NGUYấN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU

2.1. NGUYấN LIỆU

Cỏc húa chất, dung mụi dựng trong thực nghiệm được trỡnh bày trong bảng dưới đõy:

TT Nguyờn liệu Xuất xứ TT Nguyờn liệu Xuất xứ

1 2-Aminobenzothiazol Aldrich 21 Acid adipic monomethyl ester Aldrich

2 2-Amino-6-methylbenzothiazol Aldrich 22 Acid suberic monomethyl ester Aldrich

3 2-Amino-6-methoxybenzothiazol Aldrich 23 Anhydrid succinic Trung quốc

4 2-Amino-6-ethoxybenzothiazol Aldrich 24 Anhydrid glutaric Merck

5 2-Amino-6-

methylsulfonylbenzothiazol

Aldrich 25 N,N’-dicyclohexylcarbodiimid Merck

6 2-Amino-6-nitrobenzothiazol Aldrich 26 Hydroxylamin HCl Merck

7 2-Amino-6-clorobenzothiazol Aldrich 27 Dimethylformamid Merck

8 2-Amino-6-

trifluoromethylbenzothiazol

Aldrich 28 Triethylamin Merck

9 2-Aminothiazol Merck 29 Isobutylcloroformat Merck

10 Anilin Merck 30 Tetrahydrofuran Merck

11 2-Cloroanilin Merck 31 Aceton Trung quốc

12 3-Cloroanilin Merck 32 Ethanol Trung quốc

13 4-Cloroanilin Merck 33 n-Hexan Trung quốc

14 4-Fluoroanilin Merck 34 Methanol Trung quốc

15 4-Methoxyanilin Merck 35 Acid hydrocloric đặc Trung quốc

16 4-Nitroanilin Merck 36 Natri hydroxid Trung quốc

17 4-Cyanoanilin Merck 37 Pyridin Merck

18 -Alanin methyl ester.HCl Aldrich 38 O-tetrahydropyranyl hydroxylamin Aldrich

19 Glycin methyl ester.HCl Aldrich 39 Acid para-toluensulfonic Aldrich

2.2. THIẾT BỊ

- Cỏc dụng cụ thủy tinh: bỡnh cầu đỏy trũn dung tớch 50 - 100 ml, bỡnh chiết, sinh hàn hồi lưu, ống nghiệm, ống đong, pipet, cốc cú mỏ cỏc loại.

- Bỡnh sắc ký Camag, đốn tử ngoại Camag bước súng 254 nm và 366 nm, bản mỏng silicagel F254 (Merck).

- Cõn phõn tớch, cõn kỹ thuật Shimazu. - Tủ lạnh, tủ sấy Memmert. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

- Mỏy cất quay Buchi R-210, mỏy khuấy từ gia nhiệt IKA-RTC, mỏy đo nhiệt độ núng chảy nhiệt điện Electrothermal digital.

- Mỏy đo phổ hồng ngoại:

- Perkin Elmer, phũng thớ nghiệm trung tõm - Trường Đại học Dược Hà Nội.

- GX-Perkin Elmer-USA, khoa Húa học - Trường Đại học Khoa học tự nhiờn, Đại học Quốc gia Hà Nội.

- Mỏy đo phổ khối:

- HP 5989B-MS, Viện Húa học - Viện Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam.

- Autospec Premier (Waters-USA) và LTQ Orbitrap XL (Thermo Scientific), khoa Húa học - Trường Đại học Khoa học tự nhiờn, Đại học Quốc gia Hà Nội.

- Agilent 6310 Ion Trap LC/MS (Agilent Technologies), Viện Húa hợp chất thiờn nhiờn - Viện Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam.

- Mỏy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhõn Bruker AC-500 MHz, Viện Húa học - Viện Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam.

- Mỏy điện di gel: Mini-PROTEANđ tetra cell (bỡnh điện di) nối qua 2 điện cực với mỏy PowerPacđ 250V/30A/300W (Bio-rad).

- Mỏy đọc kết quả Western blot: molecular Imagingđ ChemiDocTM XRS+ (với phần mềm ImageTM) kết nối mỏy quột HP 4850.

- Tủ nuụi cấy Vision scientific Co.Ltd. (model VS-9108 MS), tủ làm thực nghiệm (Vision bio-safety clean beach).

- Kớnh hiển vi Nikon - FX-35DX để đếm tế bào. Mỏy ly tõm Union 5KR, mỏy lắc Vortex genie 2.

- Tủ lạnh giữ mụi trường nuụi cấy, bồn làm ấm mụi trường nuụi cấy đến 37oC Jeio tech SWB-03. Tủ giữ mẫu -18oC (DIOS).

