TỔNG hợp và THỬ HOẠT TÍNH SINH học của một số dẫn CHẤT ACID HYDROXAMIC HƯỚNG ức CHẾ ENZYM HISTON DEACETYLASE

1 I MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Một đích tác dụng phân tử ý histon deacetylase (HDAC) Nghiên cứu HDAC xác định hoạt động bất thường HDAC có liên quan đến nhiều bệnh ung thư Vì vậy, chất ức chế HDAC trở thành tác nhân chống ung thư đầy triển vọng Acid suberoylanilid hydroxamic (Zolinza ®, 2006) depsipeptid (Romidepsin®, 2009) hai chất ức chế HDAC Cục quản lý thực phẩm dược phẩm Mỹ (US-FDA) phê duyệt điều trị u lympho da tế bào T Bên cạnh đó, số chất ức chế HDAC khác nghiên cứu trải qua pha thử lâm sàng NVLLAQ824, MS-275, CI-994, PXD-101 Các chất ức chế HDAC chia thành nhóm dựa theo cấu trúc hóa học, dẫn chất acid hydroxamic nhà khoa học giới tập trung nghiên cứu nhiều cấu trúc đơn giản dễ tổng hợp, hoạt tính ức chế HDAC mạnh Hội nhập với xu hướng nghiên cứu giới tìm kiếm chất ức chế HDAC có hoạt tính kháng tế bào ung thư tốt, luận án “Tổng hợp thử hoạt tính sinh học số dẫn chất acid hydroxamic hướng ức chế enzym histon deacetylase” thực với mục tiêu: Mục tiêu luận án Thiết kế tổng hợp khoảng 40 - 50 dẫn chất acid hydroxamic hướng ức chế HDAC Thử tác dụng ức chế HDAC tác dụng kháng tế bào ung thư chất tổng hợp Những đóng góp luận án Về thiết kế tổng hợp dẫn chất acid hydroxamic Đã thiết kế, tổng hợp khẳng định cấu trúc 51 acid hydroxamic mới, chưa thấy công bố tài liệu tham khảo Về thử hoạt tính sinh học chất Thử tác dụng ức chế HDAC phân tích Western blot 51 dẫn chất cho thấy nồng độ 10 µg/ml, chất 7a-d, 9a-h có hoạt tính Với hoạt tính mạnh hơn, chất 9a-h thể tác dụng ức chế HDAC nồng độ µg/ml Định lượng tác dụng ức chế HDAC2 chất 9a-h, chất 23 cho thấy chất ức chế HDAC2 với IC 50 mạnh SAHA từ – 20 lần 51 dẫn chất thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro theo phương pháp MTT Kết 15 chất có khả ức chế phát triển tế bào dòng tế bào thử nghiệm chất 9b, 9g tác dụng tương đương SAHA Chất 9g với hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro ức chế HDAC tốt lựa chọn thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vivo Thử nghiệm mơ hình ghép dị chủng chuột trụi lơng với dòng tế bào ung thư tiền liệt tuyến (PC-3) cho thấy nồng độ 30 µg/ml, chất 9g ức chế phát triển khối u tương đương SAHA Bố cục luận án Luận án có 152 trang, 28 bảng, 73 hình, 33 sơ đồ Bố cục gồm phần: Đặt vấn đề (1 trang), tổng quan (46 trang), nguyên liệu, thiết bị, nội dung phương pháp nghiên cứu (10 trang), kết nghiên cứu (53 trang), bàn luận (41 trang), kết luận kiến nghị (2 trang), danh mục báo công bố liên quan đến luận án (1 trang) Luận án có 92 tài liệu tham khảo (7 trang) 61 phụ lục (106 trang) II NỘI DUNG LUẬN ÁN Chương TỔNG QUAN Tổng quan trình bày về: - Histon deacetylase (HDAC): phân loại, cấu trúc; mối liên quan ung thư bất thường hoạt động HDAC - Các chất ức chế HDAC: phân loại, chế tác dụng cấu trúc - Tổng hợp tình hình nghiên cứu giới chất ức chế HDAC, đặc biệt trọng đến hydroxamat dẫn chất - Các phương pháp tạo liên kết amid, tổng hợp acid hydroxamic Chương NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, thiết bị - Các nguyên liệu, hóa chất, dung môi: Đức, Trung Quốc, Việt Nam - Các dụng cụ thí nghiệm thơng thường dùng tổng hợp hữu - Các máy đo nhiệt độ nóng chảy, phổ hồng ngoại, phổ khối, phổ cộng hưởng từ hạt nhân Máy đo độ hấp thụ huỳnh quang, tủ nuôi cấy, máy điện di - Các dòng tế bào ung thư người thử nghiệm 2.2 Nội dung nghiên cứu - Thiết kế tổng hợp 51 dẫn chất acid hydroxamic - Khẳng định cấu trúc chất tổng hợp dựa phân tích liệu phổ khối (MS), phổ hồng ngoại (IR) phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1HNMR, 13C-NMR) 3 - Thử tác dụng ức chế HDAC chất tổng hợp định lượng tác dụng ức chế HDAC2 số chất - Thử hoạt tính kháng dòng tế bào ung thư người in vitro chất tổng hợp - Thử hoạt tính kháng dòng tế bào ung thư người in vivo chất đại diện Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Tổng hợp hóa học phân tích liệu phổ 3.1.1 Nhóm dẫn chất acid hydroxamic mang khung benzothiazol Gồm dãy chất 3a-f, 5a-f, 7a-f, 9a-h, 11a-d, 13a-f chất 23 tổng hợp theo sơ đồ đây: a) Dãy 3a-f, 5a-f, 7a-f 9a-h b) Chất 23 c) Dãy 11a-d 13a-f 3.1.2 Nhóm dẫn chất SAHA Gồm dãy dẫn chất 17a-c, f, h; 20a-f chất 26 tổng hợp theo sơ đồ sau: a) Dãy 17a-c, f, h 20a-f b) Chất 26 Bảng 3.13 Tóm tắt kết tổng hợp dẫn chất luận án TT Chất H (%) Rf* tnc (oC) NHOH 51,2 0,58 250-251 NHOH 40,5 0,52 252-253 NHOH 40,6 0,46 215-216 NHOH 32,3 0,54 232-234 NHOH 51,1 0,34 330-331 NHOH 63,6 0,35 265-266 72,0 0,40 149-150 NHOH 68,0 0,40 180-182 NHOH 66,0 0,40 189-191 CTCT Dãy chất 3a-f O N 3a N H S O O N 3b N H S H3C O O N 3c N H S H3CO O O N 3d N H S C2H5O O O N 3e N H S H3CO2S O O N 3f N H S O2N O Dãy chất 5a-f O O N 5a N H S NHOH O N 5b H3C S N H O O O N 5c H3CO S N H O 10 O N 5d N H S C2H5O O 11 65,0 0,41 176-177 NHOH 53,0 0,39 148-149 42,0 0,39 171-173 78,0 0,44 176-177 78,0 0,48 204-205 NHOH 84,0 0,41 189-190 