Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của một số dẫn chất acid hydroxamic hướng ức chế enzym histon deacetylase

Các chất ức chế HDAC được chia thành 5 nhóm dựa theo cấu trúc hóa học, trong đó các dẫn chất acid hydroxamic được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu nhiều nhất do cấu tr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐÀO THỊ KIM OANH

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT ACID HYDROXAMIC HƯỚNG ỨC CHẾ ENZYM HISTON DEACETYLASE

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐÀO THỊ KIM OANH

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT ACID HYDROXAMIC HƯỚNG ỨC CHẾ ENZYM HISTON DEACETYLASE

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH HÓA DƯỢC

MÃ SỐ: 62.72.04.03

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Hải Nam

HÀ NỘI 2013

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu, kết quả được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả luận án

Đào Thị Kim Oanh

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực cùng đồng nghiệp, gia đình và bạn bè

Đầu tiên, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sự biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Hải Nam, GS.TS Sang-Bae Han, những người thầy đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu cả ở Việt Nam và Hàn Quốc

Tôi xin chân thành cảm ơn các đồng nghiệp tại bộ môn Hóa dược đã ủng hộ, động viên tôi trong quá trình nghiên cứu

Trong thời gian thực hiện luận án, tôi đã nhận được sự phối hợp, giúp đỡ của các cá nhân, đơn vị trong và ngoài trường Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị Phòng thí nghiệm trung tâm – Trường đại học Dược Hà Nội, Khoa hóa học – Trường đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, Phòng cộng hưởng từ - Viện hóa học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Phòng khối phổ - Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, các bạn nghiên cứu sinh của bộ môn Dược lý, Khoa Dược, Trường đại học Quốc gia Chungbuk (Cheongju, Hàn Quốc)

Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban giám hiệu, Phòng đào tạo sau đại học, các bộ môn và phòng ban chức năng – Trường đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian học tập và hoàn thành luận án này

Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới chồng và hai con trai, người thân, bạn

bè đã luôn là những người động viên, là động lực giúp tôi phấn đấu hoàn thành luận

MỤC LỤC

Trang Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt

1.3 Tình hình nghiên cứu trên thế giới về các chất ức chế HDAC 18

1.4 Các phương pháp tạo liên kết amid và tổng hợp acid hydroxamic 39

1.4.1.3 Acylimidazol 41

1.4.2.2 Tổng hợp acid hydroxamic từ acid carboxylic 45 CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU

47

3.1.4.1 Kết quả tổng hợp 77 3.1.4.2 Kết quả phân tích phổ của các dẫn chất 11a-d và 13a-f 82 3.1.5 Các dẫn chất N 1 -(3-(hydroxyamino)-3-oxopropyl)-N 4-

phenylsuccinamid và N 1 -(2-(hydroxyamino)2-oxoethyl)-N 5-phenyl

4.2.2.2 Cơ chế phá mảnh của phân tử theo cấu trúc dự kiến 122

4.3.3 Docking 147

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

 (ppm) Độ dịch chuyển hóa học (phần triệu)

13

C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 (13C-Nuclear Magnetic

Resonance)

1

H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-Nuclear Magnetic Resonance)

ADN Acid desoxyribonucleic

AsPC-1 Dòng tế bào ung thư tụy người

BCL2 B-cell lymphoma 2

CBFb Core-binding factor subunit beta

CBP Cyclic-AMP response element-binding protein

CDI Carbonyl diimidazol

DMSO-d 6 Dimethylsulfoxid deutri hóa

ESI Ion hóa phun bụi điện tử (Electron Spray Ionization)

FBS Huyết thanh bào thai bò (Fetal bovine serum)

FDA Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm mỹ

HAT Histon acetyltransferase

HATU

N-[(dimethylamino)-1H-1,2,3-triazol[4,5-b]pyridin-1ylmethylen]-N-methylmethanaminium hexafluorophosphat HDAC Histon deacetylase

HDIs Các chất ức chế HDAC

HDLP Histone deacetylase-like protein

HMBC Phổ tương tác đa liên kết dị nhân

MS Phổ khối lượng (Mass Spectrometry)

MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid

NCI-H460 Tế bào ung thư phổi người

PBS Đệm phosphat (Phosphat buffered saline)

PC-3 Tế bào ung thư tiền liệt tuyến người

RAR Receptor acid retinoic

ROS Reactive oxygen species

RPMI Môi trường nuôi cấy tế bào

SAHA Acid suberoylanilid hydroxamic

SDS-PAGE Gel SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfat polyacrylamid gel

electrophoresis) Sin 3 Protein ức chế phiên mã

SMMHC Tế bào cơ (Smooth muscle myosin heavy chain)

SW620 Tế bào ung thư đại tràng người

toC Nhiệt độ nóng chảy

WAF1 Chất ức chế kinase phụ thuộc cyclin

ZBG Nhóm gắn ion Zn2+

DANH MỤC CÁC BẢNG

2 Bảng 1.2 Các chất ức chế HDAC đã và đang được thử lâm sàng 19

3 Bảng 1.3 Tác dụng ức chế HDAC2 và độc tính tế bào của dẫn chất

-alkoxy (AH10)

28

4 Bảng 3.1 Kết quả phân tích phổ khối của các chất 3a-f, 5a-f 64

5 Bảng 3.2 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của các chất 3a-f, 5a-f 64

6 Bảng 3.3 Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của các chất 5a-f 66

7 Bảng 3.4 Kết quả phân tích phổ khối của các chất 7a-f, 9a-h 73

8 Bảng 3.5 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của các chất 7a-f, 9a-h 73

9 Bảng 3.6 Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của các chất 7a-f, 9a-h 75

10 Bảng 3.7 Kết quả phân tích phổ khối của các chất 11a-d, 13a-f 82

11 Bảng 3.8 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của các chất 11a-d, 13a-f 83

12 Bảng 3.9 Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của các chất 11a-d, 13a-f 85

13 Bảng 3.10 Kết quả phân tích phổ khối của các chất 17a-c, f, h, 20a-h 93

14 Bảng 3.11 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của các chất 17a-c,f,h,

19 Bảng 3.16 Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư người in vitro 105

20 Bảng 3.17 Sự thay đổi kích thước và khối lượng của khối u trên chuột

ở nhóm thử, nhóm trắng đối chiếu và SAHA

107

21 Bảng 3.18 Phần trăm thay đổi cân nặng của chuột trong quá trình thí

nghiệm

108

27 Bảng 4.6 Năng lượng liên kết với trung tâm hoạt động của HDAC 147

28 Bảng 4.7 Kết quả ức chế sự phát triển khối u in vivo của chất 9g ở

các liều khác nhau với dòng tế bào ung thư PC-3

149

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ

HÌNH VẼ

5 Hình 1.5 Cấu trúc vị trí hoạt động của HDLP khi liên kết với phần

acetyl-lysin của histon (trái) và Trichostatin A (phải)

9

7 Hình 1.7 Điều hòa sự phát triển và sống sót của tế bào bởi các chất

ức chế HDAC

14

8 Hình 1.8 Các chất ức chế HDAC thúc đẩy sự chết tế bào 16

9 Hình 1.9 Công thức cổ điển của HDI và vị trí của HDI trong túi

16 Hình 1.16 a) Các acid biphenyl-4-yl-acrylohydroxamic (AH2); b)

Các dẫn chất với cầu nối có hai liên kết đôi (AH3) và dạng khử hóa của AH3 (AH4)