- Pipet Gilson cỏc loại 1000; 200; 20; 1-10; 2-20 àl.

- Mỏy đo độ hấp thụ SpectraMax (Model: Max plus), mỏy đo độ hấp thụ huỳnh quang SpectraMax M2 kết nối mỏy tớnh.

2.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU 2.3.1. Nội dung nghiờn cứu

- Tổng hợp 51 dẫn chất acid hydroxamic mới:

Ar N H O O NHOH m 3a-f (m = 2) 5a-f (m = 3) 7a-f (m = 4) 9a-h (m = 6) Ar H N H N O NHOH O O m n Ar = S N R Ar = S N 23 (m = 6) Ar = R Ar = S N R 11a-d (m = 2, n = 2) 13a-f (m = 3, n = 1) 17a-c, f, h (m = 2, n = 2) 20a-h (m = 3, n = 1) 26 (m = 4, n = 2)

- Khẳng định cấu trỳc của cỏc chất tổng hợp dựa trờn phõn tớch dữ liệu phổ khối (MS), phổ hồng ngoại (IR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhõn (1H-NMR, 13C-NMR).

- Thử tỏc dụng ức chế HDAC của cỏc chất tổng hợp được và định lượng tỏc dụng ức chế HDAC2 của một số chất.

- Thử hoạt tớnh khỏng dũng tế bào ung thư người in vitro của cỏc chất tổng hợp

được.

- Thử hoạt tớnh khỏng dũng tế bào ung thư người in vivo của một chất đại diện.

2.3.2. Phương phỏp nghiờn cứu

2.3.2.1. Phương phỏp tổng hợp

51 dẫn chất trong đề tài đó được tổng hợp dựa trờn những nguyờn tắc và phương phỏp cơ bản của húa học hữu cơ. Từ đặc điểm cấu trỳc chung của cỏc chất ức chế HDAC và cấu trỳc của SAHA, đề tài định hướng thiết kế một số dẫn chất acid hydroxamic với mục đớch khảo sỏt sự thay đổi của 2 phần trong cấu trỳc. Đú là thay đổi nhúm nhận diện bề mặt, thay đổi độ dài cầu nối.

HN N O NHOH O Cầu nối Nhóm nhận diện bề mặt SAHA

Cỏc chất này được chia thành 2 nhúm:

Gồm 6 dóy chất 3a-f, 5a-f, 7a-f, 9a-h, 11a-d, 13a-f và chất 23 được tổng hợp theo cỏc sơ đồ dưới đõy: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

a) Dóy 3a-f, 5a-f, 7a-f và 9a-h

SN N R NH2 S N R N H O O OH S N R N H O O OCH3 m m Anhydrid succinic hoặc anhydrid glutaric DMF, pyridin (m = 2) (m = 3) (m = 4) (m = 6) S N R N H O O NHOH m DMF, CDI NH2OH.HCl NaOH, MeOH a) R = -H b) R = -CH3 c) R = -OCH3 d) R = -OC2H5 e) R = -SO2CH3 f) R = -NO2 g) R = -Cl h) R = -CF3 3a-f (m = 2) 7a-f (m = 4) 5a-f (m = 3) 9a-h (m = 6) NH2OH.HCl DMF, CDI, TEA

Acid adipic monomethylester hoặc acid suberic monomethyl ester

b) Chất 23

* Nhúm cỏc dẫn chất của SAHA

Gồm 2 dóy dẫn chất 17a-c, f, h; 20a-h và chất 26 được tổng hợp theo sơ đồ sau: a) Dóy 17a-c, f, h và 20a-h

Anhydrid succinic hoặc Anhydrid glutaric DMF, pyridin NaOH, MeOH NH2OH.HCl a, R = H b, R = 4-F c, R = 4-Cl d, R = 3-Cl e, R = 2-Cl f , R = 4-OCH3 g, R = 4-NO2 h, R = 4-CN CDI, DMF,TEA NH2 R H N R OH O H N R H N O OCH3 O O O H N R H N O NHOH O O m m n m n

-Alanin methyl ester hoặc Glycin methyl ester

17a-c, f, h (m = 2, n = 2)

20a-h (m = 3, n = 1)

b) Chất 26

2.3.2.2. Phương phỏp kiểm tra độ tinh khiết

* Nhiệt độ núng chảy: Đo bằng mỏy đo điểm chảy nhiệt điện (Electrothermal digital). * Sắc ký lớp mỏng: Dựng để theo dừi quỏ trỡnh phản ứng, xỏc định thời điểm kết thỳc

phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm sau khi tinh chế.