NHOH 86,0 0,42 193-194 NHOH 74,0 0,39 220-221 NHOH 80,0 0,39 214-215 NHOH 83,3 0,42 176-177 80,9 0,45 204-205 90,3 0,43 189-190 83,3 0,46 193-194 90,5 0,40 220-221 NHOH 80,0 0,38 214-215 NHOH 78,0 0,37 196-198 75,0 0,40 186-187 90,6 0,39 178-180 NHOH 89,9 0,40 189-190 NHOH 74,5 0,42 194-196 68,5 0,38 182-184 N 5e N H S H3CO2S O 12 NHOH O O N 5f N H S O2 N NHOH Dãy chất 7a-f O 13 N 7a NHOH N H S O O 14 N 7b NHOH N H S H3 C O O 15 N 7c N H S H3CO O O 16 N 7d N H S C2H5O O O 17 N 7e N H S H3CO2S O O 18 N 7f N H S O2N O Dãy chất 9a-h O 19 N 9a N H S O O 20 N 9b NHOH N H S H 3C O O 21 N 9c NHOH N H S H3CO O O 22 N 9d NHOH N H S C2H5O O O 23 N 9e NHOH N H S H3CO2S O O 24 N 9f N H S O2N O O 25 N 9g N H S Cl O O 26 N 9h NHOH N H S F3C O Dãy chất 11a-d O 27 N 11a NH N H S NHOH O O O 28 N 11b H3 C NH N H S O O O 29 N 11c H3CO NH N H S O O O 30 N 11d C2H5O S NH N H O NHOH O Dãy chất 13a-f O 31 O N 13a S N H S 0,39 194-195 NHOH 93,3 0,40 198-199 NHOH 88,2 0,40 186-187 85,0 0,36 210-211 50,0 0,31 230-231 34,4 0,30 197-198 NHOH 50,2 0,30 195-196 NHOH 42,1 0,32 189-190 79,1 0,27 205-206 36,5 0,28 195-197 50,5 0,37 189-191 51,2 0,27 173-174 42,2 0,29 172-173 42,0 0,31 162-163 63,0 0,29 128-130 55,0 0,34 178-179 56,0 0,32 175-176 NHOH 50,0 0,28 185-186 NHOH 47,8 0,37 166-167 81,5 0,41 187-188 O 13c N H S NH O O O N 13d N H S C2H5O NH O O O N 13e NHOH N H S H3CO2S NH O O 36 82,4 NH O N H3CO 35 NHOH O O 34 187-188 O N 13b H3C 33 0,36 NH O 32 86,7 NHOH N H O N 13f NHOH N H S O2 N NH O Dãy chất 17a-c, f, h O 37 H N 17a O N H NHOH O O 38 O H N 17b N H O F O 39 O H N 17c N H O Cl O 40 O H N 17f N H NHOH O H3CO O 41 O H N 17h N H NHOH O NC Dãy chất 20a-h O 42 H N 20a NH O NHOH O O 43 H N 20b NH NHOH O O F O 44 H N 20c NH O NHOH O Cl O 45 H N Cl 20d NH NHOH O O O Cl 46 H N 20e NH O NHOH O O 47 H N 20f NH NHOH O O H3 CO O 48 H N 20g NH NHOH O O O2N O 49 H N 20h NH O O NC O 50 N 23 S N H O O 51 O H N 26 N H O Cl NHOH * Hệ dung môi sắc ký: DCM-MeOH-AcOH (90:10:1) Các chất 9a-h, 23, 26 hệ dung môi sắc ký DCM-MeOH-AcOH (90:8:1) Dung mơi kết tinh: Nước-HCl 5% 3.2 Hoạt tính sinh học 3.2.1 Tác dụng ức chế HDAC Tác dụng ức chế HDAC dẫn chất tổng hợp đánh giá gián tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon H3, H4 tế bào ung thư đại tràng SW620 Phân tích dựa Western blot khẳng định tác dụng mẫu thử làm tăng giảm acetyl hóa histon H3, H4 so sánh với mẫu trắng Thử nghiệm tiến hành khoa Dược, đại học Chungbuk (Cheongju, Hàn Quốc) Các chất đánh giá tác