Nghiên cứu trích ly hoạt chất từ lá hoàn ngọc bằng kỹ thuật co2 siêu tới hạn và thử nghiệm hoạt tính sinh học

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -o0o - NGUYỄN PHAN HỒNG MAI NGHIÊN CỨU TRÍCH LY HOẠT CHẤT TỪ LÁ HỒN NGỌC BẰNG KỸ THUẬT CO2 SIÊU TỚI HẠN VÀ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC STUDY ON EXTRACTING ACTIVE INGREDIENTS FROM HOAN NGOC LEAVES BY SUPERCRITICAL CO2 TECHNIQUE AND BIOACTIVITY TESTING Chuyên ngành: KỸ THUẬT HÓA HỌC Mã số: 8.52.03.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2023 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Cơng trình hoàn thành tại: Trường Đại Học Bách Khoa – ĐHQG-HCM Cán hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Hữu Hiếu Cán chấm nhận xét 1: TS Hoàng Minh Nam Cán chấm nhận xét 2: TS Nguyễn Quốc Thắng Luận văn thạc sĩ bảo vệ Trường Đại Học Bách Khoa - ĐHQG TP.HCM, ngày 13 tháng 01 năm 2023 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: Chủ tịch: PGS.TS Huỳnh Kỳ Phương Hạ Ủy viên phản biện 1: TS Hoàng Minh Nam Ủy viên phản biện 2: TS Nguyễn Quốc Thắng Ủy viên: TS Huỳnh Ngọc Oanh Thư ký: TS Nguyễn Tiến Giang Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC (Họ tên chữ ký) (Họ tên chữ ký) i NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Nguyễn Phan Hồng Mai MSHV: 1970649 Ngày, tháng, năm sinh: 24/01/1994 Nơi sinh: Đồng Nai Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học Mã số: 8520301 I TÊN ĐỀ TÀI Tên tiếng Việt: Nghiên cứu trích ly hoạt chất từ Hồn Ngọc kỹ thuật CO2 siêu tới hạn thử nghiệm hoạt tính sinh học Tên tiếng Anh: Study on extracting active ingredients from Hoan Ngoc leaves by supercritical CO2 technique and bioactivity testing II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: 2.1 Tổng quan: Hồn Ngọc, polyphenol, hoạt tính sinh học Hồn Ngọc, kỹ thuật trích ly CO2 siêu tới hạn, quy hoạch thực nghiệm, phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học 2.2 Thực nghiệm  Trích ly polyphenol từ Hoàn Ngọc kỹ thuật CO2 siêu tới hạn;  Khảo sát ảnh hưởng yếu tố áp suất, thời gian, thể tích ethanol nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol;  Khảo sát ảnh hưởng đồng thời bốn yếu tố áp suất, thời gian, thể tích ethanol nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol phương pháp đáp ứng bề mặt thiết kế theo mơ hình Box−Behnken;  Đánh giá bề mặt nguyên liệu trước sau trích ly kính hiển vi điện tử quét;  Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa, kháng khuẩn kháng ung thư III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 09/2022 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 12/2022 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS TS NGUYỄN HỮU HIẾU TP HCM, ngày tháng năm 2022 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Trưởng PTN TĐ ĐHQG TP.HCM CNHH & DK TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tác giả xin trân trọng cảm ơn đến người thân gia đình ln quan tâm, động viên tạo điều kiện thuận lợi cho tác giả suốt thời gian thực luận văn Tác giả xin chân thành cảm ơn thầy PGS.TS Nguyễn Hữu Hiếu tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho tác giả suốt trình học tập thực luận văn Tác giả xin gửi lời cảm ơn đến học viên, nghiên cứu viên bạn sinh viên Phịng thí nghiệm Trọng điểm ĐHQG-HCM Cơng nghệ Hóa học & Dầu khí (Key CEPP Lab), Trường Đại Học Bách Khoa - ĐHQG TP.HCM hỗ trợ tác giả suốt trình học tập nghiên cứu Tác giả Nguyễn Phan Hồng Mai iii TĨM TẮT Trong luận văn này, cao trích thu nhận từ Hồn Ngọc trích ly kỹ thuật trích ly CO2 siêu tới hạn Hàm lượng polyphenol cao trích xác định phương pháp quang phổ hấp thu phân tử (ultraviolet–visible spectroscopy-UV-vis) Ảnh