25

19 Hình 1.19 Các aryloxyalkanoic N-hydroxyamid (AH9) 26

TT Tên hình Trang

24 Hình 1.24 Các acid phenylthiazol hydroxamic tương tự SAHA 29

39 Hình 1.39 Sự thủy phân và tạo chelat với Zn2+ của KD5170 37

40 Hình 1.40 a) Tổng hợp amid thông qua tạo ester hoạt hóa; b) Một số

alcol hay dùng

44

43 Hình 3.3 Hình ảnh khối u của nhóm thử, nhóm trắng đối chiếu và

TT Tên hình Trang

52 Hình 4.9 a) Phổ 1H-NMR; b) Phổ 13C-NMR của chất 9g 130

53 Hình 4.10 Phổ tương tác đơn lượng tử dị nhân – HSQC của chất 9g 130

54 Hình 4.11 Phổ tương tác đa liên kết dị nhân - HMBC của chất 9g 132

59 Hình 4.16 Công thức cấu tạo của các acid hydroxamic 3a-f 139

61 Hình 4.18 Kết quả phân tích Western blot của các chất 7a-f 139

63 Hình 4.20 Kết quả phân tích Western blot của các chất 9a-f 141

64 Hình 4.21 Tổng hợp các aryltriazolylhydroxamat 27a-d 142

65 Hình 4.22 Cấu trúc của các acid hydroxamic 11a-d và 13a-f 143

66 Hình 4.23 Cấu trúc của các acid hydroxamic 17a-c, f, h và 20a-h 144

67 Hình 4.24 Kết quả phân tích Western blot của một số chất đại diện

dãy 13 và 20

144

68 Hình 4.25 Cấu trúc không gian của SAHA, 17a và 20a 145

70 Hình 4.27 Cấu trúc chung của các dẫn chất homo-oxa-SAHA 146

71 Hình 4.28 Docking của chất 9g (màu cam), 9h (màu tím hồng) và

SAHA (màu xanh lá) với HDAC8

SƠ ĐỒ

2 Sơ đồ 1.2 Phản ứng tạo liên kết amid thông qua acid hoạt hóa 40

3 Sơ đồ 1.3 a) Phản ứng tạo acyl clorid; b) Tổng hợp amid 40

6 Sơ đồ 1.6 Tổng hợp amid sử dụng tác nhân hoạt hóa CDI 42

7 Sơ đồ 1.7 Tổng hợp amid sử dụng tác nhân hoạt hóa DCC 43

8 Sơ đồ 1.8 Tổng hợp amid sử dụng tác nhân hoạt hóa ethyl

cloroformat

43

10 Sơ đồ 1.10 Tổng hợp một số dẫn chất amid ngược của SAHA 45

12 Sơ đồ 1.12 Tổng hợp các acid phenylthiazol hydroxamic 46

14 Sơ đồ 3.2 Tổng hợp N 1 -(6-nitrobenzo[d]thiazol-2-yl)-N 5

-hydroxyglutaramid (5f)

63

16 Sơ đồ 3.4 Tổng hợp N 1 -(thiazol-2-yl)-N 8-hydroxyoctandiamid (23) 76

18 Sơ đồ 3.6 Tổng hợp các dẫn chất 17a-c, f, h và 20a-h 86

19 Sơ đồ 3.7 Tổng hợp N 1 -(4-clorophenyl)-N 6

21 Sơ đồ 4.2 Tổng hợp các acid hydroxamic 3a-f và 5a-f 111

22 Sơ đồ 4.3 Tổng hợp acid hydroxamic 3a-f bằng tác nhân hoạt hóa

DCC

112

23 Sơ đồ 4.4 Vai trò của HOBt trong quá trình tạo ester hoạt hóa 113

TT Tên sơ đồ Trang

24 Sơ đồ 4.5 Tổng hợp 3a-f sử dụng tác nhân hoạt hóa isobutyl

cloroformat

113

25 Sơ đồ 4.6 Tổng hợp 3a-f sử dụng tác nhân hoạt hóa CDI 114

27 Sơ đồ 4.8 Tổng hợp các ester trung gian của các dãy chất 7, 9, 11,

13, 17, 20 và chất 22

116

30 Sơ đồ 4.11 Tổng hợp một số dẫn chất -alkoxy của SAHA 117

31 Sơ đồ 4.12 Cơ chế phản ứng tổng hợp các acid hydroxamic dãy 7, 9,

11, 13, 17 và 20, chất 23, 26 từ ester

117

ĐẶT VẤN ĐỀ

Những tiến bộ trong các ngành khoa học cơ bản như di truyền học, sinh học phân tử, sinh học tế bào và đặc biệt là sự ra đời của bản đồ gen người đã giúp cho các nhà khoa học có những hiểu biết sâu sắc về khối u ở cấp độ phân tử cũng như các quá trình quyết định sự phát triển của khối u Do đó, hàng loạt các protein đóng vai trò quan trọng trong ung thư đồng thời cũng là đích mà các thuốc điều trị ung thư hướng tới đã được phát hiện như các protein kinase phụ thuộc cyclin, protein gây ung thư Bcl-2, p53, các farnesyltransferase, histon deacetylase (HDAC), telomerase, STAT…[27] Nhờ vậy, việc nghiên cứu và phát triển thuốc điều trị ung thư theo phương pháp mới hiện nay, phương pháp thiết kế công thức dựa trên đích tác dụng phân tử, ngày càng đạt được nhiều thành tựu đáng kể

Một trong những đích tác dụng phân tử đang được chú ý hiện nay là các histon deacetylase (HDAC) Nghiên cứu về các HDAC đã xác định hoạt động bất thường của HDAC có liên quan đến nhiều bệnh ung thư Vì vậy, các chất ức chế HDAC đang trở thành các tác nhân chống ung thư đầy triển vọng Acid suberoylanilid hydroxamic (Zolinza®, 2006) và depsipeptid (Romidepsin®, 2009) là hai chất ức chế HDAC đã được Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ (US-FDA) phê duyệt trong điều trị u lympho da tế bào T [21] Bên cạnh đó, một số chất ức chế HDAC khác cũng đang được nghiên cứu và trải qua các pha thử lâm sàng như NVL-LAQ824, MS-275, CI-

994, PXD-101 [21,33,65] Các chất ức chế HDAC được chia thành 5 nhóm dựa theo cấu trúc hóa học, trong đó các dẫn chất acid hydroxamic được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu nhiều nhất do cấu trúc đơn giản dễ tổng hợp, hoạt tính ức chế HDAC mạnh

Hội nhập với xu hướng nghiên cứu của thế giới và tìm kiếm chất ức chế HDAC

có hoạt tính kháng tế bào ung thư tốt, luận án “Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của một số dẫn chất acid hydroxamic hướng ức chế enzym histon deacetylase” được thực hiện với 2 mục tiêu:

1 Thiết kế và tổng hợp được khoảng 40 - 50 dẫn chất acid hydroxamic mới hướng ức chế HDAC

2 Thử tác dụng ức chế HDAC và tác dụng kháng tế bào ung thư của các chất tổng hợp được

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 HISTON DEACETYLASE

Các nghiên cứu về ung thư đã xác định căn nguyên của bệnh không chỉ do cơ chế di truyền học mà còn do cơ chế di truyền biểu hiện gen Cơ chế di truyền biểu hiện gen liên quan đến những thay đổi trong quá trình biểu hiện gen mà không ảnh hưởng đến cấu trúc chuỗi ADN Cơ chế di truyền biểu hiện gen gồm các biến đổi về ADN và histon như sự methyl hóa, acetyl hóa [25,55,71,90] Những biến đổi này dẫn đến các bất thường của quá trình biểu hiện gen thể hiện ở sự phát triển, sự biệt hóa và sự chết

tế bào theo chương trình, kết quả là tăng khả năng biến đổi của tế bào

Cho đến nay, các nghiên cứu đã chứng minh cấu trúc của nhiễm sắc thể là yếu

tố quan trọng trong điều hòa quá trình biểu hiện gen [11,22,63,71] Cấu trúc của nhiễm sắc thể là một phức hợp cấu tạo bởi ADN, các histon và các protein không phải histon [22,40] Histon là các protein cơ bản giàu acid amin như lysin, arginin, được chia thành 5 nhóm chính (H1, H2A, H2B, H3, H4) Từng cặp của H2A, H2B và H3, H4 cùng nhau tạo nên lõi protein octomer hình đĩa Lõi protein này được quấn quanh bởi

