(Luận văn thạc sĩ) Định danh và thử nghiệm hoạt tính sinh học của nấm Thượng hoàng (Phellinus Linteus)

(Luận văn thạc sĩ) Định danh và thử nghiệm hoạt tính sinh học của nấm Thượng hoàng (Phellinus Linteus)(Luận văn thạc sĩ) Định danh và thử nghiệm hoạt tính sinh học của nấm Thượng hoàng (Phellinus Linteus)(Luận văn thạc sĩ) Định danh và thử nghiệm hoạt tính sinh học của nấm Thượng hoàng (Phellinus Linteus)(Luận văn thạc sĩ) Định danh và thử nghiệm hoạt tính sinh học của nấm Thượng hoàng (Phellinus Linteus)(Luận văn thạc sĩ) Định danh và thử nghiệm hoạt tính sinh học của nấm Thượng hoàng (Phellinus Linteus)(Luận văn thạc sĩ) Định danh và thử nghiệm hoạt tính sinh học của nấm Thượng hoàng (Phellinus Linteus)(Luận văn thạc sĩ) Định danh và thử nghiệm hoạt tính sinh học của nấm Thượng hoàng (Phellinus Linteus)(Luận văn thạc sĩ) Định danh và thử nghiệm hoạt tính sinh học của nấm Thượng hoàng (Phellinus Linteus)(Luận văn thạc sĩ) Định danh và thử nghiệm hoạt tính sinh học của nấm Thượng hoàng (Phellinus Linteus)(Luận văn thạc sĩ) Định danh và thử nghiệm hoạt tính sinh học của nấm Thượng hoàng (Phellinus Linteus)(Luận văn thạc sĩ) Định danh và thử nghiệm hoạt tính sinh học của nấm Thượng hoàng (Phellinus Linteus)(Luận văn thạc sĩ) Định danh và thử nghiệm hoạt tính sinh học của nấm Thượng hoàng (Phellinus Linteus)(Luận văn thạc sĩ) Định danh và thử nghiệm hoạt tính sinh học của nấm Thượng hoàng (Phellinus Linteus)(Luận văn thạc sĩ) Định danh và thử nghiệm hoạt tính sinh học của nấm Thượng hoàng (Phellinus Linteus)(Luận văn thạc sĩ) Định danh và thử nghiệm hoạt tính sinh học của nấm Thượng hoàng (Phellinus Linteus)(Luận văn thạc sĩ) Định danh và thử nghiệm hoạt tính sinh học của nấm Thượng hoàng (Phellinus Linteus)(Luận văn thạc sĩ) Định danh và thử nghiệm hoạt tính sinh học của nấm Thượng hoàng (Phellinus Linteus)(Luận văn thạc sĩ) Định danh và thử nghiệm hoạt tính sinh học của nấm Thượng hoàng (Phellinus Linteus)(Luận văn thạc sĩ) Định danh và thử nghiệm hoạt tính sinh học của nấm Thượng hoàng (Phellinus Linteus)(Luận văn thạc sĩ) Định danh và thử nghiệm hoạt tính sinh học của nấm Thượng hoàng (Phellinus Linteus)(Luận văn thạc sĩ) Định danh và thử nghiệm hoạt tính sinh học của nấm Thượng hoàng (Phellinus Linteus)(Luận văn thạc sĩ) Định danh và thử nghiệm hoạt tính sinh học của nấm Thượng hoàng (Phellinus Linteus)(Luận văn thạc sĩ) Định danh và thử nghiệm hoạt tính sinh học của nấm Thượng hoàng (Phellinus Linteus)(Luận văn thạc sĩ) Định danh và thử nghiệm hoạt tính sinh học của nấm Thượng hoàng (Phellinus Linteus)(Luận văn thạc sĩ) Định danh và thử nghiệm hoạt tính sinh học của nấm Thượng hoàng (Phellinus Linteus)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HOÀNG VÂN THANH ĐỊNH DANH VÀ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA NẤM THƯỢNG HOÀNG (PHELLINUS