- Sắc ký lớp mỏng được tiến hành trờn bản mỏng silicagel 60 F254 trỏng sẵn, hoạt húa ở 110oC trong 30 phỳt. Hệ dung mụi tựy thuộc vào đặc điểm của từng chất. Mẫu thử được hũa tan trong dung mụi thớch hợp. Chấm khoảng 2 l.

- Để bản mỏng trong bỡnh sắc ký đó bóo hũa dung mụi ở nhiệt độ phũng, cho dung mụi chạy khoảng 8 cm.

2.3.2.3. Phương phỏp phõn tớch cấu trỳc

Để phõn tớch, khẳng định cấu trỳc của 51 chất tổng hợp, đề tài đó sử dụng cỏc phương phỏp phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhõn (1H-NMR, 13C-NMR).

Phổ hồng ngoại

Phổ hồng ngoại được tiến hành ghi trờn mỏy Perkin Elmer hoặc GX-Perkin Elmer-USA với kỹ thuật viờn nộn KBr trong vựng 4000 - 600 cm-1. Ghi phổ ở độ phõn giải 4 cm-1.

Phổ khối lượng

Phổ khối lượng được tiến hành ghi trờn một số loại mỏy, khỏc nhau về nguyờn lý tạo phổ và chế độ ghi phổ.

* Mỏy HP 5989B-MS (Hewlett Packard)

Hoạt động theo phương phỏp va chạm electron (EI). Mỏy cú độ phõn giải khối thấp (R > 1000), mẫu được đưa vào theo chế độ trực tiếp (DIP) với năng lượng bắn phỏ 70 eV. Số khối ghi nhận trờn phổ là số nguyờn, cỏc pic đều rừ ràng, ion phõn tử thu được cú dạng [M]+..

* Mỏy Autospec Premier (Waters-USA)

Hoạt động theo phương phỏp va chạm electron (EI). Mỏy cú độ phõn giải cao (R > 360000) nờn cỏc ion cú số khối được ghi nhận tới số thập phõn thứ 4. Tuy nhiờn, do năng lượng bắn phỏ lớn và độ phõn giải cao nờn phõn tử thường vỡ vụn, phổ gồm nhiều pic phức tạp.

* Mỏy LTQ Orbitrap XL (Thermo Scientific) và mỏy Agilent 6310 Ion Trap LC/MS (Agilent Technologies)

Hoạt động theo phương phỏp ion húa phun bụi điện tử (ESI). Mỏy cú độ phõn giải > 60000. Đặc điểm của loại phổ này là tựy theo phương thức bẫy ion (ESI (+) hoặc ESI (-)) mà ion ghi nhận được là dương hay õm.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhõn

Phổ NMR được đo trờn mỏy cộng hưởng từ hạt nhõn Bruker AC-500 MHz, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

dung mụi DMSO-d6. Phổ 1H-NMR đo ở tần số 500 MHz, phổ 13C-NMR đo ở tần số 125 MHz. Độ dịch chuyển húa học (, ppm) được tớnh theo chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS), nhiệt độ ghi phổ khoảng 300oK.

Phổ 1H-NMR cung cấp cỏc dữ liệu về tỷ lệ cường độ giữa cỏc pic, độ bội của

từng pic, dạng võn phổ, từ đú xỏc định được hằng số tương tỏc JH-H, tương quan giữa

cỏc hằng số này để gúp phần khẳng định khung cấu trỳc, vị trớ cỏc nhúm thế [24,73]. Độ dịch chuyển húa học của proton (1H) được lấy tới số thập phõn thứ 3 (tần số đo 500 MHz).

Phổ 13C-NMR cho biết số carbon cú trong phõn tử hợp chất, độ dịch chuyển húa học và bậc của cỏc carbon, từ đú cũng gúp phần xỏc định cấu tạo của hợp chất cũng như vị trớ cỏc nhúm thế [24,73]. Độ dịch chuyển húa học của carbon (13C) được lấy tới số thập phõn thứ 3 (tần số đo 125 MHz).

2.3.2.4. Phương phỏp thử hoạt tớnh sinh học

Thử tỏc dụng ức chế histon deacetylase

Tỏc dụng ức chế HDAC của cỏc dẫn chất tổng hợp được đỏnh giỏ giỏn tiếp thụng qua xỏc định mức độ acetyl húa histon H3, H4 trong tế bào ung thư đại tràng SW620. Phõn tớch dựa trờn Western blot cú thể khẳng định được tỏc dụng của cỏc mẫu thử làm tăng hoặc giảm sự acetyl húa histon H3, H4 khi so sỏnh với mẫu trắng [14].

