Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của một số dẫn chất 5 aryliden 2 thiohydantoin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN ĐỨC LAI TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT 5-ARYLIDEN-2-THIOHYDANTOIN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN ĐỨC LAI TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT 5-ARYLIDEN-2-THIOHYDANTOIN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ MÃ SỐ: 60720402 Người hướng dẫn khoa học: TS Vũ Trần Anh PGS TS Nguyễn Quang Đạt HÀ NỘI 2014 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS.Vũ Trần Anh PGS.TS Nguyễn Quang Đạt hết lòng hướng dẫn, bảo, tạo điều kiện thuận lợi động viên tơi hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Đinh Thanh Hải toàn thể thầy cô giáo, kỹ thuật viên Bộ môn Hóa hữu động viên giúp đỡ tơi thời gian nghiên cứu môn Tôi xin cảm ơn giúp đỡ nhiệt tình : Ths Đặng Vũ Lương (Phòng NMR- Viện hóa học- Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam), TS Phan Thị Nguyệt Hằng (Viện Dược liệu), TS Trần Thị Như Hằng (Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên), TS Nguyễn Thị Sơn (Bộ mơn Hóa vật liệu, khoa Hóa, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội), PGS.TS Lê Mai Hương (Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên-Viện Hàn lâm khoa học Việt Nam) thầy giáo trường, phòng ban, thư viện - Trường Đại học Dược Hà Nội Mặc dù có nhiều cố gắng hạn chế thời gian, kiến thức tài liệu tham khảo nên luận văn tránh khỏi sai sót, khiếm khuyết nội dung hình thức, tơi mong nhận góp ý thầy để luận văn hồn thiện Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình bạn bè giúp đỡ động viên suốt trình học tập nghiên cứu vừa qua Hà Nội, ngày tháng Học Viên Trần Đức Lai năm 2014 MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tác dụng sinh học dẫn chất 2-thiohydantoin 1.1.1 Tác dụng ức chế tế bào ung thư 1.1.2 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm 1.1.3 Các tác dụng khác 1.2 Các phương pháp tổng hợp 2-thiohydantoin dẫn chất 1.2.1 Phản ứng tổng hợp 2-thiohydantoin 1.2.2 Phản ứng tổng hợp dẫn chất 5-aryliden-2-thiohydantoin 11 CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ 15 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất, dung mơi 15 2.2 Thiết bị thí nghiệm 15 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Phương pháp tổng hợp 2-thiohydantoin, 5-aryliden-2- 16 thiohydantoin 2.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc 16 2.3.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 16 2.3.3.1 Thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư 16 2.3.3.2 Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm 20 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 23 3.1 Tổng hợp hóa học 23 3.1.1 Tổng hợp 2-thiohydantoin 23 3.1.2 Tổng hợp số dẫn chất 5-aryliden-2-thiohydantoin 25 3.2 Xác định cấu trúc chất tổng hợp 35 3.2.1 Phổ hồng ngoại 35 3.2.