146 cặp ADN tạo nên nucleosom (hình 1.1) [11,22,63,71,77] Các nucleosom nối với nhau nhờ phần amino tận của các histon Bốn cặp histon lõi có 2 phần quan trọng:

phần đuôi C nằm bên trong lõi của nucleosom và phần đầu N với acid amin kết thúc là

lysin nằm bên ngoài nucleosom [63] Cấu trúc này chịu ảnh hưởng chính bởi sự biến

đổi phần đầu N của histon Phần đầu N của histon, đặc biệt H3, H4 là nơi diễn ra rất

nhiều quá trình biến đổi khác nhau trong phiên mã như acetyl hóa/deacetyl hóa lysin, methyl hóa lysin và arginin, phosphoryl hóa serin và ubiquinin, sumoyl hóa lysin [22,40,71]

Cơ chế của phần lớn các biến đổi trên đều chưa sáng tỏ So với sự methyl hóa

và phosphoryl hóa, dường như sự acetyl hóa phần lõi histon là quá trình biến đổi đã được nghiên cứu và hiểu biết tường tận hơn Histon có thể tồn tại ở một trong hai dạng đối lập nhau là acetyl hóa hoặc deacetyl hóa Các enzym đóng vai trò trong sự chuyển đổi này là histon acetyltransferase (HAT) và histon deacetylase (HDAC) [11,22,40,63,71] Khi xảy ra sự acetyl hóa histon, nhiễm sắc thể sẽ được tháo xoắn và

hoạt hóa quá trình phiên mã, trong khi đó deacetyl hóa phần đầu N của histon sẽ làm

giảm quá trình phiên mã thông qua sự đóng xoắn nhiễm sắc thể Nói chung, khi tăng acetyl histon dẫn đến thúc đẩy quá trình phiên mã và ngược lại khi sự acetyl hóa histon giảm làm ngăn cản quá trình phiên mã (hình 1.2) [63,71]

Hình 1.1 Sơ đồ cấu tạo nucleosom [71]

Hình 1.2 HAT và HDAC điều hòa quá trình phiên mã [71]

* Chú thích: HAT: histon acetyltransferase; HDAC: histon deacetylase; Ac: acetyl

1.1.1 Histon acetyltransferase (HAT)

Histon acetyltransferase (HAT) xúc tác chuyển nhóm acetyl từ acetyl coenzym

A đến liên kết với nhóm -amino của lysin ở phần đầu N của histon Sự chuyển đổi

này xảy ra nhiều hơn trên histon H3, H4 Vị trí acetyl hóa quan trọng là Lys9 và Lys14trên histon H3; Lys5, Lys8, Lys12 và Lys16 trên histon H4 [71,77] Sự acetyl hóa histon

làm tháo xoắn nhiễm sắc thể bằng cách trung hòa điện tích dương của phần đầu N của

histon, do vậy làm giảm ái lực của histon với phần tích điện âm trên ADN [70] Chính

vì vậy, việc tăng acetyl hóa histon làm nới lỏng cấu trúc nhiễm sắc thể và hoạt hóa gen

Các histon acetyltransferase được chia thành 5 nhóm bao gồm khoảng 20 isoenzym [15,22,40,70] Cơ sở của việc phân nhóm này là dựa trên sự tương tự nhau của cấu trúc chuỗi cơ bản và thường có cơ chất đặc hiệu Nhóm HAT đầu tiên là các

GNAT (Gcn5-related N-acetyltransferase), bao gồm các protein liên quan đến sự bắt

đầu phiên mã, như là Gcn5 và PCAF (p300/cyclic-AMP-response-element binding protein-associated factor) Nhóm thứ hai là các MYST, được đặt tên theo protein gắn

Zn trong bệnh bạch cầu đơn nhân to (MOZ-monocytic leukemia zinc-finger protein), YBF2/SAS3, SAS2 và HIV-1 TAT-interactive protein 60 (TIP60) Nhóm thứ ba là 2 enzym liên quan chặt chẽ đến protein p300 và CBP (cyclic-AMP response element-binding protein), chúng hoạt động như chất đồng hoạt hóa một số phức hợp của nhân

tố sao chép mã Hai nhóm HAT khác là các chất đồng hoạt hóa receptor nhân như phức hợp TFIID (general transcription factor IID) (cấu trúc dưới phân tử là TAFII250)

và ACTR (amplified in breast cancer), SRC1 (avian sarcoma viral oncogene homologue 1) [20] Không chỉ acetyl hóa đuôi histon, các HAT còn có thể acetyl hóa các chất đồng hoạt hóa, chất đồng ức chế sao chép mã như E2F, p53, GATA1 [40,76] Như vậy, các HAT đóng vai trò quan trọng trong hoạt hóa cũng như ức chế gen Các HAT không gắn kết trực tiếp với ADN mà tạo thành phức hợp với các HAT khác cũng như với các nhân tố sao chép mã

1.1.2 Histon deacetylase (HDAC)

Histon deacetylase có tác dụng ngược với HAT, nó xúc tác việc loại bỏ nhóm

acetyl của lysin ở phần đầu N của histon, dẫn đến nhiễm sắc thể bị đóng xoắn và ức

chế quá trình phiên mã [22,40,43,63,71,81] HDAC được bảo tồn trong quá trình tiến hóa và biểu hiện trong các tổ chức của các sinh vật từ đơn bào nguyên thủy cho đến loài người

Tương tự như HAT, các HDAC không gắn kết trực tiếp với chuỗi ADN mà tạo phức hợp với các chất đồng ức chế phiên mã khác Các HDAC khác nhau tạo các phức hợp khác nhau Hoạt tính của HDAC được điều hòa bởi sự biến đổi sau phiên mã Các HDAC không chỉ deacetyl hóa histon, mà còn deacetyl hóa các protein không histon như p53, Ku70, pRB và E2F-1 [16,59,81]

1.1.2.1 Phân loại

HDAC1 ở người là histon deacetylase đầu tiên được xác định bằng cách sử dụng chất ức chế HDAC trapoxin vào năm 1996 [80] Cho đến nay, 18 HDAC khác nhau ở người đã được xác định và chia thành 4 nhóm (hình 1.3) [11,22,33,34,40,56,71, 89] Các HDAC khác nhau ở tính tương đồng chuỗi, cơ chất đặc hiệu và cofactor phụ thuộc [33,34,89]

* Nhóm I (HDAC1, 2, 3, 8) (hình 1.3): tương đồng với Rdp3 ở tế bào nấm men S.cerevisiae, có chức năng ức chế phiên mã, chỉ hoạt động khi nằm trong phức hợp

protein [2,16] HDAC nhóm I có ở nấm men, động vật có vú và thực vật Ở động vật

có vú, các HDAC này được chia thành 2 phân nhóm là HDAC1/2 và HDAC3

Cấu trúc của HDAC1 và 2 khá tương đồng (82%) Vùng xúc tác nằm ở đầu N

tạo nên phần chính của protein Khi được tạo ra bằng kỹ thuật tái tổ hợp, HDAC1 và 2 không có hoạt tính chứng tỏ các cofactor là cần thiết cho hoạt động của HDAC HDAC1, 2 hoạt động khi nằm trong phức hợp như phức hợp SIN3, NuRD/NRD/Mi2

và CoREST Phosphoryl hóa serin trên HDAC1, 2 điều hòa hoạt động của chúng và tạo nên phức hợp với các cofactor khác [29,71]

HDAC3 được tìm thấy trong phức hợp với N-CoR (nuclear receptor copressor)

và phức hợp với SMRT (silencing mediator for retinoic acid and thyroid hormon receptors) HDAC3 có cùng cấu trúc vùng giống như các HDAC nhóm I Khoảng 68%

vùng các acid amin của HDAC3 đồng nhất với HDAC1, 2 Phần đuôi C không đảo

ngược của HDAC3 cần thiết cho cả hoạt tính deacetyl hóa và ức chế phiên mã [71]