* Nguyờn liệu và nuụi cấy tế bào:

Cỏc tế bào ung thư đại tràng SW620 được nuụi cấy trong mụi trường RPMI (bổ sung L-glutamin, 10% huyết thanh bào thai bũ (fetal bovine serum)), gọi là mụi trường nuụi cấy hoàn chỉnh (complete medium). Tất cả tế bào được ủ ở 37°C với 5% (w/v) CO2 và 95% (w/v) khụng khớ. Trước khi sử dụng, cỏc mẫu thử nghiệm dạng bột được hũa tan trong dimethylsulfoxid (DMSO) để tạo dung dịch gốc nồng độ 10 mg/ml. Cỏc dung dịch gốc sau đú được pha lng bằng mụi trường nuụi cấy hồn chỉnh để tạo cỏc dung dịch làm việc ở nồng độ 1 g/ml và 10 g/ml.

* Phõn lập histon và Western Blot

Tế bào SW620 (khoảng 1 x 106) được ủ với mẫu thử trong 24 giờ, song song làm mẫu trắng (mẫu tế bào khụng ủ với mẫu thử). Sau đú, cỏc tế bào được xử lý và rửa bằng dung dịch đệm phosphat. Tế bào được ly giải trong dung dịch đệm ly giải [20 mM Tris-HCl (pH 7,5); 150 mM NaCl; 1 mM Na2EDTA; 1 mM EGTA; 1% triton; 2,5 mM Na pyrophosphat; 1 mM -glycerophosphat; 1 mM Na3VO4; 1 g/ml leupeptin], ủ trong đỏ 15 phỳt. Hỗn dịch được ly tõm và phần dịch được thu hồi để tiến hành điện di trờn gel. Histon được điện di qua gel SDS-PAGE 10% và chuyển vào màng PVDF. Cỏc màng được ủ qua đờm cựng khỏng thể 1 là khỏng acetyl histon H3, khỏng acetyl histon H4 (Milipore), tiếp theo ủ với khỏng thể 2 là khỏng thể IgG thỏ liờn hợp peroxidase của ngựa trong 2 giờ. Cỏc dải cú phản ứng dương tớnh được phỏt hiện nhờ

sự phỏt quang đó được tăng cường. Cỏc thớ nghiệm được làm lặp lại ớt nhất 3 lần một cỏch độc lập.

Định lượng tỏc dụng ức chế HDAC2

Sử dụng kit định lượng HDAC cú phỏt huỳnh quang (fluorogenic HDAC assay kit). Thành phần kit định lượng HDAC (Bioscience) gồm:

- HDAC2 tỏi tổ hợp của người (0,66 mg/ml). - Cơ chất phỏt quang 3 của HDAC (5mM).

- Chất khai triển định lượng HDAC (HDAC assay developer) (2x) - Trichostatin A (200 M).

- Dung dịch đệm (HDAC assay buffer).

* Chuẩn bị mẫu thử:

Mẫu thử được pha loóng từ dung dịch gốc 10 mg/ml bằng DMSO để thu được cỏc nồng độ làm việc là 0,01; 0,03; 0,1; 0,3 g/ml. Pha loóng cơ chất HDAC từ nồng

độ 5mM thành dung dịch cú nồng độ 100 M bằng dung dịch đệm (HDAC assay

buffer). Pha loóng HDAC2 trong dung dịch đệm (HDAC assay buffer) để thu được dung dịch cú nồng độ 0,8 ng/l.

* Tiến hành thử:

Bước 1: Trộn hỗn hợp cỏc chất phản ứng trong đĩa vi chuẩn màu đen (microtiter black plate) theo bảng dưới đõy. Ủ ấm ở 37oC trong 30 phỳt. Thớ nghiệm được làm 2 lần.

Chứng dương tớnh Chứng õm tớnh Chất thử Trắng õm tớnh HDAC 2 (0,8 ng/l) 5 l 5 l 5 l - Cơ chất HDAC (100 M) 5 l 5 l 5 l 5 l BSA (1 mg/ml) 5 l 5 l 5 l 5 l Trichostatin A - 5 l - - Chất thử - - 5 l - Dung dịch đệm (HDAC assay buffer) 35 l 30 l 30 l 40 l Tổng 50 l 50 l 50 l 50 l

Bước 2: Thờm 50 l chất khai triển định lượng HDAC (HDAC assay developer) (2x) vào mỗi lỗ. Để ở nhiệt độ phũng trong 15 phỳt.