hưởng điều kiện trích ly áp suất, thời gian, thể tích ethanol nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol khảo sát phương pháp luân phiên biến để tìm khoảng biến thiên phù hợp Sau đó, tiến hành khảo sát đồng thời quy hoạch thí nghiệm sử dụng mơ hình Box–Behnken Số liệu xử lý phần mềm Design Expert 11.0 để tìm điều kiện trích ly cho hàm lượng polyphenol cao Hình thái cấu trúc bề mặt nguyên liệu trước sau trích ly phân tích kính hiển vi điện tử quét Polyphenol thu nhận điều kiện tối ưu khảo sát hoạt tính sinh học thơng qua khả kháng oxy hóa sử dụng phương pháp bắt gốc tự 1,1–diphenyl– 1–picrylhydrazyl với đối chứng dương axit ascorbic, khả kháng khuẩn cao trích thử nghiệm Escherichia coli Staphylococcus aureus phương pháp đo đường kính vịng kháng khuẩn ức chế tế bào ung thư hai dòng tế bào ung thư dòng tế bào ung ung thư phổi (A549) ung thư gan (MCF-7) phương pháp tetrazolium iv ABSTRACT In this thesis, the extract obtained from Hoan Ngoc leaves was extracted by supercritical CO2 extraction technique The polyphenol content in the extract was determined by ultraviolet–visible spectroscopy The influence of each extraction condition such as pressure, time, ethanol:material ratio and temperature on polyphenol content was investigated by the method of alternating each variable to find a suitable variation range Then, conduct a simultaneous survey by planning an experiment using the Box–Behnken model Data were processed with Design Expert 11.0 software to find extraction conditions for the highest polyphenol content Surface structure morphology of raw materials before and after extraction was analyzed by scanning electron microscopy Polyphenol obtained at optimal conditions were investigated for their biological activity through antioxidant capacity using the free radical scavenging method 1,1– diphenyl–1–picrylhydrazyl with a positive control of ascorbic acid, the antibacterial activity of the extract was tested on Escherichia coli and Staphylococcus aureus by antibacterial inhibition diameter measurement, and cytotoxicity with A549 and MCF-7 cell line by MTT assay v LỜI CAM ĐOAN Tác giả xin cam đoan luận văn cơng trình nghiên cứu thực cá nhân tác giả thực hướng dẫn hai thầy TS Hoàng Minh Nam PGS TS Nguyễn Hữu Hiếu, Phịng thí nghiệm Trọng điểm ĐHQG HCM Cơng nghệ Hóa học Dầu khí (Key CEPP Lab), Trường Đại học Bách Khoa - ĐHQG TP HCM Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn hồn tồn trung thực, chưa cơng bố cơng trình khác trước Mọi giúp đỡ cho việc hoàn thành luận văn cảm ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Tác giả xin chịu trách nhiệm nghiên cứu Tác giả Nguyễn Phan Hồng Mai vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN iii TÓM TẮT iv ABSTRACT v LỜI CAM ĐOAN vi MỤC LỤC vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT xii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Hoàn Ngọc Giới thiệu chung Đặc điểm hình thái Thành phần hóa học Công dụng 1.2 Hoạt tính sinh học Hoàn Ngọc Kháng oxy hóa Kháng ung thư Kháng khuẩn 10 1.3 Phương pháp trích ly 11 Kỹ thuật lưu chất siêu tới hạn 13 Nguyên lý hoạt động biến đổi trạng thái CO2 trình trích ly 14 Hệ thống trích ly CO2 siêu tới hạn 15 1.4 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 16 Trong nước 16 Ngoài nước 17 1.5 Mục tiêu, nội dung, phương pháp nghiên cứu, tính đóng góp luận văn 18 Mục tiêu 18 Nội dung nghiên cứu 19 Phương pháp nghiên cứu 19 Tính 23 Đóng góp 23 vii CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 24 2.1 Nguyên liệu, hoá chất, dụng cụ, thiết bị địa điểm thực 24 Nguyên liệu 24 Hoá chất 24 Thiết bị, dụng cụ 25 Địa điểm thực 26 2.2 Thí nghiệm 26 