HDAC8 không được xếp vào phân nhóm nào vì nó chủ yếu có ở động vật có xương sống HDAC8 có 37% tương đồng vùng các acid amin với HDAC3 Hoạt động của HDAC8 giảm khi phosphoryl hóa bởi protein kinase A, trong khi đó HDAC1, 2 lại hoạt động bởi sự phosphoryl hóa [30] HDAC8 là HDAC đầu tiên ở động vật có vú xác định được cấu trúc 3 chiều [74]

* Nhóm II gồm HDAC4, 5, 7, 9 (nhóm IIa) và HDAC6,10 (nhóm IIb) tương đồng với HDA1 trong tế bào nấm men (hình 1.3) HDAC nhóm II có kích thước phân tử lớn

(855-1122 aa) và khác biệt so với HDAC nhóm I do có đầu N tham gia vào quá trình

ức chế phiên mã Nhóm này chứa tín hiệu định vị ngoài nhân NES nên có thể di chuyển từ nhân ra bào tương và ngược lại

Hơn 70% vùng các acid amin của HDAC4, 5 tương đồng với nhau, còn HDAC7 chỉ tương đồng khoảng 57 - 58% với HDAC4, 5 Cả 3 HDAC này đều có

vùng xúc tác nằm ở đuôi C của protein Trong khi đó, HDAC9 lại có vùng xúc tác ở đầu N, giống như các HDAC nhóm I Các HDAC nhóm IIa có đầu N tương tác đặc

hiệu với yếu tố phiên mã MEF2 (myogenic transcription factor 2) Yếu tố này đóng vai trò quan trọng trong sự biệt hóa cơ Do vậy, các HDAC này khi kết hợp với MEF2 gây

ức chế chức năng phiên mã của MEF2, hệ quả là tế bào cơ không biệt hóa được Các HDAC này có thể bổ sung cho nhau để kiểm soát sự điều hòa biệt hóa của quá trình biểu hiện gen trong các giai đoạn khác nhau của sự biệt hóa trong tế bào cơ [71]

HDAC6 và 10 có vùng acid amin tương đồng khoảng 37% Điểm khác biệt của HDAC6 và 10 so với các HDAC khác là chúng có 2 vùng xúc tác, tuy nhiên HDAC10

có 1 vùng xúc tác bị bất hoạt Một đặc điểm riêng chỉ có ở HDAC6 là sự có mặt của

HUB (HDAC6-, USP3- và Brap2-related zinc finger motif) ở đuôi C Đặc điểm này là

dấu hiệu cho sự ubiquitin hóa và cho thấy HDAC này thiên về sự thoái hóa Nghiên

cứu in vitro và in vivo đã xác định HDAC6 liên quan chặt chẽ đến các bệnh thoái hóa

mô thần kinh như bệnh Parkinson, bệnh Hutington HDAC6 chủ yếu có ở bào tương, tuy nhiên nó còn được tìm thấy ở nhân trong phức hợp với HDAC11 HDAC10 có một

vùng xúc tác ở đầu N và vùng xúc tác bị bất hoạt ở đuôi C HDAC 10 có khả năng

tương tác với HDAC1, 2, 3, 4, 5, 7, nhưng không tương tác với HDAC6 và vẫn thể hiện hoạt tính deacetyl hóa khi không tạo phức HDAC6, 10 kháng lại trapoxin và butyrat natri tốt hơn các HDAC nhóm I, IIa [21,45,71]

* Nhóm III: (silent information regulator genes - Sirtuins), gồm SIRT1-7 tương tự

Sir2 ở tế bào nấm men HDAC nhóm III này không liên quan đến các nhóm khác, chúng có ở trong nhân (SIRT1,6,7), bào tương (SIRT2) hoặc ty thể (SIRT3,4,5) HDAC nhóm III ít được nghiên cứu ở người, nhưng đã được xác định có cơ chế hoạt động phụ thuộc vào cofactor NAD+, khác với HDAC nhóm I, II, IV (HDAC kinh điển) phụ thuộc Zn2+ và bị ức chế bởi các chất tạo phức chelat với Zn2+ [45,71,89]

* Nhóm IV: HDAC 11 (chỉ có ở người) Nghiên cứu hệ thống loài thấy rằng HDAC11 liên quan gần hơn với HDAC3, 8, nên có thể giả định HDAC11 liên quan mật thiết với

HDAC nhóm I hơn là nhóm II HDAC 11 có vùng xúc tác ở đầu N và có thể bị ức chế

bởi trapoxin (dẫn chất của TSA) HDAC11 chưa được tìm thấy trong các phức hợp HDAC đã biết để có thể xác định chức năng sinh học [45,71,89]

Hình 1.3 Phân loại HDAC ở người [21]

* Chú thích: Hình chữ nhật màu xanh dương là vùng xúc tác được bảo tồn của HDAC; N: nhân; C: bào tương; Mit: ty thể; Ac: acetyl hóa; P: phosphoryl hóa; S: sumoyl hóa; Ub: ubiquitin hóa N.D: chưa xác định

HDAC không chỉ điều hòa các protein histon mà rất nhiều protein không histon cũng bị ảnh hưởng bởi hoạt tính của các HDAC Thuật ngữ các chất ức chế HDAC để chỉ các chất có khả năng ức chế HDAC nhóm I, II và IV [45,89]

1.1.2.2 Cấu trúc của HDAC và cơ chế phản ứng deacetyl hóa

Việc xác định cấu trúc của HDAC rất cần thiết để xác định cơ chế tác dụng của HDAC, đồng thời dựa vào cấu trúc HDAC để thiết kế công thức cho các chất ức chế HDAC Phương pháp kết tinh tạo tinh thể và chụp tia X được áp dụng để tìm ra cấu trúc tinh thể của các HDAC khác nhau, đặc biệt là trung tâm hoạt động của nó HDAC8 là HDAC đầu tiên ở động vật có vú xác định được cấu trúc 3 chiều [74]

Hình 1.4 Cấu trúc HDAC8 ( ion Zn2+ biểu thị là hình tròn màu xanh lá) [86] Các HDAC đều có trung tâm hoạt động gồm 2 phần chính: ion Zn2+, kênh enzym dạng túi hình ống Bao quanh ion Zn2+ là 2 cặp acid amin Histidin-Aspartic (HDLP là His131-Asp166 và His132-Asp173, HDAC 8 là His142-Asp176 và His143-Asp183), một phân tử Tyrosin đóng vai trò cho proton (HDLP là Tyr297, HDAC8 là Tyr306) và 2 acid aspartic (HDLP là Asp258 và Asp168, HDAC8 là Asp178 và Asp267), một phân tử Histidin (HDLP là His170, HDAC8 là His180) [11]

- Ion Zn2+ là coenzym của HDAC, nằm ở đáy kênh enzym Trong phân tử HDAC, ion Zn2+ có thể tạo 5 liên kết phối trí: 4 liên kết với nguyên tử oxy, nitơ của các acid amin, 1 liên kết phối trí với nguyên tử oxy của nhóm acetyl của phân tử acetyl-lysin ở

phần đầu N của histon, từ đó xúc tác tách loại nhóm acetyl Khi có mặt các chất ức chế

HDAC như các acid hydroxamic, ion Zn2+ tạo 2 liên kết phối trí với 2 nguyên tử oxy của nhóm hydroxamic (hình 1.5) [11]

- Kênh enzym có dạng túi hình ống hẹp, tạo nhiều liên kết Van der Waals với cơ chất (lysin tận của histon/phần cầu nối của các chất ức chế HDAC) Túi được cấu tạo

từ các acid amin thân lipid: Phenylalanin, Tyrosin, Prolin, Histidin Đáy túi còn có 1 vài phân tử nước làm nhiệm vụ vận chuyển nhóm acetyl trong phản ứng deactyl hóa và tham gia tạo liên kết hydro khi không có mặt nhóm -OH của Tyrosin Cấu trúc túi rất linh động, có thể biến đổi để phù hợp với chiều dài của các cơ chất khác nhau Bề rộng của túi được giới hạn bởi 2 vòng thơm được tìm thấy trên cùng một vị trí ở nhiều HDAC khác nhau Trên miệng túi có 1 vành nhỏ được tạo nên từ 1 vài vòng xoắn protein (phần vành sẽ tương tác với nhóm nhận diện bề mặt của HDAC) [11]

