28
Thử tác dụng kháng tế bào ung thư người được tiến hành theo phương pháp của Skehan & CS (1990) và Likhiwitayawuid & CS(1993) hiện đang được áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thư Quốc gia của Mỹ (NCI).
Phương pháp này là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư người ở điều kiện in vitro.
* Dòng tế bào nghiên cứu:
- Dòng Hep-G2 (Hepatocellular carcinoma): Ung thư gan - Dòng vú (Lung cancer): Ung thư p
Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong môi trường khác nhau có bổ sung 10% FBS (huyết thanh bào thai bò) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2, 37oC, độ ẩm 98%, vô trùng tuyệt đối). Tùy thuộc vào đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau. Tế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng để thử độc tính.
* Môi trường nuôi cấy:
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) hoặc MEME (Minimum Essential Medium with Eagle’s salt)
Có bổ sung L-glutamine, Sodium piruvat, NaHCO3, PSF(Penixillin- Streptomycin sulfate-Fungizone), NAA (Non-Essential Amino Acids), 10% BCS (Bovine Calf Serum), Tripsin-EDTA 0,05%, DMSO (Dimethyl Sulfoxid), TCA(Trichloro Acetic acid), Tris Base, PBS (Phosphate Buffered Saline), SRB (Sulfo Rhodamine B), Acid Acetic.
* Các dụng cụ thử 1 lần:
Bình nuôi cấy tế bào, phiến vi lượng 96 giếng, pipet pasteur, các đầu tuýp cho micropipet…
29
Dùng chất chuẩn có khả năng diệt tế bào: ellipticin, vinblastin hoặc taxol pha trong dung môi DMSO (dimethyl sulfoxid)
* Chất thử:
Do điều kiện có hạn, chúng tôi chỉ tiến hành thử hoạt tính gây độc của 5 chất trong số 10 chất tổng hợp được là các chất 2a, 2b, 3a, 4a, 5b, 7a, 7b
* Tiến hành:
Tế bài ung thư được duy trì ở điều kiện tiêu chuẩn. Sau khi tế bào được hoạt hóa phát triển đến pha log sẽ được sử dụng cho thử test với các chất thử đã chuẩn bị sẵn ở 4-10 thang nồng độ khác nhau, lặp lại ba lần trên phiến vi lượng 96 giếng.
Mẫu thử nghiệm bao gồm tế bào, môi trường nuôi cấy và mẫu thử. Mẫu thử nghiệm được ủ ở điều kiện 37oC, 5% CO2 để tế bào tiếp tục phát triển
Sau 48-72 giờ lấy ra, cố định tế bào, rửa, nhuộm và hòa lại bằng dung dịch chuẩn. Đọc kết quả trên máy ELISA ở bước sóng 495-515nm.
b) Kết quả
Giá trị IC50 được tính trên chương trình Table curve. Trong phương pháp thử này, IC50 10g/ml được coi là có hoạt tính.
30
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Tổng hợp hóa học:
Sau khi tham khảo các tài liệu và dựa vào điều kiện phòng thí nghiệm, các hóa chất cho phép, chúng tôi đã tiến hành tổng hợp một số dẫn chất ester 3- (benzimidazol-2-yl) propanoat theo sơ đồ sau:
Sơ đồ 3.1: Quy trình tổng hợp dẫn chất benzimidazol-2-yl propanoat