LINTEUS) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên, năm 2021 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HOÀNG VÂN THANH ĐỊNH DANH VÀ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA NẤM THƯỢNG HOÀNG (PHELLINUS LINTEUS) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Minh Huyền TS Hoàng Phú Hiệp Thái Nguyên, năm 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nội dung luận văn kết nghiên cứu hướng dẫn trực tiếp TS Nguyễn Thị Minh Huyền TS Hồng Phú Hiệp Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết sử dụng luận văn trung thực đồng ý cán hướng dẫn nhóm nghiên cứu XÁC NHẬN Tác giả CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN H Hoàng Vân Thanh i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Minh Huyền, cán Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Cơ ln tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ em, người bảo, dìu dắt em từ ngày đầu hoàn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn TS Hoàng Phú Hiệp, người thầy bảo cho em kiến thức chuyên nghành, kiến thức sâu rộng ứng dụng thực tế để em ứng dụng vào trình thực luận văn Em xin chân thành cảm ơn thầy cô cán Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm, Đại học Thái Nguyên giúp đỡ, truyền đạt cho em kinh nghiệm nghiên cứu tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành tốt luận văn Em xin cảm ơn đề tài cấp nhà nước mã số ĐT.04.18/CNSHCB cung cấp kinh phí thực luận văn Em xin gửi lòng biết ơn sâu nặng lớn lao tới gia đình em, người thân em, người hy sinh vật chất tinh thần cho em chỗ dựa vững chắc, sức mạnh nguồn động viên to lớn Thái Nguyên, tháng năm 2021 Tác giả Hoàng Vân Thanh ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nấm Thượng hoàng giá trị dinh dưỡng nấm Thượng hồng 1.2 Thành phần hố học hoạt tính nấm Thượng hồng 1.3 Phân loại học phân tử nấm Bảng 1.1 Trình tự cặp mồi ITS phổ biến [4] 11 1.4 Những nghiên cứu nấm Thượng hoàng 12 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Vật liệu, địa điểm, thời gian nghiên cứu 16 2.1.1 Vật liệu 16 2.1.2 Hoá chất, thiết bị 16 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 18 2.2.1 Thu thập phân lập giống nấm Thượng hoàng 18 2.2.2 Cấy chuyển nhân giống 18 2.2.3 Nghiên cứu phân loại nấm 19 2.2.4 Phương pháp xác định khả tiết enzyme ngoại bào nấm Thượng hoàng 20 iii 2.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện môi trường đến phát triển sợi nấm Thượng hoàng 21 2.2.6 Chiết bột sinh khối nấm Thượng hoàng 22 2.2.7 Thử nghiệm hoạt tính tế bào ung thư vú (BT474) tế bào thận người (HEK293) 23 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Thu thập định danh mẫu nấm Thượng hoàng đoạn gen ITS 26 3.1.1 Thu thập mẫu nấm Thượng hoàng 26 3.1.2 Định danh mẫu nấm Thượng hoàng đoạn gen ITS 28 3.2 Thu sinh khối nấm Thượng hoàng 30 3.2.1 Xác định khả