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố đến hàm lượng polyphenol 26 Phương pháp phân tích cấu trúc nguyên liệu trước sau trích ly 31 Thử nghiệm hoạt tính sinh học cao trích 31 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33 3.1 Ảnh hưởng yếu tố đến hàm lượng polyphenol 33 Ảnh hưởng yếu tố 33 Khảo sát ảnh hưởng đồng thời yếu tố đến hàm lượng polyphenol 36 3.2 Bề mặt nguyên liệu trước sau trích ly 44 3.3 Hoạt tính sinh học cao trích 45 Hoạt tính kháng oxy hố 45 Hoạt tính kháng khuẩn 46 Hoạt tính ức chế tế bào ung thư 47 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN 49 4.1 Kết luận 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC 56 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: (a) Cây, (b) hoa (c) Hoàn Ngọc Hình 1.2: Phân loại polyphenol Hình 1.3: Cơng thức hóa học axit gallic Hình 1.4: Cơng thức hóa học axit chlorogenic Hình 1.5: Nguyên nhân gây gốc tự Hình 1.6: Phản ứng trung hịa gốc tự axit ascorbic Hình 1.7: Cơ chế kháng khuẩn hợp chất 10 Hình 1.8: Giản đồ pha CO2 15 Hình 1.9: (a) Thiết bị chính, (b) bơm đồng dung mơi, (c) điều khiển (d) hệ thống làm lạnh 16 Hình 1.10: Mơ hình Box-Behnken 20 Hình 1.11: Sơ đồ nguyên lý UV-vis 20 Hình 1.12: Nguyên tắc hoạt động máy FE-SEM 21 Hình 1.13: Phản ứng màu DPPH với chất kháng oxy hoá 22 Hình 2.1: Bột Hồn Ngọc 24 Hình 2.2: Quy trình thu nhận cao trích từ Hoàn Ngọc kỹ thuật CO2 siêu tới hạn 26 Hình 3.1: Ảnh hưởng áp suất đến hàm lượng polyphenol 33 Hình 3.2: Ảnh hưởng thời gian đến hàm lượng polyphenol 34 Hình 3.3: Ảnh hưởng thể tích ethanol đến hàm lượng polyphenol 35 Hình 3.4: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol 36 Hình 3.5: Ảnh hưởng đồng thời áp suất thời gian đến hàm lượng polyphenol 39 Hình 3.6: Ảnh hưởng đồng thời áp suất thể tích đến hàm lượng polyphenol 40 Hình 3.7: Ảnh hưởng đồng thời áp suất nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol 41 Hình 3.8: Ảnh hưởng đồng thời thời gian nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol 42 Hình 3.9: Ảnh hưởng đồng thời thể tích ethanol nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol 43 Hình 3.10: Hàm lượng polyphenol mẫu tối ưu mẫu đối chứng 44 Hình 3.11: Hình ảnh FE−SEM bột Hoàn Ngọc trước (a) (b) sau trích ly 45 ix [16] H Mai et al , “Lignans and other constituents from the roots of the Vietnamese medicinal plant Pseuderanthemum palatiferum,” Planta medica, vol 77, no 9, pp 951-954, 2011 [17] V Bắc “Nghiên cứu tách chiết tác dụng tăng cường miễn dịch polysaccharide từ thuốc xn hoa Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk,” Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, vol 16, vol 2, pp 327-335, 2018 [18] P Padee et al., "Hypoglycemic effect of a leaf extract of Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk in normal and streptozotocin-induced diabetic rats," Journal of Ethnopharmacology, vol 132, vol 2, pp 491-496, 2010 [19] P Padee et al., “,” Hypoglycemic effect of a leaf extract of Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk in normal and streptozotocininduced diabetic rats," Journal of ethnopharmacology, vol 132, vol 2, pp 491-496, 2010 [20] S Nualkaew et al., “Hypoglycemic activity in diabetic rats of stigmasterol and sitosterol-3-O-D-glucopyranoside isolated from Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk leaf extract,” Journal of Medicinal Plants Research, vol 9, no 20, pp 629- 635, 2015 [21] T Dat et al., “Optimization of Triterpenoid Extracted from Vietnamese Ganoderma lucidum via Supercritical Extraction Method and Biological Tests,” Separation Science and Technology, vol 57, no 14, pp 1-16, 2022 [22] T Hiếu, Phân tích trắc quang Phổ hấp thụ UV-Vis, ĐHQG Hà Nội, 2003 [23] P Luận Phương pháp phân tích quang phổ phân tử NXB Khoa học Hà Nội, 2014 [24] T Dat et al., “The Application of Ethanolic Ultrasonication to Ameliorate the Triterpenoid Content Extracted from Vietnamese Ganoderma lucidum with the Examination by Gas Chromatography,” ChemistrySelect, vol 6, no 10, pp 25902606, 2021 52 [25] T Dat et al., “Optimization of Triterpenoid Extraction from Ganoderma lucidum by Ethanol‐Modified Supercritical Carbon Dioxide andthe Biological Properties of the Extract,” ChemistrySelect, vol 7, no 8, 2022 [26] M Gao et al., “A theoretical and experimental study: the influence of different standards on the determination of total phenol content in the Folin–Ciocalteu assay,” Journal of Food Measurement and Characterization, vol 13, no 2, pp 1349-1356, 2019 [27] M Bubalo et al., “New perspective in extraction of plant biologically active compounds by green solvents,” Food and Bioproducts Processing, vol 109, pp 52-73, 2018 [28] N Putra et al., “Effects of process parameters on peanut skins extract and CO2 diffusivity by supercritical fluid extraction,” IOP Conference Series: Materials Science and Engineering, vol 334, pp 1-10, 2018 [29] K Duba and L Fiori “Supercritical CO2 extraction of grape seed oil: Effect of process parameters on the extraction kinetics,” The Journal of Supercritical Fluids, vol 98, pp 33-43, 2015 [30] S Pourmortazavi and S Hajimirsadeghi “Supercritical fluid extraction in plant essential and volatile oil analysis,” Journal of chromatography A , vol 1163, pp 2-24, 2007 [31] P Uwineza and A Waśkiewicz “Recent Advances in Supercritical Fluid Extraction of Natural Bioactive Compounds from Natural Plant Materials,” Molecules, vol 25, no 17, p 3847, 3847 [32] A Natolino et al., “Supercritical carbon dioxide extraction of pomegranate (Punica granatum L.) seed oil: Kinetic modelling and solubility evaluation,” The Journal of Supercritical Fluids , vol 151, pp 30-39, 2019 [33] T Gong et al., “ Supercritical CO2 fluid extraction, physicochemical properties, antioxidant activities and hypoglycemic activity of polysaccharides derived from fallen Ginkgo leaves,” Food Bioscience, vol 42, pp 101153, 2021 53 [34] C KYi-Ching “Kinetic models for ultrasound-assisted extraction of water-soluble components and polysaccharides from medicinal fungi,” Food Bioprocess Technol, vol 6, pp 2659-2665, 2013 [35] C Carail “Effects of high power ultrasound on all-E-β-carotene, newly formed compounds analysis by ultra-high-performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry,” Ultrasonics Sonochemistry, vol 26, pp 200-209, 2015 [36] N Hằng et al., “Khả bắt gốc tự DPPH lực khử Nam sâm bị Cần Giờ, TP Hồ Chí Minh,” Tạp chí Khoa học, vol 12, no 90, 2016 [37] Y Zhou et al., “Antibacterial activity and mechanism of green tea polysaccharide conjugates against Escherichia coli,” Industrial Crops and Products, vol 152, pp 112464, 2020 [38] N Malanovic et al., “Octenidine: novel insights into the detailed killing mechanism of Gram-negative bacteria at a cellular and molecular level,” International Journal of Antimicrobial Agents, vol 56, no 5, pp 106146, 2020 [39] H Rostami and S Gharibzahedi “Cellulase-assisted extraction of polysaccharides from Malva sylvestris: Process optimization and potential functionalities,” International journal of biological macromolecules, vol 101, pp 196-206, 2017 [40] M Ana “Plant Secondary Metabolites as Anticancer Agents: Successes in Clinical Trials and Therapeutic Application,” International journal of molecular sciences, vol 19, no 1, pp 263, 2018 [41] G Preethi et al., “An overview on the role of dietary