp dần, từ (5 - 10) thang nồng độ để tính giá trị nồng độ tối thiểu mà ở đó VSV bị ức chế phát triển gần như hoàn toàn

Mẫu chất tinh khiết có MIC ≤ 50 µg/ml là có hoạt tính

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

O

- Tổng hợp dẫn chất một số dẫn chất 5-aryliden-2-thiohydantion (I-XIII) bằng phản ứng ngưng tụ 2-thiohydantoin (BT) với một số aldehyd thơm theo

S

I-XIII

CHO

N H NH O

S +

BT

R=H; 4'-F; 2'-Cl; 3'-Cl 4'-Cl;

2'-Br; 3'-Br; 4'-Br; 3'-NO2;

4'-NO2; 2'-OH; 4'-OH; 4'-OCH3

(R=H (I); 4'-F (II); 2'-Cl (III); 3'-Cl (IV); 4'-Cl (V) 2'-Br (VI); 3'-Br (VII); 4'-Br (VIII); 3'-NO2 (IX);

4'-NO2(X); 2'-OH(XI); 4'-OH (XII); 4'-OCH3 (XIII)

1 2 3 4

Trong đó: Phương pháp A : chất I , II , III , VI , VIII, X , XI

Phương pháp B: chất IV ,V , VII , IX, XII, XIII

3.1.1 Tổng hợp 2-thiohydantoin (BT)

1 5 3 4 2

Tiến hành:

Cho vào bình cầu 46,00g (0,613mol) glycin, 46,60g (0,613mol) amoni thiocyanat, thêm 174 ml anhydrid acetic, đun cách dầu và khuấy đều hỗn hợp phản ứng Theo dõi phản ứng bằng SKLM với dung môi khai triển là

thúc phản ứng, hỗn hợp được rót vào 500 g nước đá, để lạnh trong 4 giờ Chất rắn màu vàng xuất hiện được lọc, rửa bằng nước lạnh 3 lần, mỗi lần 150ml Sấy khô tủa thu được

Khối lượng sản phẩm: 59,27g Hiệu suất: 61,1%

Nhiệt độ nóng chảy: 172-173OC (tài liệu [23]: toC =176oC; tài liệu [29]:

C174

173

(phù hợp với tài liệu tham khảo [15])

N H

H N S

O

1 2

3 4 5

Tiến hành:

59,27g (0,375mol) chất A được phân tán trong 294ml HCl 10% Đun hồi

lưu trong vòng 1 giờ Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi khai

phản ứng và lọc nóng Dịch lọc được để lạnh qua đêm, thu được kết tủa, lọc tủa, rửa nước đến hết acid (thử bằng giấy quỳ) Sấy khô tủa thu được Kết tinh lại trong nước

Khối lượng sản phẩm: 19,12g chất rắn màu cam Hiệu suất: 44,0 %

Nhiệt độ nóng chảy: 229-2300C (tài liệu [23], toC =230-232oC; Catalogue

Dựa trên những tài liệu tham khảo, chúng tôi tổng hợp một số dẫn chất

5-aryliden-2-thiohydantion (I-XIII) theo 2 phương pháp:

- Phương pháp A: dùng xúc tác ethanolamin trong dung môi ethanol

theo qui trình của tác giả János Marton và cộng sự [23]

Quy trình tổng hợp chung : Cho vào bình cầu phản ứng 1,16g

(0,010mol) chất BT (2-thiohydantoin), 10ml EtOH, khuấy đều thu được hỗn hợp (a) Hòa tan 0,010 mol aldehyd thơm bằng 10ml EtOH trong cốc có mỏ, sau đó thêm 0,9ml ethanolamin thu được hỗn hợp (b) Thêm từ từ từng giọt (b) vào hỗn hợp (a) trong bình phản ứng, sau đó thêm 20ml EtOH, khuấy đều

ở nhiệt độ phòng 15 phút Đun hồi lưu hỗn hợp phản ứng trong 30 phút Theo

(14:1) Để nguội, đổ hỗn hợp phản ứng ra cốc có mỏ, để kết tinh trong tủ lạnh qua đêm Chất rắn được lọc hút kiệt, rửa tủa bằng EtOH lạnh, rửa tiếp bằng nước nóng, sau đó rửa lại bằng EtOH lạnh Sấy khô sản phẩm thô thu được Kết tinh lại sản phẩm thô bằng dung môi thích hợp

Chúng tôi sử dụng phương pháp A để tổng hợp các thiohydantoin đi từ các aldehyd là benzaldehyd, 4-fluorobenzaldehyd, 2-