sinh enzyme ngoại bào chủng nấm Thượng hoàng PLUS 30 3.2.2 Xác định môi trường tối ưu cho nuôi cấy nấm Thượng hoàng 33 3.2.3 Tách chiết sinh khối nấm Thượng hồng với cồn nước nóng 38 3.3 Hoạt tính sinh học dịch chiết cồn nước nóng sinh khối nấm Thượng hồng PLUS ni cấy dòng tế bào ung thư vú BT474 tế bào thận người HEK293 39 3.3.1 Ảnh hưởng dịch chiết nấm Thượng hồng dịng tế bào ung thư vú BT474 39 3.3.2 Ảnh hưởng dịch chiết nấm Thượng hoàng dịng tế bào phơi thận người HEK 43 3.3.3 Đánh giá tác dụng dịch chiết sinh khối nấm thượng hoàng lên tế bào BT 474 HEK 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ BLAST Basic Local Alignment Search Too bp Base pair CMC Carboxymethyl cellulose cs Cộng DC Đối chứng DNA Deoxyribonucleic acid DMEM Dullbecco Modified Eagle Medium HEK 293 Human embryonic kidney 293 HLKHCNVN Học liệu khoa học công nghệ Việt Nam ICR Intelligent character recognition IGS Intergenic Spacer ITS Internal Transcribed Spacer MAPK Mitogen – activated protein kinase PL Phellinus linteus PPAR Peroxisome proliferator – activated receptors RNA Ribonucleic acid ROS Reactive oxygen species PDA Potato Dextrose Agar iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Ảnh hưởng nguồn carbon đến phát triển sợi nấm 33 sinh khối nấm PL PLUS 33 Bảng 3.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến phát triển sợi nấm 34 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển sợi nấm 35 môi trường lỏng 35 Bảng 3.4 Ảnh hưởng độ pH đến phát triển sợi nấm 36 môi trường lỏng 36 Bảng 3.5 Ảnh hưởng tốc độ lắc đến sinh khối nấm Thượng hoàng 38 Bảng 3.6 Kết chiết thể nấm sinh khối nấm cồn nước 39 Bảng 3.7 Kết đo độ hấp phụ tế bào BT474 ủ với dịch chiết sinh khối nấm cồn 40 Bảng 3.8 Kết đo độ hấp phụ tế bào BT474 ủ với dịch chiết sinh khối nấm nước nóng 42 Bảng 3.9 Kết đo độ hấp phụ tế bào HEK293 ủ với dịch chiết sinh khối nấm cồn 44 Bảng 3.10 Kết đo độ hấp phụ tế bào HEK293 ủ với dịch chiết sinh khối nấm nước nóng 46 Bảng 3.11 Kết đo độ hấp phụ tế bào HEK293 BT474 ủ với dịch chiết sinh khối nấm cồn 48 Bảng 3.12 Kết đo độ hấp phụ tế bào HEK293 BT474 ủ với dịch chiết sinh khối nấm nước nóng 50 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Nấm Phellinus linteus tự nhiên [55] Hình 1.2 Cấu trúc rDNA nấm Saccharomyces cerevisiae [10] 10 Hình 1.3 Các trình tự mồi thơng thường để khuếch đại vùng gen ITS [4] 11 Hình 2.1: Lọc dịch nấm Thượng hồng 22 Hình 2.2 Cấu trúc MTS tetrazolium sản phẩm formazan [53] 24 Hình 2.3 Ảnh hưởng số lượng tế bào đến độ hấp phụ bước sóng 490 nm đo CellTiter 96®Aqueous One Solution Assay [53] 25 Hình 3.1 Hình ảnh nấm địa điểm thu mẫu 26 Hình 3.2 Hình ảnh nấm ni mơi trường khoai tây (10 ngày) 27 Hình 3.3 Sản phẩm PCR đoạn gen ITS 28 Hình 3.4 Trình tự đoạn gen ITS chủng Phellinus linteus thu vùng Madagui, huyện Đạ Huoai, tỉnh Lâm Đồng 30 