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 35 3.2.3 Phổ khối lượng 36 3.3 Thử hoạt tính sinh học 36 3.3.1 Thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư 36 3.3.2 Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm 37 CHƯƠNG BÀN LUẬN 50 4.1 Về tổng hợp hóa học 50 4.1.1 Về phản ứng tổng hợp 2-thiohydantoin 50 4.1.2 Về phản ứng ngưng tụ tạo 5-aryliden-2-thiohydantoin 51 4.2 Về xác định cấu trúc chất tổng hợp 54 4.2.1 Về phổ hồng ngoại (IR) 55 4.2.2 Về phổ cộng hưởng từ hạt nhân1H-NMR 56 4.2.3 Về xác định đồng phân hình học dẫn chất 5-aryliden-2- 57 thiohydantoin 4.2.4 Về phổ cộng hưởng từ hạt nhân13C-NMR 58 4.2.5 Về phổ MS 61 4.3 Về hoạt tính sinh học 4.3.1 Về hoạt tính gây độc tế bào ung thư 62 4.3.2 Về tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm 64 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT 13 C-NMR H-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton A549 : Tế bào ung thư phổi người Ac2O : Anhydrid acetic AcOH : Acid acetic DMF : Dimethylformamid EGFR : Epidermal growth factor receptor (thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu mô) EtOH : Ethanol ESI : Phương pháp phun mù điện tử Hep-G2 : Tế bào ung thư gan người HCT116 : Tế bào ung thư đại tràng người HMBC : Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity) HSQC : Phổ tương tác dị hạt nhân qua liên kết (Heteronuclear Single-Quantum coherence) IC50 : Nồng độ ức chế 50% IR : Phổ hồng ngoại MCF7 : Tế bào ung thư biểu mô vú người MeOH : Methanol MS : Khốiphổ (Mass spectrometry) PC3 : Tế bào ung thư tuyến tiền liệt DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Kết tổng hợp 2-thiohydantoin (BT) dẫn chất 5aryliden-2-thiohydantoin (I-XIII) 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 Số liệu phổ 1H-NMR A, BM, BT Số liệu phổ IR dẫn chất 5-aryliden-2-thiohydantoin (IXIII) Số liệu phổ 1H-NMR dẫn chất 5-aryliden-2-thiohydantoin (I-XIII) Số liệu phổ13C-NMR dẫn chất 5-aryliden-2-thiohydantoin (I-XIII) Số liệu phổ ESI-MS dẫn chất 5-aryliden-2-thiohydantoin (I-XIII) Kết thử hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư thử nghiệm chất tổng hợp (theo phương pháp SRB) Kết xác định giá trị IC50 (µg/ml) số chất tổng hợp dòng tế bào ung thư thử nghiệm chất tổng hợp (theo phương pháp SRB) Kết thử tác dụng chất tổng hợp nồng độ 100 µg/ml số dòng tế bào ung thư người (theo phương pháp MTT) 3.11 Kết xác định giá trị IC50 (µg/ml) số chất tổng hợp số dòng tế bào (theo phương pháp MTT) Kết thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm chất tổng 4.1 hợp Các tương tác 1H-13C chất V 3.10 Trang 38 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 61 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang Hình 4.1 : Phổ HSQC hợp chất V 59 4.2 : Phổ HMBC hợp chất V 61 DANH MỤC PHỤ LỤC Phụ lục : Phổ 1H-NMR hợp chất A Phụ lục (2.1- 2.2) : Phổ 1H-NMR hợp chất B Phụ lục (3.1- 3.6) : Các phổ hợp chất I Phụ lục (4.1- 4.6) : Các phổ hợp chất II Phụ lục (5.1- 5.4) : Các phổ hợp chất III Phụ lục (6.1- 6.4) : Các phổ hợp chất IV Phụ lục (7.1- 7.6) : Các phổ hợp chất V Phụ lục (8.1– 8.4) : Các phổ hợp chất VI Phụ lục (9.1- 9.4) : Các phổ hợp chất VII Phụ lục 10 (10.1- 10.4) : Các phổ hợp chất VIII Phụ lục 11 (11.1- 11.4) : Các phổ hợp chất IX Phụ lục 12 (12.1- 12.4) : Các phổ hợp chất X Phụ lục 13 (13.1- 13.4) : Các phổ hợp chất XI Phụ lục 14 (14.1- 14.6) : Các phổ hợp chất