Hình 1.5 Cấu trúc vị trí hoạt động của HDLP khi liên kết với phần acetyl-lysin của

histon (trái) và Trichostatin A (phải) [13]

Finnin là người đầu tiên nghiên cứu chi tiết tương tác giữa chất ức chế HDAC

và enzym HDAC năm 1999 [27] Nghiên cứu sử dụng HDLP (histone deacetylase like

protein), một chất đồng đẳng phân lập từ vi khuẩn Aquiflex aeolicus HDLP có vùng

acid amin tương đồng 30% với HDAC1 [11]

Hình 1.6 Cơ chế phản ứng deacetyl hóa theo Finnin [11,27]

Đầu tiên, nguyên tử oxy của nhóm carbonyl của phần N-acetyl lysin trên đầu N

của histon liên kết phối trí với Zn2+, làm nhóm carbonyl phân cực về phía oxy và

carbon trở nên ái điện tử hơn Một phân tử nước sẽ tạo liên kết phối trí với Zn2+ Nhờ

hệ thống chuyển tiếp Asp173 - His132 và Asp166 – His131, nguyên tử oxy của nước trở nên ái nhân hơn Sau khi được hoạt hóa, oxy của nước tấn công vào nguyên tử C của nhóm carbonyl tạo ra oxyanion tứ diện trung gian (oxy của nhóm carbonyl), được

ổn định bởi Tyr297 và Zn2+ Cuối cùng liên kết C-N bị bẻ gẫy, 1 proton được chuyển

từ His132 cho nguyên tử nitơ tạo thành acetat và lysin [11]

1.1.3 Mối liên quan giữa ung thư và sự bất thường hoạt động của HAT hoặc HDAC

Rất nhiều bệnh có nguyên nhân do sự biến đổi bất thường di truyền biểu hiện gen (epigenetic) cũng như đột biến gen, đặc biệt là bệnh ung thư

HAT acetyl hóa histon làm trung hòa cực dương trên lysin và giúp tháo xoắn cấu trúc của nucleosom, do đó giúp cho các nhân tố sao mã dễ dàng tiếp cận ADN Ngược lại, các HDAC xúc tác loại bỏ nhóm acetyl từ histon và protein không phải

histon, làm tăng sự tích điện dương trên đầu N của histon và đóng xoắn nhiễm sắc thể,

kết quả là ức chế quá trình phiên mã do ngăn cản các nhân tố sao mã tiến đến đích của chúng trên ADN Như vậy, sự acetyl hóa và deacetyl hóa nhiễm sắc thể đóng vai trò quan trọng trong điều hòa quá trình biểu hiện gen Việc mất cân bằng hoạt động giữa HAT và HDAC có thể dẫn đến những bất thường biểu hiện gen và do đó dẫn đến ung thư [21,40,45,56,63]

Hoạt động của HAT liên quan đến sự di chuyển, xâm lấn, sự biểu thị quá mức hoặc sự đột biến trong rất nhiều loại ung thư kể cả ung thư máu và ung thư biểu mô Hai HAT bị biến đổi rõ nhất trong một số bệnh ung thư do đột biến hoặc di chuyển là p300 và CBP Sự đột biến và cắt đoạn của p300 đã được chứng minh trong một số bệnh như u đệm thần kinh (glioblastommas), ung thư carcinoma gan (hepatocellular carcinomas), bệnh bạch cầu Hội chứng Rubinstein Taybi, có xu hướng phát triển thành ung thư, liên quan đến sự đột biến của CBP [31,70] Ngoài ra, CBP được tìm thấy ở dạng phối hợp với MOZ trong bệnh bạch cầu tủy bào cấp (AML)

Tương tự, các HDAC cũng được xác định bị rối loạn điều hòa trong ung thư Sự huy động bất thường của các HDAC vào chuỗi điều hòa của gen đích có thể xảy ra thông qua tương tác biến đổi của chúng với việc tăng cường vai trò của các protein gắn kết ADN gây ung thư Ví dụ như receptor RAR gắn kết gen PML (promyelocytic leukemia gene) hoặc PLZF (promyelocytic leukemia zinc finger) trong bệnh bạch cầu tiền tủy bào cấp (APL) Trong điều kiện sinh lý, RAR là nhân tố sao mã hoạt hóa acid retinoic giúp giải phóng phức hợp đồng ức chế chứa HDAC và làm gia tăng các

chất đồng hoạt hóa sao mã (bao gồm cả HAT) Điều này dẫn đến sự acetyl hóa histon

và ức chế gen đẩy mạnh sự biệt hóa tế bào Trong bệnh bạch cầu tiền tủy bào cấp (APL), protein gắn kết RAR/PML hoặc RAR/PLZF giữ HDAC và phối hợp với phức hợp đồng ức chế Do đó tăng methyl transferase histon và ADN, dẫn đến ngăn cản sự phiên mã [21,26,40] Do vậy, tế bào ung thư không trải qua giai đoạn biệt hóa

và phát triển quá mức Sự gia tăng bất thường của HDAC còn được quan sát khi gen đột biến gây ung thư Bcl6 được biểu thị quá mức trong bệnh u lympho tế bào B [9] Tương tự, protein gắn kết AML1-ETO tìm thấy trong bệnh bạch cầu tủy bào cấp (AML) có chức năng như chất ức chế sao mã chủ yếu thông qua ETO, do vậy có vai trò như vị trí gắn kết cho phức hợp đồng ức chế N-Cor/Sin3/HDAC1 Việc chuyển đổi AML1 từ chất hoạt hóa phiên mã thành chất ức chế được điều khiển bởi protein gắn kết CBFb-SMMHC thông qua sự gia tăng phức hợp đồng ức chế mSin3A/HDAC Cuối cùng, biểu thị quá mức nhân tố sao mã SCL/Tal1 trong bệnh u lympho tế bào T cấp có nguyên nhân là do gia tăng bất thường HDAC1 nằm trong phức hợp đồng ức chế, dẫn đến ngăn cản gen đích điều hòa E47/HEB [18] Biểu thị quá mức HDAC1 và/hoặc HDAC2 và/hoặc HDAC6 còn gặp trong một số bệnh ung thư tạng đặc như ung thư tiền liệt tuyến, ung thư dạ dày, trực tràng, ung thư vú và ung thư não [35,75,88] cũng như trong các bệnh lý ác tính về máu (bệnh bạch cầu tủy bào cấp, bạch cầu tế bào B, bệnh u lympho tế bào T ngoại vi, bệnh u lympho tế bào B và bệnh u lympho da tế bào T) [62] Hơn nữa, việc tìm ra các cơ chất của HDAC là các protein như p53, E2F, Rb, Bcl6, Gli1 liên quan đến xu hướng gây ung thư và tiến triển bệnh ung thư đã khẳng định vai trò của HDAC trong ung thư [16,59,61] Tóm lại, các biến đổi sau phiên mã của HDAC có thể làm thay đổi tương tác của chúng với phức hợp đồng ức chế mà các phức hợp này liên quan đến quá trình phiên mã của các gen gây ung thư

Như vậy, ức chế phiên mã được điều hòa bởi sự gia tăng HDAC và có thể kiểm soát ung thư bằng cách ức chế hoạt động của HDAC Đây chính là một trong mục tiêu phân tử hấp dẫn cho chiến lược điều trị ung thư Các chất ức chế HDAC đã và đang được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu nhằm tìm ra chất có tác dụng ức chế chọn lọc từng loại HDAC để ứng dụng trong điều trị ung thư

