T: ITMS +c ESI Full ms [55.00-500.00]
4.3.HOẠT TÍNH SINH HỌC
Dựa trờn cấu trỳc của acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA) (một chất ức chế HDAC tổng hợp húa học toàn phần) (hỡnh 4.15), 51 dẫn chất acid hydroxamic của luận ỏn được thiết kế với đớch tỏc dụng hướng ức chế HDAC, từ đú ức chế chu trỡnh tế bào, kết thỳc sự biệt húa, thỳc đẩy sự chết tế bào và dẫn đến tiờu diệt hoặc ngăn ngừa hỡnh thành khối u. SAHA đó được nhúm nghiờn cứu của Paul A. Marks thuộc trung tõm ung thư Memorial Sloan-Kettering (Mỹ) sàng lọc từ 600 hợp chất lai húa với vai trũ thỳc đẩy sự biệt húa của tế bào trong bệnh tăng hồng cầu, bạch cầu trờn chuột [57]. Nhờ sự phỏt hiện của Victoria Richon về sự tương đồng cấu trỳc của SAHA với trichostatin A (chất ức chế đầu tiờn HDAC phõn lập từ tự nhiờn) (hỡnh 4.15), SAHA được tiếp tục nghiờn cứu với đớch tỏc dụng là HDAC. Và năm 2006, sau khi trải qua cỏc giai đoạn trong tiến trỡnh thử nghiệm lõm sàng, SAHA (Vorinostat, Zolinza) đó được FDA cấp phộp dựng trong điều trị u lympho da tế bào T [57].
NHOHH H N N O O O NHOH O SAHA TSA
Nhóm khóa hoạ t động Cầu nối Nhóm gắn ion Zn2+
Hỡnh 4.15. Cấu trỳc của TSA và SAHA 4.3.1. Cỏc acid hydroxamic mang khung benzothiazol
Từ cấu trỳc của SAHA và qua tham khảo nhiều bài bỏo, lựa chọn tổng hợp dóy dẫn chất đầu tiờn cú cấu trỳc: nhõn phenyl được thay bằng vũng benzothiazol, giữ nguyờn liờn kết amid đúng vai trũ nối vựng nhận diện bề mặt với mạch alkyl. Tuy nhiờn, do nhúm khúa hoạt động thay đổi nờn phải khảo sỏt xỏc định độ dài thớch hợp của phần cầu nối để đưa nhúm gắn kết Zn (ZBG) tương tỏc với ion Zn2+ ở trung tõm hoạt động nằm ở đỏy của kờnh enzym, từ đú tỡm ra chất cú tỏc dụng ức chế HDAC mạnh. Lựa chọn độ dài cầu nối đầu tiờn là 2 carbon (dóy 3a-f, hỡnh 4.16).
Hỡnh 4.16. Cụng thức cấu tạo của cỏc acid hydroxamic 3a-f
Kết quả phõn tớch Western blot để xỏc định khả năng ức chế HDAC ở nồng độ 10 g/ml cho thấy cỏc acid hydroxamic 3a-f khụng cú tỏc dụng (bảng 3.14), đồng thời cũng khụng gõy độc trờn dũng tế bào SW620 thử nghiệm. Như vậy, cú lẽ mạch 2 carbon cũn ngắn, chưa đưa được nhúm ZBG tiến gần đến ion Zn2+ ở trung tõm hoạt động của enzym.
Tăng độ dài cầu nối thành 3, 4 carbon thu được cỏc dẫn chất 5a-f, 7a-f (hỡnh 4.17).
Hỡnh 4.17. Cỏc acid hydroxamic 5a-f, 7a-f
Về tỏc dụng ức chế HDAC bằng Western blot, kết quả cho thấy cỏc chất 7a-d cú cầu nối 4C đó cú tỏc dụng ở nồng độ 10 g/ml. Từ hỡnh ảnh kết quả điện di trờn gel (hỡnh 4.18), vết đậm của 7a-d biểu thị sự cú mặt của acetyl-histon H3 và acetyl-histon H4 chứng tỏ cỏc chất này đó ức chế được HDAC3, 4 nờn cỏc histon khụng bị deacetyl húa. Với chất 7e, 7f, kết quả cho thấy histon H3, H4 đó bị deacetyl húa nờn khụng cũn vết của protein trờn hỡnh ảnh điện di.
