Thử tác dụng sinh học tiến hành trên 5 vi khuẩn Gram(+), 5 vi khuẩn Gram(- ) và 4 vi nấm, thực hiện tại bộ môn Vi sinh- Sinh học của Trường Đại học Dược Hà Nội.
Tất cả các chất tổng hợp được đem thử hoạt tính theo phương pháp khuếch tán trên thạch và sau đó đo kích thước vòng vô khuẩn. Chọn chất đối chiếu là penicillin và streptomycin với kháng khuẩn. Chọn intraconazol là chất đối chiếu với phương pháp kháng nấm.
- Mẫu thử được pha vào dung môi thích hợp (ethanol) với nồng độ 100 µg/ml. Các chất đối chiếu cũng được pha vào dung môi thích hợp gồm Penicilin (Peni) 27 UI/ml, Streptomycin (Strep) 14 µg/ml và Intraconazol (Intra) 50 µg/ml.
- Các khoanh giấy lọc vô trùng, đã sấy khô được tẩm 3 lần với dung dịch mẫu thử. Sau mỗi lần tẩm, các khoanh giấy lọc có chứa mẫu thử đều được sấy < 600C đến khô hết dung môi. Làm tương tự với các chất đối chiếu.
- Với vi khuẩn: VSV kiểm định được cấy vào môi trường canh thang, ủ ở 37°C trong 18 – 24h để tạo thành hỗn dịch VSV có nồng độ 107 tế bào/ml (kiểm tra bằng pha loãng và dãy dịch chuẩn). Môi trường thạch vô trùng (tiệt trùng ở 1180C/30 phút) được làm lạnh về 45 – 500C và được cấy giống VSV kiểm định vào với tỷ lệ 2,5 ml/ 100 ml. Lắc tròn để VSV kiểm định phân tán đều vào môi trường thạch thường, rồi đổ vào các đĩa petri vô trùng với thể tích 20 ml/đĩa và để cho thạch đông lại.
- Với vi nấm: vi nấm kiểm định được cấy vào môi trường Sabouraud lỏng, rồi nuôi cấy cho phát triển trong tủ ấm 28 – 300C trong 18 – 24h đến nồng độ 107 tế bào/ml (kiểm tra bằng pha loãng và dãy dịch chuẩn). Đối với Aspergillus niger thì
27
sử dụng dung dịch Tween 80 nồng độ 0,2% vô trùng. Môi trường Sabouraud đặc vô trùng (tiệt trùng ở 1180C/30 phút) được làm lạnh về 45 – 500C và được cấy giống VSV kiểm định vào với tỷ lệ 2,5 ml/ 100 ml. Lắc tròn để VSV kiểm định phân tán đều trong môi trường thạch, rồi đổ vào các đĩa petri vô trùng với thể tích 20 ml/đĩa và để cho thạch đông lại.
- Đặt khoanh giấy lọc: khoanh giấy lọc (đường kính Φ = 6,0 mm) đã được tẩm chất thử và xử lý như trên được đặt lên bề mặt môi trường thạch chứa VSV kiểm định theo sơ đồ định sẵn.
- Các đĩa petri có mẫu thử được ủ trong tủ ấm ở 37ºC trong 18 – 24h (đối với vi khuẩn) và ở 28 – 300C trong 24 – 48h (đối với vi nấm). Mỗi mẫu được thử song song trên 3 đĩa với cùng 1 loại VSV kiểm định.
- Đánh giá kết quả: Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẹp Palmer có độ chính xác 0,02 mm. Kết quả được đánh giá dựa trên đường kính vòng vô khuẩn và được xử lý theo công thức:
21 1 1 1 ( ) 1 n n i i i i D D D D s n n Trong đó:
D (mm): Đường kính trung bình vòng vô khuẩn
i
D (mm): Đường kính vòng vô khuẩn thứ i s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh
n: Số thực nghiệm tiến hành song song (thông thường n = 3)