XII Phụ lục 15 (15.1- 15.4) : Các phổ hợp chất XIII Phụ lục 16 : Phiếu trả lời kết thử hoạt tính gây độc tế bào (cytotoxicity assay) Phụ lục 17 : Phiếu trả lời kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (antimicrobial assay) NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ĐỘC TẾ BÀO IN VITRO CỦA CÁC MẪU DO TS TRẦN ANH – ĐẠI HỌC DƯỢC CUNG CẤP Đơn vị thực hiện: Khoa Dược lý Sinh hóa, Viện Dược liệu Ngun vật liệu thí nghiệm: Mẫu thử: 22 mẫu, bao gồm: T1, T2, T3, T4, T5, T6, Y7, T8, T9, T10, T11 B, D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9 Tế bào: gồm dòng tế bào: - Dòng tế bào A549 (tế bào ung thư phổi) - Dòng tế bào HTC116 (tế bào ung thư đại tràng) Hóa chất: - MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide) hãng In vitrogen - Adriamycin hãng Sigma - DMSO hãng sigma - Và hóa chất khác Máy móc thiết bị: máy đọc ELISA hãng Thermo Labsystems, kính hiển vi soi ngược, máy móc khác Phương pháp: 2.1 Nguyên tắc: - Áp dụng phương pháp MTT biên soạn tác giả Mosmann (1983) để đánh giá độc tính tế bào [1] Nguyên tắc phương pháp sau: MTT thử nghiệm in vitro để đo tăng sinh sống sót tế bào Tế bào nuôi cấy đĩa 96 giếng, đáy Hợp chất MTT 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5- diphenyltetrazolium bromid, có màu vàng thêm vào giếng tế bào ủ 37oC, 5% CO2 Màu vàng bị biến đổi thành formazan tím ty thể tế bào sống Khả hấp thụ dung dịch có màu định lượng máy quang phổ kế bước sóng 540 – 600 nm Sự biến đổi màu xảy enzyme reductase ty thể hoạt động, chuyển đổi liên quan trực tiếp đến số lượng tế bào sống sót Chúng tơi sử dụng phương pháp để nghiên cứu độc tính thuốc tế bào 2.2 Cách tiến hành: - Nuôi cấy tế bào: Các dòng tế bào lưu giữ nitơ lỏng, đánh thức trì mơi trường DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) có bổ sung huyết bê tươi 10%, dung dịch kháng sinh kháng nấm 1% (penicillin 50,000 units/L streptomycin 50 mg/L) Tế bào nuôi cấy cho phát triển tới mức khoảng 70%, thay môi trường sạch, tế bào dùng làm thí nghiệm - Mẫu thí nghiệm: Hòa mẫu thí nghiệm vào dung dịch DMSO 100% cho nồng độ gốc mẫu mg/ml Tiếp theo pha thuốc nghiên cứu thành thang nồng độ gồm nồng độ 100, 50, 25, 12.5, 6.25 μg/ml Nồng độ thuốc thử dùng theo tiêu chuẩn sàng lọc thuốc chống ung thư có nguồn gốc dược liệu tác giả Teicher 1997 [2] Adriamycin sử dụng làm chứng dương, với nồng độ thử 50; 25; 12,5; 5,25; 3,125 μM Dung dịch DMSO 0,1% sử dụng làm chứng âm - Quy trình ni cấy: Cho khoảng 2x104 tế bào/ml môi trường nuôi cấy (đối với dòng tế bào MCF-7, Hep-G2, A549) 4x104 tế bào/ml mơi trường ni cấy (đối với dòng tế bào HTC116) Để giếng trống làm chứng trắng (blank control) Các tế bào nuôi môi trường 37oC 5% CO2 cho phép tế bào gắn vào đáy giếng đĩa nuôi cấy Giữ tế bào 24 để tế bào ổn định Sau 24 nuôi cấy, thêm 20 μl thuốc thử thuốc chuẩn nồng độ khác vào giếng Mỗi nồng độ lặp lại giếng Lắc nhẹ đĩa ni cấy để thuốc tan hồn tồn mơi trường Ủ đĩa ni cấy từ 48 (37oC, 5% CO2) cho phép thuốc phát huy tác dụng Quan sát tế bào hàng ngày kính hiển vi Chuẩn bị dung dịch MTT nồng độ 5mg/ml Thêm 20 μl dung dịch MTT vào giếng đĩa nuôi cấy Lắc nhẹ cho MTT khuếch tán môi