1.2 CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC (HDIs)

1.2.1 Phân loại

Năm 1990, Yoshida và cộng sự đã phát hiện ra dẫn chất hydroxamat tự nhiên đầu tiên có tác dụng ức chế trực tiếp HDAC là Trichostatin A (TSA), vốn là chất có

tác dụng chống nấm [91] Sau đó, dựa trên những hiểu biết về mối liên quan giữa HDAC và ung thư đồng thời xác định được cấu trúc 3D của các HDAC, một số chất

ức chế HDAC đã được nghiên cứu và thử nghiệm trên lâm sàng để ứng dụng trong điều trị ung thư Cho đến nay, nhiều chất ức chế HDAC (HDIs) đã được công bố Chúng có thể có nguồn gốc thiên nhiên hay tổng hợp hóa học FDA đã phê duyệt 2 chất ức chế HDAC được sử dụng trong điều trị u lympho da tế bào T là vorinostat (2006), và depsipeptid (2009) Đây chính là nguồn động lực thúc đẩy các nhà nghiên cứu tiếp tục tìm ra các chất ức chế HDAC mới

HDIs được chia thành 5 nhóm chính dựa trên cấu trúc hóa học: các acid hydroxamic, các peptid vòng, các acid béo, benzamid và các dẫn chất ceton (bảng 1.1)

Bảng 1.1 Phân loại các chất ức chế HDAC [22]

N

O

Oxamflatin

O NHOH H

S O O

O N

O HOHN

O

Acid sulfonamid hydroxamic Scriptaid

H 3 C

CH 3

O NH O

CH 3

CH 3

O HN

O

S S

H O

Các dẫn chất ceton

Trifluoromethyl

ceton

cetoamid

Alpha-Mỗi nhóm có những hạn chế riêng: các acid hydroxamic bị chuyển hóa nhanh

và ức chế không chọn lọc các HDAC; các benzamid và các acid béo có hiệu lực hạn chế; dẫn chất ceton bị khử hóa trong huyết tương; trong khi các peptid vòng có cấu trúc quá phức tạp [41]

1.2.2 Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC

Các chất ức chế HDAC có tác dụng chống ung thư do tác động lên nhiều giai đoạn quan trọng của chu trình tế bào làm mất sự điều hòa trong tế bào ác tính Trong

đó, yếu tố then chốt quyết định hoạt tính chống ung thư của HDIs là thúc đẩy sự biệt hóa, ức chế chu trình tế bào và thúc đẩy sự chết tế bào Ngoài ra, hoạt hóa đáp ứng miễn dịch và ức chế sự tạo mạch cũng là vai trò rất quan trọng của HDIs, gián tiếp ức

chế sự phát triển in vivo của khối u (hình 1.7) [3,40]

Hình 1.7 Điều hòa sự phát triển và sống sót của tế bào bởi các chất ức chế HDAC

[40]

* Các chất ức chế HDAC thúc đẩy sự biệt hóa

Khi sử dụng đơn độc, các chất ức chế HDAC thúc đẩy biệt hóa và ngừng tăng sinh tế bào ở các bệnh bạch cầu và các khối u tạng đặc Ức chế chu trình tế bào là việc cần thiết trong sự biệt hóa tế bào Phân tích các kiểu chu trình tế bào của tế bào ung thư đã được tiếp xúc với các chất ức chế HDAC cho thấy các tế bào thường bị ngừng lại ở pha G1, nhưng đôi khi lại tích tụ trong tế bào đến pha G2 của chu trình tế bào

(hình 1.7) [40,57]

Ví dụ trong bệnh bạch cầu tiền tủy bào cấp (APL), các chất ức chế HDAC có

thể hiệp đồng tác dụng với acid retinoic để thúc dẩy sự biệt hóa in vitro và in vivo của

protein gây ung thư PLZF-RAR Sự biệt hóa tế bào tủy phụ thuộc vào RARα (receptor acid retinoic) hoạt hóa quá trình phiên mã và các protein gây ung thư PLZF–RARα cản trở chương trình biệt hóa bình thường Quá trình tương tự có thể xảy ra trong bệnh bạch cầu tủy bào cấp (AML) Các chất ức chế HDAC ức chế chức năng của các protein gắn kết AML1-ETO và TEL-AML1, khôi phục sự nhạy cảm của các tế bào

ác tính với acid retinoic Ngoài ra, các chất ức chế HDAC có thể gây biệt hóa nhiều loại tế bào, nhưng quá trình này vẫn chưa được biết rõ [40]

Hầu hết các chất ức chế HDAC có khả năng hoạt hóa quá trình phiên mã gây ra bởi chất ức chế kinase phụ thuộc cyclin (cyclin-dependent kinase inhibitor), là WAF1 (còn gọi là CIP1, p21; được mã hóa bởi vị trí gen CDKN1A) WAF1 có thể ức chế cyclin E-CDK2 và cyclin A-CDK2 Sự có mặt của CDKN1A cần thiết cho các chất ức chế HDAC thúc đẩy sự ngừng ở pha G1 Sự tiếp xúc của các tế bào thiếu hụt CDKN1A với các chất ức chế HDAC dẫn đến tích tụ các tế bào có ADN đa bội và làm cho các tế bào này nhạy cảm với sự chết tế bào Sự phối hợp hoạt động của các cyclin, các CDK (cyclin-dependent kinase), những chất ức chế CDK và các thành viên RB (retinoblastoma protein) rất cần thiết cho sự biệt hóa của nhiều hệ thống [40]

Sau khi tiếp xúc với HDIs, thông thường các tế bào ung thư dừng lại ở pha G1

để sao chép ADN, sau đó đi vào sự chết tế bào Nhưng một số tế bào ung thư lại tích tụ đến điểm kiểm soát G2 (G2 checkpoint), vị trí mà tại đó chu trình tế bào tạm thời dừng lại, chờ đến khi các điều kiện trở nên phù hợp thì chu trình lại tiếp tục Những tế bào bình thường trải qua điểm kiểm soát G2 (G2 checkpoint) và tiếp tục phát triển, trong khi đó những tế bào ung thư tái tạo ADN thành dạng ADN đa bội (4nADN) và chuyển sang giai đoạn gây chết tế bào theo chương trình Tuy nhiên, cơ chế phân tử để chất ức chế HDAC thúc đẩy G2 checkpoint vẫn còn chưa sáng tỏ Có thể trong một số tế bào, HDIs thúc đẩy trực tiếp hoặc gián tiếp gen hoạt hóa điểm kiểm soát G2 (G2 checkpoint) [40]

* Các chất ức chế HDAC gián tiếp gây ra sự chết tế bào theo chương trình

Các tế bào ung thư khác nhau sau khi được tiếp xúc in vitro với các chất ức chế

HDAC có thể dẫn đến sự chết tế bào theo chương trình Sự chết tế bào là một chương trình chết sinh lý của tế bào để kiểm soát số lượng các tế bào bình thường trong suốt quá trình phát triển và bệnh tật Hiện nay đã xác định được hai con đường gây chết tế bào và cả hai con đường đều có sự tham gia của các enzym cystein protease (các caspase) (hình 1.8) [33,40]

Con đường thứ nhất được hoạt hóa bởi các receptor gọi là các “death-receptor” như CD95, receptor TNF (tumour-necrosis factor) và receptor TRAIL (TNF-related

apoptosis-inducing ligand) Các yếu tố này sau khi gắn với các phối tử bắt đầu hoạt hóa các caspase gần màng tế bào (caspase-8 và -10) Các caspase này sau đó sẽ hoạt hóa các caspase kích thích (caspase-3 và -7) và dẫn đến sự chết tế bào

Con đường thứ hai cần có sự phá vỡ màng ty thể, gián tiếp giải phóng cytochrom c, các protein hỗ trợ sự chết tế bào khác (như SMAC/DIABLO (the second mitochondria-derived activator of caspase), HTRA2 (high temperature requirement 2)

và yếu tố thúc đẩy sự chết tế bào (AIF)) và sự hoạt hóa caspase-9 thông qua yếu tố hoạt hóa protease gây chết tế bào (APAF1) Sự toàn vẹn của màng ty thể được kiểm soát bởi các protein trong họ protein BCL2 (bao gồm các protein hỗ trợ sự chết tế bào (BAX, BAK) và các protein kháng lại sự chết tế bào (BCL2, BCL-XL) [33,40]

