Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số dẫn chất acid hydroxamic hướng ức chế enzym histon deacetylase

B GIÁO DC VÀ ÀO TO B Y T TRNG I HC DC HÀ NI ÀO TH KIM OANH TNG HP VÀ TH HOT TÍNH SINH HC CA MT S DN CHT ACID HYDROXAMIC HNG C CH ENZYM HISTON DEACETYLASE LUN ÁN TIN S DC HC HÀ NI 2013 B GIÁO DC VÀ ÀO TO B Y T TRNG I HC DC HÀ NI ÀO TH KIM OANH TNG HP VÀ TH HOT TÍNH SINH HC CA MT S DN CHT ACID HYDROXAMIC HNG C CH ENZYM HISTON DEACETYLASE LUN ÁN TIN S DC HC CHUYÊN NGÀNH HÓA DC MÃ S: 62.72.04.03 Ngi hng dn khoa hc: PGS.TS. Nguyn Hi Nam GS.TS. Sang-Bae Han HÀ NI 2013 i LI CAM OAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cu ca riêng tôi. Các s liu, kt qu đc trình bày trong lun án là trung thc, khách quan và cha tng đc ai công b trong bt k công trình nào khác. Tác gi lun án ào Th Kim Oanh ii LI CM N Trong quá trình nghiên cu và hoàn thành lun án, tôi đã nhn đc s giúp đ quý báu ca các thy cô giáo, các nhà khoa hc thuc nhiu lnh vc cùng đng nghip, gia đình và bn bè. u tiên, tôi xin đc gi li cm n chân thành và s bit n sâu sc ti PGS.TS. Nguyn Hi Nam, GS.TS. Sang-Bae Han, nhng ngi thy đã tn tình hng dn và to mi điu kin giúp đ tôi trong sut quá trình nghiên cu c  Vit Nam và Hàn Quc. Tôi xin chân thành cm n các đng nghip ti b môn Hóa dc đã ng h, đng viên tôi trong quá trình nghiên cu. Trong thi gian thc hin lun án, tôi đã nhn đc s phi hp, giúp đ ca các cá nhân, đn v trong và ngoài trng. Tôi xin chân thành cm n các anh ch Phòng thí nghim trung tâm – Trng đi hc Dc Hà Ni, Khoa hóa hc – Trng đi hc Khoa hc t nhiên – i hc Qu c gia Hà Ni, Phòng cng hng t - Vin hóa hc – Vin Khoa hc và Công ngh Vit Nam, Phòng khi ph - Vin hóa hc các hp cht thiên nhiên - Vin Khoa hc và Công ngh Vit Nam, các bn nghiên cu sinh ca b môn Dc lý, Khoa Dc, Trng đi hc Quc gia Chungbuk (Cheongju, Hàn Quc). Tôi xin chân thành cm n ng y, Ban giám hiu, Phòng đào to sau đi hc, các b môn và phòng ban chc nng – Trng đi hc Dc Hà N i đã to điu kin thun li cho tôi trong thi gian hc tp và hoàn thành lun án này. Cui cùng, xin gi li cm n sâu sc ti chng và hai con trai, ngi thân, bn bè đã luôn là nhng ngi đng viên, là đng lc giúp tôi phn đu hoàn thành lun án. Mt ln na, xin chân thành cm n tt c nhng s giúp đ quý báu mà mi ngi đã dành cho tôi. ào Th Kim Oanh iii MC LC Trang Danh mc các ký hiu, ch vit tt Danh mc các bng Danh mc các hình v, s đ T VN  1 CHNG 1. TNG QUAN 2 1.1. Histon deacetylase 2 1.1.1. Histon acetyltransferase 4 1.1.2. Histon deacetylase 4 1.1.2.1. Phân loi 5 1.1.2.2. Cu trúc ca HDAC và c ch phn ng deacetyl hóa 7 1.1.3. Mi liên