Hình 3.5 Khả phân hủy chất CMC sinh enzyme cellulase ngoại bào chủng nấm Thượng hoàng PLUS 31 Hình 3.6 Khả tiết amylase ngoại bào chủng nấm PL PLUS 32 Hình 3.7 Khả phân hủy chất skim milk sinh enzyme protease ngoại bào chủng nấm PL PLUS 32 Hình 3.8 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến phát triển 33 Hình 3.9 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến phát triển sinh khối nấm PLUS 35 Hình 3.10 Ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển sinh khối nấm PLUS 36 Hình 3.11 Ảnh hưởng pH mơi trường đến phát triển sinh khối nấm PLUS 37 Hình 3.12 Ảnh hưởng tốc độ lắc đến phát triển sinh khối nấm PL PLUS 38 Hình 3.13 Đồ thị mơ tả độ hấp phụ tế bào BT474 ủ với dịch chiết 40 sinh khối nấm cồn 40 vi Hình 3.14 Hình ảnh tế bào BT474 ủ dịch sinh khối nấm chiết cồn 41 Hình 3.15 Đồ thị mơ tả độ hấp phụ tế bào BT474 ủ với dịch chiết sinh khối nấm nước nóng 42 Hình 3.16 Hình ảnh tế bào BT474 ủ với dịch sinh khối nấm 43 chiết nước nóng 43 Hình 3.17 Đồ thị mơ tả độ hấp phụ tế bào HEK293 ủ với dịch chiết chiết sinh khối nấm cồn 44 Hình 3.18 Hình ảnh tế bào HEK293 ủ với dịch chiết 45 sinh khối nấm cồn 45 Hình 3.19 Đồ thị mơ tả độ hấp phụ tế bào HEK293 ủ với dịch chiết thể nấm nước nóng.48 h 47 Hình 3.20 Hình ảnh tế bào HEK293 ủ với dịch sinh khối nấm 47 chiết nước nóng 47 Hình 3.21 Đồ thị so sánh độ hấp phụ tế bào BT474 HEK293 ủ với dịch chiết sinh khối nấm cồn 49 Hình 3.22 Đồ thị so sánh độ hấp phụ tế bào BT474 HEK293 ủ với dịch chiết sinh khối nấm nước nóng 50 0,15 mg /ml 0,3 mg /ml 0,6 mg /ml 1,2 mg /ml 24 h 48 h Hình 3.18 Hình ảnh tế bào HEK293 ủ với dịch chiết sinh khối nấm cồn Nhận xét: - Hình ảnh tế bào: Sau 24 nồng độ khác mật độ tế bào đồng dều nồng độ 0,15 mg/ml 0,3 mg/ml tế bào tương đồng nhau, hình thái khơng rõ nét Cịn ủ tế bào với nồng độ dịch chiết 0,6 mg/ml 1,2 mg/ml hình thái tế bào rõ nét hơn, tế bào tăng kích thước chân tế bào hình thành nhiều Sau 48 giờ, ủ tế bào với dịch chiết nồng độ 0,15 mg/ml 0,3 mg/ml hình ảnh tế bào giống hình thái số lượng, hình thái khơng rõ nét Còn ủ tế bào với dịch chiết nồng độ 0,6 mg/ml 1,2 mg/ml hình thái tế bào rõ nét hơn, đặc biệt nồng độ 1,2 mg/ml tế bào tụ thành mảng, chân tế bào quan sát nhiều rõ ràng Đồ thị: Độ thị độ hấp phụ mẫu DC1, DC2 DC4 cho kết tương tự Trong sau 24 tất mẫu đo, độ hấp phụ tế bào sau 48 giờ, độ hấp phụ mẫu tế bào ủ với nồng độ dịch chiết sinh khối chiết cồn độ hấp phụ tăng mạnh, đặc biệt nồng độ 0,6 mg/ml So sánh với mẫu đối chứng DC1, DC2 DC4 chứng tỏ dịch chiết sinh khối nấm cồn có tác dụng tốt lên dịng tế bào thường HEK293, không ức chế tế bào mà tế bào phát triển 3.3.2.2 Ảnh hưởng dịch sinh khối nấm chiết nước nóng lên tế bào HEK293 45 Sử dụng phương pháp MTS với tế bào HEK293 ủ với dịch chiết sinh khối nấm nước nóng, đo độ hấp phụ bước sóng 490 nm đĩa 96 giếng Kết thu bảng 