phenolics for the treatment of cancers,” Nutrition journal, vol 15, no 1, pp 1-16, 2016 [42] Y Xiao-Jian et al., “Triterpenoids as reversal agents for anticancer drug resistance treatment,” Drug Discovery Today, vol 19, no 4, pp 482-488, 2014 [43] B Naveena et al., “Chemoprevention of Colon Carcinogenesis by Oleanolic Acid and Its Analog in Male F344 Rats and Modulation of COX-2 and Apoptosis in 54 Human Colon HT-29 Cancer Cells,” Pharmaceutical Research, vol 25, no 9, pp 2151-2157, 2008 [44] K Yongjun et al., “Antioxidant activity of polysaccharide extracted from Ganoderma lucidum using response surface methodology,” International Journal of Biological Macromolecules, vol 72, pp 151-157, 2015 55 PHỤ LỤC 56 Phụ lục 1: Số liệu khảo sát ảnh hưởng yếu tố đồng thời yếu tố đến hàm lượng polyphenol Phụ lục 1.1: Số liệu khảo sát ảnh hưởng yếu tố Bảng Phụ lục 1.1: Số liệu ảnh hưởng tỷ áp suất Áp suất (MPa) Hàm lượng polyphenol (mg/g) Hàm lượng polyphenol trung bình (mg/g) Sai số 0,882 20 0,985 0,923 0,054 1,556 0,043 1,944 0,018 1,977 0,030 1,151 0,045 0,777 0,044 0,902 1,584 25 1,577 1,506 1,933 30 1,965 1,935 1,998 35 1,990 1,942 1,119 40 1,132 1,202 0,766 45 0,825 0,739 57 Bảng Phụ lục 1.2: Số liệu ảnh hưởng tỷ thời gian Thời gian Hàm lượng polyphenol (mg/g) Hàm lượng polyphenol trung bình (mg/g) Sai số 0,971 0,5 0,951 0,981 0,018 1,849 0,057 2,657 0,1101 5,152 0,064 0,987 1,789 1,0 1,856 1,901 2,662 1,5 2,764 2,544 5,134 2,0 5,223 5,098 2,867 0,102 2,5 2,778 2,875 2,981 0,877 3,0 0,897 0,873 0,845 58 0,026 Bảng Phụ lục 1.3: Số liệu ảnh hưởng thể tích ethanol Thể tích ethanol (mL) Hàm lượng polyphenol (mg/g) Hàm lượng polyphenol trung bình (mg/g) Sai số 0,054 0,046 0,053 0,010 0,466 0,032 1,108 0,073 0,059 0,437 0,460 0,505 1,035 10 1,109 1,180 2,677 15 2,682 2,619 0,105 2,498 5,323 20 5,549 5,323 0,169 1,929 0,047 5,219 1,952 25 1,875 1,960 59 Bảng Phụ lục 1.4: Số liệu ảnh hưởng nhiệt độ Nhiệt độ (oC) Hàm lượng polyphenol (mg/g) Hàm lượng polyphenol trung bình (mg/g) Sai số 1,933 40 1,875 1,913 0,033 3,529 0,078 7,827 0,118 6,417 0,086 3,943 0,051 2,874 0,122 1,932 3,619 50 3,482 3,487 7,803 60 7,956 7,723 6,393 70 6,512 6,346 3,988 80 3,889 3,952 2,894 90 2,985 2,743 PL1.2 Khảo sát ảnh hưởng đồng thời điều kiện Pl 1.2.1 Kết thiết kế thí nghiệm theo phần mềm Design Expert 11 60 Hình PL 1.2.1: Bố trí thí nghiệm theo mơ hình Box-Behnken 61 Hình PL 1.2.2: Lựa chọn lamda cho mơ hình Hình PL 1.2.3: Kết phân tích ANOVA Hình PL 1.2.4: Điều điện phù hợp để hàm lượng polyphenol cao 62 PL1.3 Số liệu đường chuẩn axit gallic Bảng PL 3.1 Kết độ hấp thu axit gallic Nồng độ (mg/L) Độ hấp thu 20 0,11532 40 0,17556 60 0,21446 80 0,26139 100 0,32525 Phụ lục 2: Số liệu thử nghiệm hoạt tính sinh học cao trích Phụ lục 2.1: Số liệu thử nghiệm khả bắt gốc tự DPPH Bảng Phụ lục 2.1.1 Số liệu khả bắt gốc tự DPPH axit ascorbic Nồng độ (µg/mL) Phần trăm bắt gốc tự DPPH 32,19 10 45,68 15 61,24 20 77,89 25 93,73 Bảng Phụ lục 3.1.2 Số liệu khả bắt gốc tự DPPH cao trích Nồng độ (µg/mL) Phần trăm bắt gốc tự DPPH 63 100 6,32 200 17,96 300 28,52 400 44,36 500 61,54 600 82,69 64 Phụ lục 2.3: Kết thử nghiệm hoạt tính kháng ung thư 65 PHẦN LÝ LỊCH TRÍCH NGANG Họ tên: NGUYỄN PHAN HỒNG MAI Ngày, tháng, năm sinh: 24/01/1994 Nơi sinh: Đồng Nai Địa liên lạc: K4/88B Tân Bình, P Bửu Hồ, TP Biên Hòa, Tỉnh Đồng Nai Số điện thoại: 0779162636 Email: nphongmai.1994@gmail.com QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO  2012-2016: Khoa Sinh học – Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên ĐHQG-HCM  12/2019-nay: Khoa Kỹ thuật Hóa học, Trường Đại học Bách khoa, ĐHQG-HCM Q TRÌNH CƠNG TÁC  2018-nay: công ty sơn Sento