quan gia ung th và s bt thng hot đng ca HAT hoc HDAC 10 1.2. Các cht c ch HDAC 11 1.2.1. Phân loi 11 1.2.2. C ch tác dng ca các cht c ch HDAC 14 1.2.3. Cu trúc ca các cht c ch HDAC 17 1.3. Tình hình nghiên cu trên th gii v các cht c ch HDAC 18 1.3.1. Các peptid vòng 19 1.3.2. Dn cht benzamid 20 1.3.3. Các acid béo mch ngn 21 1.3.4. Các dn cht ceton 22 1.3.5. Các hydroxamat và dn cht 22 1.3.5.1. Thay đi cu ni 24 1.3.5.2. Thay đi nhóm khóa hot đng 29 1.3.5.3. Thay đi nhóm chc hydroxamic 34 1.4. Các phng pháp to liên kt amid và tng hp acid hydroxamic 39 1.4.1. Các phng pháp to liên kt amid 39 1.4.1.1. Acyl halid 40 1.4.1.2. Acyl azid 41 iv 1.4.1.3. Acylimidazol 41 1.4.1.4. Anhydrid 42 1.4.1.5. Ester 43 1.4.2. Các phng pháp tng hp acid hydroxamic 45 1.4.2.1. Tng hp acid hydroxamic t ester 45 1.4.2.2. Tng hp acid hydroxamic t acid carboxylic 45 CHNG 2. NGUYÊN LIU, THIT B, NI DUNG VÀ PHNG PHÁP NGHIÊN CU 47 2.1. Nguyên liu 47 2.2. Thit b 48 2.3. Ni dung và phng pháp nghiên cu 49 2.3.1. Ni dung nghiên cu 49 2.3.2. Phng pháp nghiên cu 49 2.3.2.1. Phng pháp tng hp 49 2.3.2.2. Phng pháp kim tra đ tinh khit 51 2.3.2.3 Phng pháp phân tích cu trúc 52 2.3.2.4. Phng pháp th hot tính sinh hc 53 2.3.2.5. Docking 56 CHNG 3. KT QU NGHIÊN CU 57 3.1. Tng hp hóa hc và phân tích d liu ph 57 3.1.1. Các dn cht N 1 -(benzo[d]thiazol-2-yl)-N 4 -hydroxysuccinamid và N 1 -(benzo[d]thiazol-2-yl)-N 5 -hydroxyglutaramid 57 3.1.1.1. Kt qu tng hp 57 3.1.1.2. Kt qu phân tích ph ca các dn cht 3a-f và 5a-f 63 3.1.2. Các dn cht N 1 -(benzo[d]thiazol-2-yl)-N 6 -hydroxyadipamid và N 1 -(benzo[d]thiazol-2-yl)-N 8 -hydroxyoctandiamid 66 3.1.2.1. Kt qu tng hp 66 3.1.2.2. Kt qu phân tích ph ca các dn cht 7a-f và 9a-h 73 3.1.3. Tng hp cht N 1 -(thiazol-2-yl)-N 8 -hydroxyoctandiamid (23) 76 3.1.4. Các dn cht N 1 -(benzo[d]thiazol-2-yl)-N 4 -(3-(hydroxyamino)-3- oxopropyl)succinamid và N 1 -(benzo[d]thiazol-2-yl)-N 5 -(2-(hydroxy amino)-2-oxoethyl)glutaramid 77 v 3.1.4.1. Kt qu tng hp 77 3.1.4.2. Kt qu phân tích ph ca các dn cht 11a-d và 13a-f 82 3.1.5. Các dn cht N 1 -(3-(hydroxyamino)-3-oxopropyl)-N 4 - phenylsuccinamid và N 1 -(2-(hydroxyamino)2-oxoethyl)-N 5 -phenyl glutaramid 85 3.1.5.1. Kt qu tng hp 85 3.1.5.2. Kt qu phân tích ph ca các dn cht 17a-c, f, h và 20a-h 93 3.1.6. Tng hp N 1 -(4-clorophenyl)-N 6 -(3-(hydroxyamino)-3-oxopropyl) adipamid (26) 97 3.2. Hot tính sinh hc 102 3.2.1. Tác dng c ch HDAC 102 3.2.2. Hot tính kháng t bào ung th in vitro 105 3.2.3. Hot tinh kháng t bào ung th in vivo 107 CHNG 4. BÀN LUN 110 4.1. Tng hp hóa hc 110 