Hình 1.8 Các chất ức chế HDAC thúc đẩy sự chết tế bào [40]

* Chú thích: thành phần ức chế sự chết tế bào có màu vàng, thành phần đẩy mạnh sự chết tế bào có màu tím

Các chất ức chế HDAC được ghi nhận có khả năng hoạt hóa cả receptor gây chết tế bào và quá trình chết tế bào nội sinh (hình 1.8) Ví dụ, apicidin và CBHA có thể kích thích biểu hiện của CD95 và gốc kết hợp CD95 (CD95L) Tuy nhiên, butyrat làm cho tế bào nhạy cảm với sự chết tế bào gián tiếp bởi CD95 mà không thúc đẩy sự phiên mã của gốc kết hợp hay receptor Depsipeptid ức chế sự biểu hiện CD95L sau khi hoạt hóa tế bào T và ngăn cản sự chết tế bào T sau đó Vì vậy, quá trình death-

receptor có thể quan trọng cho sự chết tế bào gây ra bởi các chất ức chế HDAC, phụ thuộc vào loại tế bào và nhóm chất ức chế HDAC được sử dụng

Việc biểu hiện quá mức của BCL2 (yếu tố ngăn cản quá trình chết tế bào nội sinh) trong khi quá trình death-receptor còn nguyên vẹn cùng với khả năng ức chế sự chết tế bào gián tiếp bởi các chất ức chế HDAC cho thấy tầm quan trọng của các quá trình nội sinh đối với vai trò của các chất ức chế HDAC Những dữ kiện này được chứng minh bằng việc phát hiện ra sự chết tế bào do các chất ức chế HDAC trùng khớp với sự tăng cường các protein BCL2 hỗ trợ sự chết tế bào (BAX, BAK) và sự giảm các protein họ BCL2 kháng lại sự chết tế bào (BCL2, BCL-XL) [40] Các chất ức chế HDAC có thể vẫn gây ra sự chết tế bào không kèm theo hoạt hóa caspase SAHA hoạt hóa quá trình chết tế bào nội sinh bằng cách thúc đẩy bẻ gãy liên kết và hoạt hóa chất chủ vận sự chết tế bào tương tác với BH3 (BID), dẫn đến phá vỡ màng ty thể và tạo thành các dạng oxy hoạt động (ROS) Ngược lại, các chất ức chế ROS ngăn cản sự

mã, những phân tử đồng kích thích CD40, CD80 và CD86, phân tử gắn vào khoảng gian bào ICAM1, và các interferon loại I và II, nhằm làm tăng sự nhận dạng và hoạt hóa của các tế bào miễn dịch (hình 1.7) [40] Hơn nữa, sự phát triển và sống sót của ung thư tạng đặc phát triển nhanh đòi hỏi sự hình thành mạch trong khối u để duy trì cung cấp liên tục oxy và chất dinh dưỡng Trichostatin A (TSA) có thể ức chế sự biểu hiện giảm oxy mô của yếu tố phát triển màng trong mạch máu (VEGF) và ngăn cản sự

tạo mạch cả in vitro và in vivo Vì vậy, tăng cường đáp ứng miễn dịch và ức chế sự tạo

mạch của khối u có thể ngăn cản rõ rệt sự phát triển khối u ban đầu và sự di căn [40]

1.2.3 Cấu trúc của các chất ức chế HDAC

Các HDIs được chia thành nhiều nhóm khác nhau nhưng có một số đặc điểm chung về mặt cấu trúc, bao gồm 3 phần chính [3,6,17,58]:

- Nhóm gắn với ion Zn2+ (A - Zinc Binding Group, ZBG): như acid hydroxamic, thiol, nhóm o-aminoanilin của benzamid, -cetoester, ceton thân dầu quyết định tính đặc hiệu và hiệu lực của HDIs

- Vùng cầu nối sơ nước (B): thường là mạch hydrocarbon thân dầu có thể tạo nhiều

liên kết Van der Waals với kênh enzym

- Nhóm khóa hoạt động (capping group) hay vùng nhận diện bề mặt (C): thường là các aryl hoặc 1 số vòng khác, nằm trên bề mặt enzym

Hình 1.9 Công thức cổ điển của HDI và vị trí của HDI trong túi enzym HDAC

Cấu trúc tinh thể kết tinh của các HDAC liên kết với 1 số chất ức chế HDAC cho thấy phần A, B và 1 phần của C nằm trong túi enzym, làm đầy khoảng trống trong lòng kênh enzym Phần còn lại của C tương tác với phần vành trên bề mặt miệng túi enzym Nhóm nhận diện bề mặt C có thể liên kết với phần cầu nối thông qua 1 số liên kết peptid, làm tăng khả năng phân cực và góp phần cải thiện dược động học cho HDIs Việc nghiên cứu thiết kế công thức cho các HDIs mới đều dựa trên cấu trúc cổ điển này

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VỀ CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC

Việc phát hiện tác dụng làm giảm sự biệt hóa tế bào trong bệnh bạch cầu Friend

và ức chế chu trình tế bào bình thường ở cả pha G1 và G2 của TSA đã mở ra một hướng nghiên cứu trong con đường tìm thuốc mới điều trị ung thư [91] Từ những năm

90 của thế kỷ trước, rất nhiều nhà khoa học trên thế giới đã tập trung nghiên cứu và hàng trăm bài báo đã được công bố trong quá trình tìm kiếm các chất ức chế HDAC Cho đến nay, bên cạnh 2 chất là vorinostat (Zolinza®) và depsipeptid (Romidepsin®)

đã được FDA phê duyệt sử dụng trong điều trị u lympho da tế bào T, còn có khoảng hơn 10 chất đang được nghiên cứu ở pha lâm sàng I, II (bảng 1.2) Ở Việt Nam, vẫn chưa có nhà khoa học nào quan tâm đến thiết kế, tổng hợp các chất ức chế HDAC ngoài các công bố mà nhóm nghiên cứu của chúng tôi đang tiến hành

C

Bảng 1.2 Các chất ức chế HDAC đã và đang được thử lâm sàng [56]

Tạng đặc, NSCLC, tế bào thận, tuỵ

Tạng đặc, ung thư bạch cầu, MDS

Acid béo mạch

ngắn

Butyrat AN-9 (tiền thuốc) Acid valproic Phenyl butyrat

Acid

hydroxamic

SAHA

PXD101 NVP-LAQ824 LBH-589 ITF-2357 SB-939 CRA 024781

Tạng đặc, ung thư máu

Tạng đặc, AML, ALL, MDS

U lympho Hodgkin Tạng đặc, ung thư máu

* Chú thích: NSCLC, carcinom tế bào phổi không nhỏ; AML, ung thư bạch cầu tủy bào cấp; MDS, hội chứng loạn sản tủy; CTCL, u lympho da tế bào T; ALL, ung thư bạch cầu cấp; CLL, ung thư bạch cầu mãn

1.3.1 Các peptid vòng

Đây là nhóm các chất có cấu trúc phức tạp nhất trong HDIs, tác dụng ức chế HDAC mạnh tương tự như các acid hydroxamic gồm: Depsipeptid (FK-228), apicidin, trapoxin A và các CHAP (cyclic hydroxamic acid-containing peptide) (hình 1.10)

Đa số các chất trong nhóm này có tác dụng ức chế HDAC ở nồng độ nanomol

Depsipeptid là polypeptid tự nhiên được phân lập từ nấm Chromobacterium violaceum

và là chất ức chế HDAC thứ 2 được FDA phê duyệt trong điều trị u lympho da tế bào