Hỡnh 4.18. Kết quả phõn tớch Western blot của cỏc chất 7a-f
Acetyl-histon-H3 Acetyl-histon-H4 GAPDH 17kDa 11kDa 37kDa Blk 7a 7b 7c 7d 7e 7f
Đối với hoạt tớnh khỏng dũng tế bào ung thư người, cỏc acid benzothiazol- hydroxamic cầu nối 3C đó bắt đầu cú hoạt tớnh nhưng cũn yếu. Thử nghiệm trờn dũng tế bào SW620, chất 5b, 5c và 5d đó ức chế sự phỏt triển tế bào với IC50 khoảng 18,96 – 20,65 g/ml (bảng 3.16). Với cỏc chất cầu nối 4C, độc tớnh tế bào đó được cải thiện. Cỏc chất 7a-d cú tỏc dụng ức chế trờn cả 5 dũng tế bào, đặc biệt với 2 dũng SW620 và MCF-7, giỏ trị IC50 đó giảm xuống cũn khoảng 4,02- 9,26 g/ml. Trờn dũng PC-3, hai chất 7b, 7d ức chế sự phỏt triển tế bào với IC50 = 6,23 g/ml (7b) và IC50 = 6,69 g/ml (7d). Với 2 dũng tế bào AsPC-1 và NCI-H460, cỏc chất đều cú giỏ trị IC50 cao
hơn 10 g/ml, trừ chất 7d cú tỏc dụng với IC50 = 7,96 g/ml (bảng 4.4). Như vậy, 4
chất 7a-d cú ức chế HDAC bằng thử nghiệm Western blot, đồng thời ức chế sự phỏt triển của cả 5 dũng tế bào thử nghiệm. Từ mối tương quan này cú thể đưa ra nhận xột bước đầu rằng cơ chế gõy độc tế bào của cỏc acid benzothiazol –hydroxamic này là do ức chế HDAC.
Bảng 4.4. Tỏc dụng ức chế HDAC và độc tớnh tế bào in vitro của cỏc chất 7a-f
Chất HDAC Dũng tế bào (IC50 g/ml)
10 g/ml 1 g/ml SW620 MCF-7 PC-3 AsPC-1 NCI-H460 7a + - 7,85 4,02 12,51 10,19 14,41 7b + - 4,69 4,27 6,23 13,33 10,97 7c + - 9,07 5,91 15,29 23,93 21,41 7d + - 9,26 8,72 6,69 16,7 7,96 7e - - >30 >30 >30 >30 >30 7f - - >30 >30 >30 >30 >30
Tiếp tục kộo dài mạch carbon thành 6C (cầu nối tương tự SAHA), tổng hợp được 8 dẫn chất 9a-h (hỡnh 4.19).
Hỡnh 4.19. Cấu trỳc cỏc acid hydroxamic 9a-h
Cỏc dẫn chất này cú tỏc dụng ức chế HDAC mạnh hơn. Ở nồng độ 1 g/ml, hầu hết cỏc chất đều thể hiện tỏc dụng, minh họa bằng hỡnh ảnh điện di trờn gel của 6 chất 9a-f (hỡnh 4.20).
Hỡnh 4.20. Kết quả phõn tớch Western blot của cỏc chất 9a-f
Từ kết quả sàng lọc Western blot, cỏc chất 9a-h được định lượng tỏc dụng ức chế HDAC2 (bảng 4.5).
Bảng 4.5. Tỏc dụng ức chế HDAC và độc tớnh tế bào in vitro của cỏc chất 9a-h
Chất HDAC (1àg/ml) HDAC2 (IC50àg/ml) Dũng tế bào (IC50 g/ml) SW620 MCF-7 PC-3 AsPC-1 NCI-H460 9a + 0,013 4,01 6,61 5,44 5,69 5,71 9b + 0,036 0,56 1,60 0,53 0,54 0,84 9c + 0,039 0,96 1,85 1,56 0,79 1,25 9d - 0,159 10,43 11,61 16,89 9,88 6,58 9e - 0,120 5,42 15,35 5,69 13,52 6,54 9f + 0,009 0,29 3,83 1,28 1,65 1,90 9g + 0,050 0,32 1,45 0,82 0,34 0,39 9h + 0,262 0,35 0,78 2,91 2,20 1,28 SAHA + 0,530 0,50 0,13 0,94 0,69 0,68
Kết quả phõn tớch Western blot cho thấy tỏc dụng ức chế HDAC phụ thuộc vào độ dài cầu nối. Cỏc chất chứa vũng benzothiazol với mạch alkyl 2 - 3 nhúm methylen (3a, 5a) khụng cú tỏc dụng ức chế HDAC. Nhưng khi mạch alkyl tăng thành 4 nhúm methylen, chất 7a đó bắt đầu cú tỏc dụng trờn HDAC nhưng cũn yếu (nồng độ 10 àg/ml). Phần cầu nối cú 6 nhúm methylen cho hoạt tớnh tốt nhất trờn HDAC thể hiện ở chất 9a tỏc dụng ở nồng độ 1 àg/ml và ức chế HDAC2 với IC50 = 0,013 àg/ml. Như vậy, kết quả bước đầu này cho thấy khi thay đổi nhúm nhận diện bề mặt là vũng benzothiazol thỡ độ dài cầu nối cú 6 carbon là tối ưu. Điều này cũng hoàn toàn phự hợp với một số nghiờn cứu trước đõy về độ dài cầu nối của cỏc hydroxamat tương tự SAHA [6,17]. Quan trọng hơn, kết quả ức chế HDAC2 cũn cho thấy sự cú mặt của
Acetyl-histone-H3 Acetyl-histone-H4 GAPDH Trắng 9a 9b 9c 9d 9e 9f 17kDa 11kDa SAHA
vũng benzothiazol cho tỏc dụng tốt hơn. Cả 8 chất 9a-h ức chế HDAC2 với IC50 = 0,013 – 0,262 àg/ml, cao hơn cả SAHA (IC50 = 0,530 àg/ml).