3.10 hình 3.19 Bảng 3.10 Kết đo độ hấp phụ tế bào HEK293 ủ với dịch chiết sinh khối nấm nước nóng Nồng độ dịch chiết (mg/ml) Thời gian 24 48 DC3 (mg/ml) 0,425 (mg/ml) 0,85 (mg/ml) 1,7 (mg/ml) 3,4 (mg/ml) 1,03 ± 0,05 0,73 ± 0,05 0,86 ± 0,00 0,61 ± 0,03 0,51 ± 0,00 0,81 ± 0,07 1,28 ± 0,06 1,02 ± 0,04 0,91 ± 0,04 0,68 ± 0,00 0,59 ± 0,05 0,68 ± 0,06 DC3: Đối chứng với nước cất Khả hấp phụ tế bào HEK293 ủ với dịch chiết sinh khối nấm Thượng hoàng thể hình 3.19 1,80 Độ hấp phụ bước song 490nm 1,60 1,40 1,20 1,00 24 0,80 48 0,60 0,40 0,20 0,00 DC3 3,4 (mg/ml) 1,7 (mg/ml) 0,85 (mg/ml) 0,425 (mg/ml) (mg/ml) Hình 3.19 Đồ thị mô tả độ hấp phụ tế bào HEK293 ủ với dịch chiết thể nấm nước nóng DC3: mẫu tế bào ủ với 10µl nước cất 46 0,425 mg /ml 0,85 mg /ml 1,7 mg /ml 3,4 mg /ml 24 h 48 h Hình 3.20 Hình ảnh tế bào HEK293 ủ với dịch sinh khối nấm chiết nước nóng Nhận xét: - Sau 24 giờ: Ở nồng độ 0,425 mg/ml mật độ tế bào nhiều, hình thái tế bào rõ ràng, ủ tế bào với dịch chiết có nồng độ cao tế bào phát triển tốt trơng dày Nhưng đến nồng độ 3,4 mg/ml tế bào dày có nhiều tế bào thay đổi hình thái trở nên co trịn lại quan sát chân tế bào hình thành - Sau 48 giờ: nồng độ đầu tế bào có kích thước, hình thái tế bào ko rõ ràng Tạinồng độ 1,7 mg/ml tế bào phát triển rõ mọc dày Tại nồng độ 3,4 mg/ml quan sát thấy tế bào dày hình thái tế bào co trịn không quan thấy chân tế bào mọc - Đồ thị: Sau ủ với dịch chiết độ hấp phụ tế bào thời điểm đo tăng lên Điều cho thấy dịch chiết sinh khối nấm ngâm nước nóng có đáp ứng tốt đến tế bào HEK, kích thích tế bào phát triển tăng sinh Bên cạnh nồng độ 3,4 mg/ml độ hấp phụ tế bào giảm mạnh, điều nồng độ dịch chiết cao trở nên ức chế tế bào 47 3.3.3 Đánh giá tác dụng dịch chiết sinh khối nấm thượng hoàng lên tế bào BT 474 HEK 3.3.3.1 Dịch chiết sinh khối nấm cồn Đo tế bào sống phương pháp MTS dòng tế bào HEK293 BT474 ủ với nồng độ khác dịch chiết sinh khối nấm chiết cồn, kết độ hấp phụ bước sóng 490 nm thể bảng 3.11 Bảng 3.11 Kết đo độ hấp phụ tế bào HEK293 BT474 ủ với dịch chiết sinh khối nấm cồn Nồng độ dịch Thời gian chiết (mg/ml) 24 48 HEK293 BT 474 HEK293 BT 474 DC1 0,73 1,59 1,08 1,57 DC2 0,85 1,58 1,05 1,59 (mg/ml) 0,73 1,82 1,02 1,60 0,15 (mg/ml) 0,82 1,66 1,45 1,74 0,3 (mg/ml) 0,86 1,58 1,40 1,66 0,6 (mg/ml) 0,83 1,56 1,54 1,63 1,2 (mg/ml) 0,78 1,50 1,25 1,67 Trong đó: DC1: 0,2% DMSO; DC2: 0,1% DMSO (là nồng độ DMSO tương đương có mẫu dịch chiết 0,6 mg/ml chiết 0,3 mg/ml chất chiết với cồn) Từ kết bảng 3.11, vẽ đồ thị thể độ hấp phụ tế bào HEK293 BT474 bước sóng 490 nm ủ với nồng độ khác dịch chiết sinh khối nấm chiết cồn, hình ảnh thu sau: 48 2,00 1,80 Độ hấp phụ bước sóng 490nm 1,60 1,40 1,20 1,00 0,80 HEK293 BT 474 0,60 0,40 0,20 24 (mg/ml) 0,15 (mg/ml) 0,3 (mg/ml) 0,6 (mg/ml) 1,2 (mg/ml) DC2 DC1 (mg/ml) 0,15 (mg/ml) 0,3 (mg/ml) 0,6 (mg/ml) 