4.1.1. Tác nhân acyl hóa là anhydrid acid 110 4.1.2. Tác nhân acyl hóa là acid carboxylic 111 4.1.3. Tác nhân acyl hóa là ester 117 4.2. Khng đnh cu trúc 118 4.2.1. Ph hng ngoi 118 4.2.2. Ph khi lng 120 4.2.2.1. Phân tích cm pic ion phân t 121 4.2.2.2. C ch phá mnh ca phân t theo cu trúc d kin 122 4.2.3. Ph cng hng t ht nhân 126 4.2.3.1. Ph cng hng t ht nhân ca các acid hydroxamic mang khung benzothiazol 126 4.2.3.2. Ph cng hng t ht nhân ca các acid hydroxamic mang vòng phenyl 134 4.2.3.3. Ph cng hng t ht nhân ca acid hydroxamic mang vòng thiazol 137 4.3. Hot tính sinh hc 138 4.3.1. Các acid hydroxamic mang khung benzothiazol 138 4.3.2. Các acid hydroxamic mch alkyl có liên kt amid 143 vi 4.3.3. Docking 147 4.3.4. Hot tính kháng t bào ung th in vivo 148 KT LUN VÀ KIN NGH 151 DANH MC CÁC CÔNG TRÌNH Ã CÔNG B TÀI LIU THAM KHO PH LC vii DANH MC CÁC KÝ HIU, CH VIT TT  (ppm)  dch chuyn hóa hc (phn triu) 13 C-NMR Ph cng hng t ht nhân carbon 13 ( 13 C-Nuclear Magnetic Resonance) 1 H-NMR Ph cng hng t ht nhân proton ( 1 H-Nuclear Magnetic Resonance) AcOH Acid acetic ADN Acid desoxyribonucleic AsPC-1 Dòng t bào ung th ty ngi BCL2 B-cell lymphoma 2 BSA Albumin huyt thanh bò (bovine serum albumin) CBFb Core-binding factor subunit beta CBHA m-carboxycinnamic bishydroxamid acid CBP Cyclic-AMP response element-binding protein CDI Carbonyl diimidazol CTPT Công thc phân t DCC Dicyclohexyl carbodiimid DCM Dicloromethan DMEM Dulbecco’s modified Eagle medium DMF Dimethylformamid DMSO-d 6 Dimethylsulfoxid deutri hóa EGTA Acid ethylen glycol tetraacetic ESI Ion hóa phun bi đin t (Electron Spray Ionization) FBS Huyt thanh bào thai bò (Fetal bovine serum) FDA Cc qun lý Thc phm và Dc phm M GAPDH Glyceraldehyd-3-phosphat dehydrogenase HAT Histon acetyltransferase HATU N-[(dimethylamino)-1H-1,2,3-triazol[4,5-b]pyridin-1ylmethylen]-N- methylmethanaminium hexafluorophosphat HDAC Histon deacetylase HDIs Các cht c ch HDAC HDLP Histone deacetylase-like protein HMBC Ph tng tác đa liên kt d nhân HOBt 1-hydroxybenzotriazol HSQC Ph tng tác d nhân lng t đn IC 50 Nng đ c ch 50% IR Ph hng ngoi (Infrared Spectrometry) i Dch chuyn đin tích viii J Hng s tng tác (Hz) MCF-7 T bào ung th vú ngi MeOH Methanol MOZ Monocytic leukemia zinc-finger protein MS Ph khi lng (Mass Spectrometry) MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid NCI-H460 T bào ung th phi ngi PBS Dung dch mui có b sung đm phosphat (Phosphate buffered saline) PC-3 T bào ung th tin lit tuyn ngi PCl 3 Phosphor triclorid PCl 5 Phosphor pentaclorid POCl 3 Phosphor oxyclorid PVDF