Năm 2008, Chen P.C và cộng sự [17] khi nghiờn cứu thay đổi nhúm amid (cú vai trũ nối nhúm khúa hoạt động với mạch alkyl) bằng vũng 1,2,3-triazol cũng nhận thấy phần cầu nối cú độ dài 5 - 6 nhúm methylen là hợp lý (hỡnh 4.21).
Hỡnh 4.21. Tổng hợp cỏc aryltriazolylhydroxamat 27a-d [17]
Kết quả thử độc tớnh tế bào in vitro cũng khỏ tương đồng với tỏc dụng ức chế (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
HDAC. Chất 9a khụng cú nhúm thế trờn vũng benzothiazol ức chế sự phỏt triển của 5 dũng tế bào với giỏ trị IC50 cũn khỏc cao 4,01 - 6,61 àg/ml. Nhưng khi gắn nhúm thế vào vị trớ số 6 trờn vũng benzothiazol, hoạt tớnh trờn tế bào tăng lờn rừ rệt. Cỏc chất cú gắn nhúm thế đẩy điện tử như -CH3, -OCH3 cho tỏc dụng ức chế sự phỏt triển của 5 dũng tế bào mạnh hơn hẳn so với chất 9a (khụng nhúm thế). Trong đú, chất 9b (nhúm thế 6-CH3) cho giỏ trị IC50 trờn 4 dũng tế bào tương đương SAHA, trừ dũng MCF-7 thỡ tỏc dụng yếu hơn (SAHA mạnh hơn khoảng 11 lần) (bảng 4.5). Chất 9g gắn nhúm thế 6-Cl cho hoạt tớnh mạnh nhất. Trờn 3 dũng tế bào SW620, AsPC-1 và NCI-H460, 9g cú tỏc dụng mạnh gần gấp đụi so với SAHA, thể hiện ở giỏ trị IC50 = 0,32; 0,34; 0,39 àg/ml (tương ứng với từng dũng tế bào) so với của SAHA là IC50 = 0,50; 0,69; 0,68 àg/ml. Với dũng PC-3, tỏc dụng gần tương đương nhau với IC50 (9g) = 0,82 àg/ml và IC50 (SAHA) = 0,94 àg/ml. Tuy nhiờn, cũng giống như chất 9b, đối với dũng MCF-7, SAHA ức chế sự phỏt triển tế bào mạnh gấp 10 lần chất 9g. Nhỡn lại bảng độc tớnh tế bào nhận thấy tất cả 8 chất đều tỏc dụng trờn MCF-7 yếu hơn SAHA từ 6 lần trở lờn. Cú lẽ là do dũng tế bào MCF-7 nhạy cảm hơn với SAHA. Bờn cạnh đú, chất cú nhúm thế hỳt điện tử như 9f (nhúm -NO2) cũng cho hoạt tớnh khỏ tốt trờn cỏc dũng tế bào, đặc biệt trờn dũng SW620, 9f tỏc dụng mạnh hơn cả SAHA. Tuy nhiờn, một chất cú nhúm hỳt điện tử khỏc là –SO2CH3 (9e) và một chất cú nhúm đẩy điện tử -OC2H5 (9d) cho kết quả õm tớnh trờn thử nghiệm Western blot, độc tớnh trờn 5 dũng tế bào cũng rất kộm. Hoạt tớnh ức chế sự phỏt triển tế bào của 2 chất này yếu hơn cả 9a là chất khụng gắn nhúm thế. Như vậy, việc gắn cỏc nhúm thế nhỏ, gọn vào vị trớ 6 trờn vũng benzothiazol đem lại hoạt tớnh tốt. Cỏc nhúm thế cồng kềnh cú vẻ khụng thớch hợp cho tương tỏc với phần vành của tỳi enzym, từ đú dẫn đến giảm hoạt tớnh ức chế HDAC và ức chế sự phỏt triển tế bào. Mặt khỏc, khụng quan sỏt thấy ảnh hưởng của tớnh chất hỳt
– đẩy điện tử của cỏc nhúm thế đến hoạt tớnh sinh học của cỏc acid benzothiazol- hydroxamic.