Bước 3: Đọc kết quả độ hấp thụ trờn mỏy đo hấp thụ huỳnh quang, tại bước súng kớch thớch 360 nm, bước súng phỏt quang 450 nm; bước súng kớch thớch 380 nm, bước súng

Kết quả độ hấp thụ (của 2 lần thớ nghiệm) được đưa vào phần mềm excel tớnh toỏn để thu được phần trăm trung bỡnh mẫu thử gắn với HDAC. Phần trăm này được

chuyển sang phần mềm GraphPad prism để tớnh toỏn ra IC50. Độ lệch chuẩn tương đối

khụng quỏ 10%. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Thử hoạt tớnh khỏng tế bào ung thư in vitro

Thử hoạt tớnh khỏng tế bào ung thư người in vitro được thực hiện tại Khoa

Dược, Trường Đại học Quốc gia Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc theo phương phỏp MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid) [14,65] và giỏ trị IC50 được tớnh trờn phần mềm GraphPad Prism.

* Dũng tế bào thử nghiệm:

 SW620: tế bào ung thư đại tràng người

 MCF-7: tế bào ung thư vỳ người

 AsPC-1: tế bào ung thư tụy người

 PC-3: tế bào ung thư tiền liệt tuyến người

 NCI-H460: tế bào ung thư phổi người

Cỏc dũng tế bào ung thư được lấy từ Ngõn hàng tế bào ung thư của Viện nghiờn cứu sinh học và cụng nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) và được nuụi cấy trong mụi trường DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium với dũng tế bào MCF-7) hoặc RPMI (với dũng 4 tế bào cũn lại) bổ sung 10% FBS (huyết thanh bào thai bũ).

Thử hoạt tớnh khỏng tế bào ung thư in vitro của cỏc chất bằng phương phỏp

MTT được thực hiện theo cỏc bước sau:

* Bước 1: Chuẩn bị

Cỏc tế bào ở pha logarit được trypsin húa và phõn tỏn vào hỗn dịch đơn tế bào trong mụi trường DMEM hoặc RPMI bổ sung 10% FBS và điều chỉnh đến nồng độ khoảng 1,5x104 đến 3,5x104 tế bào, sau đú chia đều vào cỏc giếng của đĩa 96 giếng, mỗi giếng 200l. Cỏc đĩa sau đú được ủ ở 37oCtrong điều kiện 5% CO2. Sau 24 giờ ủ, cỏc mẫu thử được chuẩn bị trong 20l mụi trường DMEM/RPMI bổ sung 10% FBS từ dung dịch gốc 10 mg/ml trong dimethylsulfoxid (DMSO) rồi thờm 2 l mẫu thử vào

cỏc giếng ở nhiều nồng độ khỏc nhau, cỏc đĩa này sau đú được ủ thờm 48 giờ. Tất cả cỏc mẫu được chuẩn bị sao cho nồng độ cuối cựng của DMSO là 0,1%.

* Bước 2: Tiến hành thử

Sau khi ủ 48 giờ, thờm vào mỗi giếng 20 l thuốc nhuộm 3-(4,5-

PBS. Cỏc đĩa được ủ thờm 3 giờ ở 37oCtrong điều kiện 5% CO2. Tiếp theo, mỗi giếng được cho 100 l dung dịch MTT trong DMSO, để 5 phỳt cho thuốc nhuộm MTT được hũa tan. Độ hấp thụ được đọc ở bước súng 510nm.

Giỏ trị IC50 là nồng độ của mẫu thử mà ở đú, độ hấp thụ giảm đi 50% so với nhúm chứng (trắng õm tớnh là giếng chỉ thờm mụi trường nuụi cấy). Kết quả cuối cựng là giỏ trị trung bỡnh của 4 lần đo độc lập với giỏ trị độ hấp thụ khỏc nhau khụng quỏ 5%. Giỏ trị IC50 được tớnh dựa trờn phần mềm GraphPad Prism. Trong phương phỏp thử này, IC50  30g/ml được coi là cú hoạt tớnh.

Thử hoạt tớnh khỏng tế bào ung thư in vivo

Hoạt tớnh khỏng tế bào ung thư in vivo được tiến hành theo mụ hỡnh ghộp dị

chủng trờn chuột trụi lụng (nude mouse xenograft), sử dụng dũng tế bào PC-3 (ung thư tiền liệt tuyến người), tại đại học Quốc gia Chungbuk, Cheongju (Hàn Quốc) [46].