Màng polyvinyliden difluorid rH Dch chuyn hydro RAR Receptor acid retinoic ROS Reactive oxygen species RPMI Môi trng nuôi cy t bào (Roswell Park Memorial Institute medium) SAHA Acid suberoylanilid hydroxamic SDS-PAGE Gel SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfat polyacrylamid gel electrophoresis) Sin 3 Protein c ch phiên mã SMMHC T bào c (Smooth muscle myosin heavy chain) SW620 T bào ung th đi tràng ngi TEA Triethylamin TSA Trichostatin A t o C Nhit đ nóng chy WAF1 Cht c ch kinase ph thuc cyclin ZBG Nhóm gn ion Zn 2+ [...]... methyl hóa và phosphoryl hóa, d ng nh s acetyl hóa ph n lõi histon là quá trình bi n i ã c nghiên c u và hi u bi t t ng t n h n Histon có th t n t i m t trong hai d ng i l p nhau là acetyl hóa ho c deacetyl hóa Các enzym óng vai trò trong s chuy n i này là histon acetyltransferase (HAT) và histon deacetylase (HDAC) [11,22,40,63,71] Khi x y ra s acetyl hóa histon, nhi m s c th s c tháo xo n và ho t hóa... deacetylase; Ac: acetyl 3 1.1.1 Histon acetyltransferase (HAT) Histon acetyltransferase (HAT) xúc tác chuy n nhóm acetyl t acetyl coenzym A n liên k t v i nhóm -amino c a lysin ph n u N c a histon S chuy n i này x y ra nhi u h n trên histon H3, H4 V trí acetyl hóa quan tr ng là Lys9 và Lys14 trên histon H3; Lys5, Lys8, Lys12 và Lys16 trên histon H4 [71,77] S acetyl hóa histon làm tháo xo n nhi m s c... Trên mi ng túi có 1 vành nh c t o nên t 1 vài vòng xo n protein (ph n vành s t ng tác v i nhóm nh n di n b m t c a HDAC) [11] 8 Hình 1.5 C u trúc v trí ho t ng c a HDLP khi liên k t v i ph n acetyl-lysin c a histon (trái) và Trichostatin A (ph i) [13] Finnin là ng i u tiên nghiên c u chi ti t t ng tác gi a ch t c ch HDAC và enzym HDAC n m 1999 [27] Nghiên c u s d ng HDLP (histone deacetylase like protein),... c: các acid hydroxamic, các peptid vòng, các acid béo, benzamid và các d n ch t ceton (b ng 1.1) 12 B ng 1.1 Phân lo i các ch t c ch HDAC [22] Ch t Các acid hydroxamic C u trúc Ch t O O O TSA (Trichostatin A) C u trúc Oxamflatin NHOH NHOH H N O S N O OH O Acid suberoylanilid hydroxamic H N NVP-LAQ824 NHOH O O H N N NHOH O HN (SAHA) CBHA (Acid mcarboxycinnamic bishydroxamid) Acid sulfonamid hydroxamic. .. các HAT khác c ng nh v i các nhân t sao chép mã 1.1.2 Histon deacetylase (HDAC) Histon deacetylase có tác d ng ng c v i HAT, nó xúc tác vi c lo i b nhóm acetyl c a lysin ph n u N c a histon, d n n nhi m s c th b óng xo n và c ch quá trình phiên mã [22,40,43,63,71,81] HDAC c b o t n trong quá trình ti n hóa và bi u hi n trong các t ch c c a các sinh v t t n bào nguyên