dụng ức chế HDAC nồng độ 10 µg/ml, có tác dụng tiếp tục đánh giá nồng độ µg/ml Kết chất 7a-f, 9a-h, chất 23 có tác dụng ức chế HDAC trình bày bảng 3.14, chất lại khơng ức chế HDAC nồng độ 10 µg/ml Bảng 3.14 Tác dụng ức chế HDAC số chất tổng hợp TT Chất Tác dụng ức chế HDAC 10 µg/ml µg/ml O Các dẫn chất benzothiazol R Các chất có cầu nối 4C (m = 4) 7a (R = -H) 7b (R = -CH3) 7c (R = -OCH3) 7d (R = -OC2H5) 7e (R = -SO2CH3) 7f (R = -NO2) Các chất có cầu nối 6C (m = 6) 9a (R = -H) 9b (R = -CH3) 9c (R = -OCH3) 10 9d (R = -OC2H5) 11 9e (R = -SO2CH3) 12 9f (R = -NO2) 13 9g (R = -Cl) 14 9h (R = -CF3) 15 23 (vòng thiazol) SAHA** * KT: Khơng thử; ** Chuẩn dương tính * Nhận xét: O N S N H m NHOH + + + + - - + + + + + + + + + KT + + + + + + + + Kết phân tích Western blot cho thấy chất mang khung benzothiazol có cầu nối 4C (7a-d) ức chế HDAC nồng độ 10 µg/ml Với tác dụng mạnh hơn, hầu hết chất mang khung benzothiazol cầu nối 6C (9a-c, 9f-h) chất 23 (cấu trúc vòng thiazol, cầu nối 6C) thể tác dụng nồng độ µg/ml Dựa kết phân tích Western blot, chất 9a-h chất 23 lựa chọn để định lượng tác dụng ức chế HDAC2 Kết IC 50 chất 9a-h, 23 HDAC2 trình bày bảng 3.15 Bảng 3.15 Kết định lượng tác dụng ức chế HDAC2 chất 9a-h, 23 TT Chất 9a (R = -H) 9b (R = -CH3) 9c (R = -OCH3) 9d (R = -OC2H5) 9e (R = -SO2CH3) 9f (R = -NO2) 9g (R = -Cl) 9h (R = -CF3) 23 (vòng thiazol) SAHA IC50 (µg/ml) 0,013 0,036 0,039 0,159 0,120 0,009 0,050 0,262 0,157 0,530 (µM) 0,040 0,107 0,102 0,435 0,300 0,024 0,140 0,673 0,578 2,005 KLPT 321,39 335,42 351,42 365,45 399,49 366,39 355,84 389,39 271,34 264,30 * Nhận xét: Cả chất có khả ức chế HDAC2 mạnh SAHA với giá trị IC50 từ 0,013 – 0,262 µg/ml 3.2.2 Hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro Các chất tổng hợp đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư người dòng tế bào SW620 (ung thư đại tràng) Nếu có tác dụng kháng dòng tế bào tiếp tục thử nghiệm dòng tế bào khác: MCF-7 (ung thư vú), PC-3 (ung thư tiền liệt tuyến), AsPC-1 (ung thư tụy), NCI-H460 (ung thư phổi) Thử nghiệm tiến hành khoa Dược, đại học Chungbuk (Cheongju, Hàn Quốc) theo phương pháp MTT Kết giá trị IC50 chất có hoạt tính (dãy 5, 7, chất 23) trình bày bảng 3.16 Những chất dãy 3, 11, 13, 17, 20 chất 26 khơng kháng dòng tế bào SW620 Bảng 3.16 Kết thử hoạt tính kháng tế bào ung thư người in vitro TT Chất IC50 (µg/ml) SW620 MCF-7 PC-3 AsPC-1 O N Các dẫn chất benzothiazol R Các chất có cầu nối 3C (m = 3) 5a (R = -H) >30 5b (R = -CH3) 18,96 5c (R = -OCH3) 20,65 5d (R = -OC2H5) 20,41 5e (R = -SO2CH3) >100 5f (R = -NO2) >30 Các chất có cầu nối 4C (m = 4) 7a (R = -H) 7,85 7b (R = -CH3) 4,69 7c (R = -OCH3) 9,07 10 7d (R = -OC2H5) 9,26 11 7e (R = -SO2CH3) >30 12 7f (R = -NO2) >30 Các chất có cầu nối 6C (m = 6) 13 9a (R = -H) 4,01 14 9b (R = -CH3) 0,56 15 9c (R = -OCH3) 0,96 16 9d (R = -OC2H5) 10,43 17 9e (R = -SO2CH3) 5,42 18 9f (R = -NO2) 0,29 19 9g (R = -Cl) 0,32 20 9h (R = -CF3) 0,35 21 23 (vòng thiazol) 2,55 0,50 SAHA * KT: Không thử NCI-H460 O S N H m NHOH KT KT KT KT KT KT KT KT KT KT KT KT KT KT KT KT KT KT KT KT KT KT KT KT 4,02 4,27 5,91 8,72 >30 >30 12,51 6,23 15,29 6,69 >30 >30 10,19 13,33 23,93 16,70 >30 >30 14,41 10,97 21,41 7,96 >30 >30 6,61 1,60 1,85 11,61 15,35 3,83 1,45 0,78 5,47 0,13 5,44 0,53 1,56 16,89 5,69 1,28 0,82 2,91 4,15 0,94 5,69 0,54 0,79 9,88 13,52 1,65 0,34 2,20 2,10 0,69 5,71 0,84 1,25 6,58 6,54 1,90 0,39 1,28 4,24 0,68 * Nhận xét: Kết cho thấy chất 5b-d với cầu nối 3C bắt đầu có hoạt tính yếu Các chất cầu nối 4C, chất 7a-d tác dụng dòng tế bào thử nghiệm Cầu nối 6C giúp mang lại hoạt tính tốt cho chất 9a-h Trong đó, chất 9b, 9c, 9f, 9g, 9h có hoạt tính dòng tế bào (IC 50 từ 0,29 – 3,83 µg/ml) Đặc biệt chất 9g ức chế 4/5 dòng tế bào với giá trị IC50 thấp SAHA (0,32 – 0,82 µg/ml) Việc thay nhóm nhận diện bề mặt vòng thiazol với độ dài cầu nối 6C thu chất 23 có tác dụng kháng dòng tế bào thử nghiệm 3.2.3 Hoạt tính kháng tế bào ung thư in vivo 10 Từ kết trên, chất 9g có hoạt tính tốt lựa chọn để thử độc tính in vivo Thí nghiệm tiến hành mơ hình ghép dị chủng chuột trụi lơng, sử dụng dòng tế bào PC-3 (ung thư tiền liệt tuyến người), khoa Dược, đại học Chungbuk (Cheongju, Hàn Quốc) Hoạt tính kháng tế bào ung thư tính tốn dựa phần trăm ức chế phát triển khối u mẫu thử liều xác định so với mẫu trắng đối chiếu Kết thí nghiệm trình bày bảng 3.17 Bảng 3.17 Sự thay đổi khối lượng khối u chuột nhóm thử, nhóm trắng đối chiếu SAHA Nhóm (n=7) Liều (mg/kg) Trắng 10 30 30 9g SAHA Thể tích khối u (mm3) Ngày 0,0± 0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 11 35,4±13,4 32,2±16,8 28,9±7,6 29,1±7,2 35,9±14,3 13 74,6±20,3 57,9±22,1 53,1±26,2 43,0±10,0b 44,7±13,1b 15 105,1±21,5 81,6±22,7 76,8±33,9 66,8±14,1b 70,7±14,6b KL khối u 18 184,2± 40,3 143,2±32,7 121,1±49,1a 105,3±22,1c 111,6±21,8b 21 341,7± 88,5 266,6±58,1 205,9±58,9b 174,8±29,7c 179,6±31,8c (mg) 733,4± 180,58 567,5± 232,20 429,5± 114,23b 374,0± 77,78c 379,2± 54,40c * Chú thích: (t-TEST): a: p