Lựa chọn được độ dài cầu nối hợp lý, tiến hành tổng hợp chất 23 cú vũng thiazol thay cho vũng benzothiazol.
23
Kết quả chất 23 ức chế HDAC2 yếu hơn chất 9a (chứa vũng benzothiazol khụng nhúm thế). Nhưng ngược lại, độc tớnh của chất 23 trờn 5 dũng tế bào thử nghiệm đều lớn hơn so với chất 9a (bảng 3.16). Như vậy, nhúm khúa hoạt động là vũng thiazol cho hoạt tớnh ức chế sự phỏt triển trờn cả 5 dũng tế bào tốt hơn vũng thiazol liờn hợp với nhõn benzen. Tuy nhiờn, khi gắn nhúm thế vào vị trớ 6 trờn vũng benzothiazol thỡ hoạt tớnh lại tăng mạnh. Điều này cú thể là do cỏc chất đú cú tương tỏc mạnh hơn với phần vành ở miệng tỳi enzym.
Từ kết quả thử hoạt tớnh sinh học cú thể thấy cỏc acid benzothiazol-hydroxamic cầu nối 6 carbon cho tỏc dụng tốt nhất. Điều này một lần nữa khẳng định sự phự hợp của vũng benzothiazol cho vai trũ nhúm khúa hoạt động và cầu nối 6 carbon trong thiết kế cỏc acid hydroxamic hướng ức chế HDAC của luận ỏn.
4.3.2. Cỏc acid hydroxamic mạch alkyl cú liờn kết amid
Qua tham khảo nhiều bài bỏo, nhận thấy cựng với việc thiết kế cỏc acid hydroxamic thay đổi nhúm khúa hoạt động, việc thay đổi cầu nối alkyl cũng là hướng tổng hợp được nhiều nhúm nghiờn cứu quan tõm. Việc đưa dị tố vào cầu nối alkyl đó được nhiều nhúm nghiờn cứu thực hiện nhưng dị tố N chưa được nhúm nghiờn cứu nào sử dụng [18,47,48,49,50,53]. Vỡ vậy, từ cỏc acid hydroxamic 9a-f với cầu nối 6 nhúm methylen, giữ nguyờn vũng benzothiazol, thiết kế thay hai nhúm methylen ở cầu nối bằng liờn kết amid, thu được cỏc dẫn chất 11a-d và 13a-f (hỡnh 4.22).
Song song với tổng hợp hai dóy trờn, cỏc dẫn chất 17 và 20 với cầu nối giống hệt cỏc chất 11a-d và 13a-f được tổng hợp nhưng nhõn phenyl với cỏc nhúm thế khỏc nhau đúng vai trũ nhúm khúa hoạt động (hỡnh 4.23). Núi cỏch khỏc, cỏc dẫn chất 17 và 20 là dẫn chất của SAHA với cầu nối đưa liờn kết amid vào thay cho 2 nhúm methylen.
Hỡnh 4.23. Cấu trỳc của cỏc acid hydroxamic 17a-c, f, h và 20a-h
Kết quả thử tỏc dụng ức chế HDAC bằng phương phỏp Western blot ở nồng độ 10 àg/ml cho thấy cỏc dẫn chất của 4 dóy trờn đều khụng ức chế HDAC nờn histon H3, H4 đều bị deacetyl húa. Trờn hỡnh ảnh điện di gel khụng cũn quan sỏt thấy acetyl histon H3, H4 (hỡnh 4.24).