th y cho n loài ng i 4 T ng t nh... t s d n ch t -alkyl c a SAHA 24 Hình 1.24 Các acid phenylthiazol hydroxamic t 25 Hình 1.25 M t s acid phenylthiazol hydroxamic 30 26 Hình 1.26 Các d n ch t acid biphenyl -hydroxamic 30 27 Hình 1.27 Các acid isoxazol -hydroxamic 31 28 Hình 1.28 ADS100380 32 29 Hình 1.29 Các 30 Hình 1.30 Các arylthiophen hydroxamat 33 31 Hình 1.31 Các acid pyridin-thiophen -hydroxamic 33 32 Hình 1.32 Các d n ch t biphenyl... hóa h c, trong ó các d n ch t acid hydroxamic c các nhà khoa h c trên th gi i t p trung nghiên c u nhi u nh t do c u trúc n gi n d t ng h p, ho t tính c ch HDAC m nh H i nh p v i xu h ng nghiên c u c a th gi i và tìm ki m ch t c ch HDAC có ho t tính kháng t bào ung th t t, lu n án “T ng h p và th ho t tính sinh h c c a m t s d n ch t acid hydroxamic h ng c ch enzym histon deacetylase c th c hi n v i... là coenzym c a HDAC, n m 2+ ion Zn có th t o 5 liên k t ph i trí: 4 liên k t v i nguyên t oxy, nit c a các acid amin, 1 liên k t ph i trí v i nguyên t oxy c a nhóm acetyl c a phân t acetyl-lysin ph n u N c a histon, t ó xúc tác tách lo i nhóm acetyl Khi có m t các ch t c ch HDAC nh các acid hydroxamic, ion Zn2+ t o 2 liên k t ph i trí v i 2 nguyên t oxy c a nhóm hydroxamic (hình 1.5) [11] - Kênh enzym. .. c c u t o c a các acid hydroxamic 3a-f 139 60 Hình 4.17 Các acid hydroxamic 5a-f, 7a-f 139 61 Hình 4.18 K t qu phân tích Western blot c a các ch t 7a-f 139 62 Hình 4.19 C u trúc các acid hydroxamic 9a-h 140 63 Hình 4.20 K t qu phân tích Western blot c a các ch t 9a-f 141 64 Hình 4.21 T ng h p các aryltriazolylhydroxamat 27a-d 142 65 Hình 4.22 C u trúc c a các acid hydroxamic 11a-d và 13a-f 143 66 Hình... Zn2+, kênh enzym d ng túi hình ng Bao quanh ion Zn2+ là 2 c p acid amin Histidin-Aspartic (HDLP là His131-Asp166 và His132-Asp173, HDAC 8 là His142-Asp176 và His143Asp183), m t phân t Tyrosin óng vai trò cho proton (HDLP là Tyr297, HDAC8 là Tyr306) và 2 acid aspartic (HDLP là Asp258 và Asp168, HDAC8 là Asp178 và Asp267), m t phân t Histidin (HDLP là His170, HDAC8 là His180) [11] áy kênh enzym Trong . DC VÀ ÀO TO B Y T TRNG I HC DC HÀ NI ÀO TH KIM OANH TNG HP VÀ TH HOT TÍNH SINH HC CA MT S DN CHT ACID HYDROXAMIC HNG C CH ENZYM HISTON DEACETYLASE. GIÁO DC VÀ ÀO TO B Y T TRNG I HC DC HÀ NI ÀO TH KIM OANH TNG HP VÀ TH HOT TÍNH SINH HC CA MT S DN CHT ACID HYDROXAMIC HNG C CH ENZYM HISTON DEACETYLASE. pháp tng hp acid hydroxamic 45 1.4.2.1. Tng hp acid hydroxamic t ester 45 1.4.2.2. Tng hp acid hydroxamic t acid carboxylic 45 CHNG 2. NGUYÊN LIU, THIT B, NI DUNG VÀ PHNG PHÁP