T (tháng 11/2009) Cấu trúc của depsipeptid khá phức tạp với 4 liên kết peptid Depsipeptid là tiền thuốc, khi vào cơ thể được khử hóa tạo ra nhóm sulfydryl của redFK có tác dụng tốt với HDAC nhóm I, đặc biệt HDAC1, 2 Nhóm -SH của redFK

có thể phản ứng với cystein tận trong túi enzym tạo liên kết cộng hóa trị disulfid Tính

ổn định và kỵ nước của FK228 giúp cho nó dễ dàng qua được màng tế bào, do đó tác dụng hiệu quả hơn các HDIs khác [45]

Các CHAP là sản phẩm kết hợp peptid vòng và acid hydroxamic Trong cấu trúc của chúng, chuỗi acid hydroxamic được gắn với vòng peptid thay cho nhóm epoxyketon trong trapoxin hay các hợp chất từ thiên nhiên khác Một số hợp chất được tổng hợp bằng cách thay đổi số lượng acid amin trong cấu trúc vòng, sự không đối xứng của các acid amin và chiều dài chuỗi hydroxamic Trong số đó, CHAP31 có tác dụng tốt nhất (ức chế HDAC1 với IC50 = 3,32 nM), và bền hơn TSA trong tế bào (t1/2

dài hơn) [63]

Hình 1.10 HDIs có cấu trúc peptid vòng 1.3.2 Dẫn chất benzamid

Dẫn chất benzamid có tác dụng ức chế HDAC in vitro và in vivo được công bố

năm 1999 bởi Suzuki và cộng sự thuộc công ty dược Mitsui [63] Nhóm này bao gồm một số chất MS-275, CI-994, MGCD-103 (hình 1.11), chúng có hoạt tính kém hơn các

acid hydroxamic và các peptid vòng, ức chế HDAC ở nồng độ micromol [39]

Hình 1.11 HDIs là các benzamid MS-275 và CI-994 đang được thử nghiệm lâm sàng ở pha 2 MS-275 làm giảm

sự acetyl hóa quá mức của histon trong nhiều loại ung thư, giảm sự biểu thị quá mức của p21WAF1/CIP1 và gelsolin CI-994 là 4-acetylamino-N-(2’-aminophenyl)benzamid,

đã được chứng minh có tác dụng trên tế bào ung thư ở người và chuột Nghiên cứu in

vitro cho thấy CI-994 có tác dụng thúc đẩy sự chết tế bào theo chương trình trên các tế

bào lympho chuột Ưu điểm lớn của CI-994 là thuốc chống phân bào đường uống [32] 1.3.3 Các acid béo mạch ngắn

Các acid béo mạch ngắn như acid valproic, natri butyrat, phenylbutyrat (hình 1.12) đã được dùng trong lâm sàng từ rất lâu (acid valproic là thuốc điều trị động kinh) Gần đây, tác dụng ức chế HDAC của chúng mới được nghiên cứu Acid butyric là sản phẩm tự nhiên được tổng hợp trong cơ thể người do chuyển hóa acid béo và vi khuẩn lên men chất xơ ở đại tràng Nghiên cứu các chất ức chế HDAC nhóm này đòi hỏi sự cẩn trọng do chúng có thể điều hòa quá trình biểu hiện gen theo các cách vô cùng tinh

vi Thêm vào đó, nhược điểm lớn của các chất này là đáp ứng hạn chế trên lâm sàng do thời gian bán thải ngắn và nồng độ để đạt được tác dụng cao (ở mức nồng độ milimol

so với TSA là nanomol) [40,71]

Hình 1.12 HDIs là các acid béo mạch ngắn

1.3.5 Các hydroxamat và dẫn chất

Acid hydroxamic là nhóm chất ức chế HDAC được nghiên cứu rộng rãi nhất, với nồng độ ức chế nằm trong khoảng micromol đến nanomol

Trichostatin A (TSA) là chất đầu tiên được phân lập từ Streptomyces

hygroscopicus với tác dụng chống nấm bởi Tsuji và cộng sự năm 1976 (hình 1.14)

Mười năm sau đó, Morioka và cộng sự cùng Yoshida và cộng sự đã chứng minh tác dụng rất tốt của TSA trong việc làm giảm sự biệt hóa tế bào trong bệnh bạch cầu Friend và ức chế chu trình tế bào bình thường ở cả pha G1 và G2 [91] Tuy nhiên,

nghiên cứu sâu hơn cho thấy chỉ cấu trúc (R)-TSA có tác dụng ức chế sự phát triển của

chu trình tế bào, giảm sự biệt hóa và sự biến đổi của histon trên chuột có tế bào ung

thư tuyến vú FM3A TSA có tác dụng ức chế mạnh, đặc hiệu với HDAC (K i = 3,4nM)

và thử nghiệm in vivo trên chu trình phát triển và biệt hóa tế bào khẳng định chắc chắn

tác dụng ức chế enzym này [63] Nghiên cứu gần đây xác định TSA giống như ligand của receptor  hoạt hóa sản sinh peroxisome (troglitazon và BRL46593) và của

receptor retinoid X (LG268), có thể điều hòa sự biểu hiện của gen Drg-1 Do đó, TSA

đóng vai trò như chất ngăn cản sự di căn trong ung thư đại tràng Việc sản xuất TSA rất tốn kém mà lại không hiệu quả (trải qua 20 bước và hiệu suất 2%) nên nghiên cứu tìm ra các chất ức chế HDAC thay thế TSA đã và đang được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm Hiện nay, TSA chủ yếu dùng làm chất đối chiếu trong nghiên cứu tìm ra các chất ức chế HDAC mới [71]

Một chất ức chế HDAC tổng hợp là acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA) (hình 1.14) đã được nghiên cứu Báo cáo cho thấy SAHA ức chế sự phát triển tế bào, dẫn đến kết thúc sự biệt hoá và ngăn ngừa hình thành khối u trên chuột Năm 2006, sau khi trải qua các pha trong tiến trình thử nghiệm lâm sàng, SAHA (Vorinostat, Zolinza) đã được FDA phê duyệt sử dụng trong điều trị u lympho da tế bào T SAHA

đã được chứng minh nhạy cảm với các dòng tế bào Hut78, HH, M và nhạy cảm với tế bào lympho máu ngoại vi nguyên phát ở bệnh nhân u lympho da tế bào T [92] SAHA làm tăng sự acetyl hoá của các histon H2B, H3 và H4, đồng thời làm tăng sự biểu thị của p21 và Bax trong khi đó lại làm giảm sự biểu thị của STAT6 và làm giảm mức độ của STAT6 phospho Tất cả các ảnh hưởng đó dẫn đến hoạt hoá caspase 3, sự phân chia của PARP và sự chết tế bào theo chương trình Hiện nay, Zolinza đang tiếp tục được thử nghiệm lâm sàng ở dạng phối hợp với các hoá trị liệu khác như tamoxifen, bortezomib, temozolomid

Bên cạnh đó, nhiều chất ức chế HDAC dẫn chất acid hydroxamic đang được nghiên cứu rộng rãi và được chia thành nhiều phân nhóm nhỏ: acid hydroxamic mạch thẳng, dẫn chất cinnamic (CBHA, LAQ 824, LBH 589, PXD101), dẫn chất phenyl (hình 1.14) Đặc điểm chung của nhóm này là nhóm chức acid hydroxamic dễ tạo phức với ion Zn2+ của HDAC nên ức chế không chọn lọc cả HDAC nhóm I, II và

bị chuyển hóa nhanh [58,89]

Hình 1.14 HDIs có cấu trúc hydroxamat Như trên đã đề cập đến, các acid hydroxamic có hiệu lực ức chế HDAC tốt

song chúng có nhược điểm là ức chế không chọn lọc và nửa đời in vivo ngắn Chính vì

vậy, rất nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới đang nỗ lực tìm kiếm các dẫn chất mới dựa trên phiên mẫu của TSA, SAHA và các chất đã tìm được Dựa trên đặc điểm cấu trúc của các chất ức chế HDAC (mục 1.2.3), các nghiên cứu có thể tiến hành thay đổi