Hỡnh 4.24. Kết quả phõn tớch Western blot của một số chất đại diện dóy 13 và 20
Tương đồng với tỏc dụng ức chế HDAC, thử nghiệm hoạt tớnh khỏng dũng tế bào ung thư người SW620 của cỏc dẫn chất của cả 4 dóy trờn đều khụng cú hoạt tớnh với giỏ trị IC50 lớn hơn 30 àg/ml. Xột về cấu trỳc, dóy 17 và 20 khỏ tương đồng với SAHA (hỡnh 4.25). Tuy nhiờn, liờn kết C-C cú độ dài 1,5Å trong khi liờn kết C-N độ dài ngắn hơn khoảng 1,35Å. Do đú, việc thay liờn kết -CH2-CH2- bằng liờn kết amid - CONH- làm độ dài cầu nối ngắn lại. Cú thể điều đú dẫn đến giảm hoạt tớnh của cỏc chất.
SAHA17a 17a 20a SAHA 20a 17a
Hỡnh 4.25. Cấu trỳc khụng gian của SAHA, 17a và 20a
Theo hướng giả thuyết đú, chất 26 được tổng hợp với cầu nối vẫn cú 1 liờn kết amid nhưng độ dài mạch được tăng thờm 2 nhúm methylen.
HN N N H O Cl O O NHOH 26
Tuy nhiờn, kết quả hoạt tớnh sinh học cho thấy chất 26 vẫn khụng ức chế HDAC đồng thời khụng khỏng dũng tế bào SW620. Như vậy, độ dài cầu nối khụng phải là yếu tố chớnh làm giảm hoạt tớnh mà cú lẽ sự cú mặt của liờn kết amid là yếu tố gõy nờn sự giảm hoạt tớnh này. Liờn kết amid làm cho mạch alkyl phõn cực hơn trong khi kờnh enzym thõn dầu đồng thời tạo liờn kết hydro với cỏc acid amin của phần vành trờn miệng tỳi enzym. Như vậy, thực chất phần cầu nối bị ngắn lại, nhúm chức -NHOH
khụng đến gần được ion Zn2+ trong trung tõm hoạt động nờn khụng ức chế được HDAC và do đú cũng khụng gõy độc với tế bào.
Nhúm nghiờn cứu trường đại học Yonsei, Seoul (Hàn quốc) đó thành cụng trong việc đưa vũng -lactam vào cầu nối (hỡnh 4.26) [47,48,49]. Cỏc dẫn chất chứa
vũng -lactam này cú tỏc dụng ức chế HDAC tốt và một số chất cú độc tớnh tế bào in
vitro mạnh với giỏ trị IC50 tương đương SAHA. Từ kết quả thử hoạt tớnh cho thấy để
cú tỏc dụng, cầu nối giữa nhúm acid hydroxamic và vũng -lactam phải cú độ dài 2C; cầu nối giữa nhúm khúa hoạt động và vũng -lactam cú độ dài 2-4C cho hoạt tớnh
mạnh nhất. Như vậy, độ dài cầu nối tối ưu của cỏc dẫn chất acid -lactam-hydroxamic vẫn là 7 - 9C, tương tự như SAHA.
Hỡnh 4.26. Cấu trỳc cỏc acid -lactam-hydroxamic [47,48,49]
Một nhúm nghiờn cứu khỏc của đại học Wonkwang (Hàn quốc) lại tổng hợp được một dóy cỏc dẫn chất cú nguyờn tố oxy được đưa vào cầu nối alkyl (hỡnh 4.27) [50]. Trong số 24 dẫn chất oxa-SAHA được nhúm nghiờn cứu tổng hợp, chất cú nhúm khúa hoạt động là 3,5-dimethoxyphenyl cho hoạt tớnh ức chế HDAC mạnh nhất với IC50 = 0,64 àM, tương đương của SAHA (0,613 àM). Đồng thời, qua kết quả hoạt tớnh của 24 dẫn chất, nhúm nghiờn cứu nhận thấy cỏc chất chứa nhúm thế đẩy điện tử trờn vũng phenyl cho hoạt tớnh tốt hơn cỏc chất chứa nhúm thế hỳt điện tử. Vị trớ và bản chất của nhúm thế đẩy điện tử rất quan trọng cho hoạt tớnh ức chế HDAC.
Hỡnh 4.27. Cấu trỳc chung của cỏc dẫn chất homo-oxa-SAHA [50]
Như vậy, thay thế cấu trỳc của phần cầu nối giữa nhúm acid hydroxamic và nhúm khúa hoạt động được rất nhiều nhúm nghiờn cứu quan tõm. Trờn thực tế, việc thay đổi này đó thu được những thành cụng nhất định trong việc tỡm ra chất ức chế HDAC mới cú hoạt tớnh tương đương SAHA như đưa dị tố O, N gắn trong vũng vào cầu nối. Tuy nhiờn, việc đưa liờn kết amid vào cầu nối mang lại cấu trỳc khụng thuận
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});