4-nitrobenzaldehyd, 2-hydroxybenzaldehyd

- Phương pháp B: dùng xúc tác natri acetat trong dung môi acid acetic

theo qui trình của tác giả Chazeau V., và cộng sự [40]

Quy trình tổng hợp chung : Cho vào bình cầu phản ứng 1,16g

(0,01mol) chất BT, 0,01mol aldehyd thơm, 3,77g (0,046mol) natri acetat

khan và 22ml acid acetic băng Khuấy đều cho hỗn hợp tan hoàn toàn, đun hồi lưu hỗn hợp phản ứng trong 2 giờ Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ

hỗn hợp ra cốc có mỏ, ngâm lạnh 15 phút sau đó để hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Lọc hút kiệt, rửa tủa nhiều lần bằng nước cất cho đến khi hết acid acetic (thử bằng giấy quỳ) Rửa tiếp vài lần bằng cồn lạnh Sấy khô sản phẩm thô thu được Kết tinh lại sản phẩm thô bằng dung môi thích hợp

Chúng tôi sử dụng phương pháp B để tổng hợp các thiohydantoin đi từ các aldehyd là 3-clorobenzaldehyd, 4-clorobenzaldehyd,

4-methoxybenzaldehyd

Sau đây là các kết quả cụ thế:

3.1.2.1 Tổng hợp 5-benzyliden-2-thiohydantoin (I)

Công thức:

CH

N H NH O

S

2 4 1 3 5 1'

2' 3' 4'

5' 6'

Tiến hành: (Phương pháp A) Từ 1,16g (0,010 mol) 2-thiohydantoin,

1,06g (0,01 mol) benzaldehyd, hồi lưu trong 30 phút Kết tinh lại trong dung môi EtOH:DMF ( 17:1)

Khối lượng sản phẩm: 0,66 g tinh thể hình kim màu vàng Hiệu suất: 32,3%

S

2 4 1 3 5 1'

2' 3' 4'

5' 6'

Tiến hành: (Phương pháp A) Từ 1,16g (0,010 mol) 2-thiohydantoin,

1,24g (0,01 mol) 4-fluorobenzaldehyd, hồi lưu trong 30 phút Kết tinh lại trong dung môi EtOH:DMF ( 10:1)

Khối lượng sản phẩm: 1,82g chất kết tinh màu vàng nhạt, hiệu suất 78,4 %

Rf = 0,84 (TLC, silicagel 60 F254, hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH (14:1))

S

2 4 1 3 5 1'

2' 3'

4'

5' 6'

Cl

Tiến hành: (Phương pháp A) Từ 1,16g (0,010 mol) 2-thiohydantoin,

1,41g (0,01 mol) 2-clorobenzaldehyd, hồi lưu trong 30 phút Kết tinh lại trong dung môi EtOH:DMF ( 10:1)

Khối lượng sản phẩm: 1,51g chất kết tinh màu vàng, hiệu suất 63,3 %

N H NH O

S

2 4 1 3 5 1'

2' 3' 4'

5' 6'

Cl

Tiến hành: (Phương pháp B) 1,16g (0,01mol) 2-thiohydantoin, 1,41g

(0,01mol) 3-clorobenzaldehyd, 3,77g (0,046mol) natri acetat khan và 22ml acid acetic băng, hồi lưu trong 2 giờ Kết tinh lại trong dung môi EtOH/DMF (4:1)

Khối lượng sản phẩm: 1,42 g chất rắn màu vàng Hiệu suất: 59,0 %

S

2 4 1 3 5 1'

2' 3' 4'

5' 6'

Tiến hành: (Phương pháp B) 1,16g (0,01mol) 2-thiohydantoin, 1,41g

(0,01mol) 4-clorobenzaldehyd, 3,77g (0,046mol) natri acetat khan và 22ml acid acetic băng, hồi lưu trong 2 giờ Kết tinh lại trong dung môi EtOH/DMF (4:1)

Khối lượng sản phẩm: 1,72g chất rắn màu vàng Hiệu suất: 79,7 %

Nhiệt độ nóng chảy: 281-282oC (tài liệu [23]: toC =281-282oC)

S

2 4 1 3 5 1'

2' 3' 4'

5' 6'

Br

Tiến hành: (Phương pháp A) Từ 1,16g (0,010 mol) 2-thiohydantoin,

1,85 g (0,01 mol) 2-bromobenzaldehyd, hồi lưu trong 30 phút Kết tinh lại trong dung môi EtOH:DMF ( 5:1)

Khối lượng sản phẩm: 1,59g chất kết tinh màu vàng nhạt, hiệu suất 56,1 %