trường nuôi cấy Ủ 37oC để MTT chuyển hóa Loại bỏ môi trường giếng đĩa nuôi cấy Hồn trả formazan (sản phẩm chuyển hóa MTT) 100 μl DMSO Lắc kỹ để formazan tan hồn tồn 10 Đọc mật độ quang bước sóng 540 nm Mật độ quang phản ánh số lượng tế bào sống sót - % tế bào sống sau xử lý thuốc so với chứng trắng tính theo cơng thức sau: % tế bào sống = [OD540 tế bào xử lý] / [OD540 tế bào không xử lý thuốc] x 100% - Cách tính giá trị IC50: Giá trị IC50 tính phân tích hồi quy khơng tuyến tính đường cong đáp ứng liều tương ứng, sử dụng phần mềm Exell - Giá trị IC50 < 20m/ml coi có tác dụng Kết Bảng 1: Tác dụng mẫu thử nồng độ 100 μg/ml số dòng tế bào ung thư STT Ký hiệu mẫu Dòng tế bào % sống sót HTC116 100 17,5 51,2 31,6 DMSO Adriamycin T1 T2 A549 100 29,2 53,0 53,1 T3 30,6 29,7 T4 62,4 28,7 T5 T6 74,6 39,9 53,6 34,0 T7 81,1 48,8 10 11 T8 T9 66,5 56,1 78,6 35,1 12 T10 79,7 35,5 13 T11 42,8 27,5 14 15 16 17 D1 D2 D3 D4 74,9 85,0 87,6 87,9 56,3 51,4 52,0 46,3 18 D5 68,3 44,3 19 20 21 22 D6 D7 D8 D9 75,1 71,4 56,2 57,7 50,5 53,9 55,7 40,0 23 B 79,8 52,5 Kết luận Dương tính Dương tính dòng Hep-G2 Dương tính dòng MCF7, Hep-G2, HTC116 Dương tính dòng Dương tính dòng HTC116 Âm tính Dương tính dòng A549, Hep-G2, HTC116 Dương tính dòng HTC116 Âm tính Dương tính dòng HTC116 Dương tính dòng HTC116 Dương tính dòng A549 HTC116 Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính dòng HTC116 Dương tính dòng HTC116 Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính dòng HTC116 Âm tính Bảng 2: Giá trị IC50 (µg/ml) mẫu thử Mẫu thử Dòng tế bào (Giá trị IC50/µg/ml) A549 HTC116 Adriamycin 1,46 0,6 T1 - - T2 - 27,08 T3 - 24,4 T4 - Không tuân theo quy luật nồng độ T6 Không tuân theo quy luật nồng độ 43,22 T7 - 26,36 T9 - 41,26 T10 - 52,01 T11 78,4 Không tuân theo quy luật nồng độ D4 - Không tuân theo quy luật nồng độ D5 - 10,99 D9 - 15,25 Tài liệu tham khảo: Mosmann T Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays J Immunol Methods: 65, 55-63, 1983 Beverly A Teicher Anticancer drug development guide: Preclinical screening, clinical trials, and approval Humana Press, Totowa, New Jersey, 1997 Hà Nội, ngày tháng năm 2013 Người viết báo cáo TS Phạm Thị Nguyệt Hằng PHỤ LỤC 17: PHIẾU TRẢ LỜI KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH (ANTIMICROBIAL ASSAY) Chú thích: Ký hiệu mẫu Đề tài Phiếu trả lời kết Đề tài Ký hiệu mẫu Phiếu trả lời kết I T1 VIII T9 II T6 IX T10 III IV V VI VII T3 T8 T2 T11 T7 X XI XII XIII T4 T12 T5 T13 ... 3.1.1 Tổng hợp 2- thiohydantoin 23 3.1 .2 Tổng hợp số dẫn chất 5- aryliden- 2- thiohydantoin 25 3 .2 Xác định cấu trúc chất tổng hợp 35 3 .2. 1 Phổ hồng ngoại 35 3 .2. 2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 35 3 .2. 3... [16], [20 ], [21 ], [23 ], [ 35] , [39] Các thành tựu nghiên cứu tổng hợp hoạt tính sinh học dẫn chất 2- thiohydantoin nêu cho thấy việc nghiên cứu tổng hợp thử hoạt tính sinh học dẫn chất 2- thiohydantoin. .. nghiên cứu hố học hoạt tính sinh học dẫn chất 2- thiohydantoin, thực đề tài với mục tiêu sau: Tổng hợp số dẫn chất 5- aryliden- 2- thiohydantoin Thử sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào số dòng tế bào