1,2 (mg/ml) DC2 DC1 0,00 48 Hình 3.21 Đồ thị so sánh độ hấp phụ tế bào BT474 HEK293 ủ với dịch chiết sinh khối nấm cồn DC1: mẫu tế bào ủ với 0,2% DMSO DC2 mẫu tế bào ủ với 0,1% DMSO Nhận xét: - Sau 24 giờ: Độ hấp phụ tế bào BT474 cao gần gấp lần độ hấp phụ HEK237 tất nồng độ dịch chiết Vì suy đốn sau 24 với dịch chiết dịch chiết chưa thể tác dụng, BT474 chưa bị ức chế tăng sinh mạnh so với tế bào thường HEK293 - Sau 48 giờ: Kết khác biệt rõ rệt độ hấp phụ tế bào BT474 gần không tăng đáng kể tế bào HEK lại tăng mạnh, có thời điểm gần cân với BT474 Điều chứng minh tác dụng ức chế tế bào ung thư dịch chiết từ sinh khối chiết cồn 49 3.3.3.2 Dịch chiết sinh khối nấm chiết nước nóng Nồng độ dịch chiết (mg/ml) Thời gian 24 48 HEK293 BT 474 HEK293 BT 474 DC3 1,03 1,69 1,28 1,67 (mg/ml) 0,73 1,82 1,02 1,60 0,425 (mg/ml) 1,02 1,78 1,30 1,78 0,85 (mg/ml) 0,99 1,88 1,32 1,76 1,7 (mg/ml) 0,92 1,56 1,29 1,62 3,4 (mg/ml) 0,72 1,79 0,96 1,61 Bảng 3.12 Kết đo độ hấp phụ tế bào HEK293 BT474 ủ với dịch chiết sinh khối nấm nước nóng Trong đó, DC3: Đối chứng với nước cất Đo tế bào sống phương pháp MTS dòng tế bào HEK293 BT474 ủ với nồng độ khác dịch chiết sinh khối nấm chiết nước nóng, kết độ hấp phụ bước sóng 490 nm thể bảng 3.12: Từ kết bảng 3.12, vẽ đồ thị thể độ hấp phụ tế bào HEK293 BT474 bước sóng 490 nm ủ với nồng độ khác 2,00 1,80 1,60 1,40 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 HEK293 24 (mg/ml) 0,425 (mg/ml) 0,85 (mg/ml) 1,7 (mg/ml) 3,4 (mg/ml) DC3 (mg/ml) 0.425 (mg/ml) 0,85 (mg/ml) 1,7 (mg/ml) 3,4 (mg/ml) BT474 DC3 Độ hấp phụ bước sóng 490nm dịch chiết sinh khối nấm chiết nước nóng (hình 3.22) 48 Hình 3.22 Đồ thị so sánh độ hấp phụ tế bào BT474 HEK293 ủ với dịch chiết sinh khối nấm nước nóng DC3: Đối chứng với nước cất 50 Nhận xét: So sánh độ hấp phụ tế bào thời thấy kết khả quan Sau 48h độ hấp phụ tế bào BT474 giảm chứng tỏ số lượng tế bào BT474 giảm Bên cạnh tế bào HEK293 có độ hấp phụ tăng nhiều tất nồng độ Như HEK 293 phát triển, không bị ảnh hưởng dịch chiết sinh khối nấm có mơi trường 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Mẫu nấm Thượng hoàng thu vùng Madagui, huyện Đạ Huoai, tỉnh Lâm Đồng định loại đoạn gen ITS Sau giải trình tự đoạn gen ITS nấm Thượng hồng thu 732 bp Trình tự đoạn gen ITS có độ tương đồng 99% với Phellinus linteus mã số AF080458 Trình tự đăng ký với mã số MW365317 Chủng nấm đặt tên Phellinus linteus PLUS Chủng nấm Phellinus linteus PLUS có khả sinh enzyme ngoại bào bao gồm cellulase amylase, khơng có khả sinh protease ngoại bào Sau xác định khả sinh emzym ngoại bào môi trường tối ưu cho phát triển nấm Thượng hoàng, tiến hành chiết thu sinh khối nấm Thượng hồng cồn nước nóng Với 10 g bột sinh khối nấm, ta thu 2,01 g chất hòa tan cồn 3,45 g chất tan nước nóng Đã đánh giá hoạt tính dịch chiết nấm Thượng hoàng tế bào BT474 HEK237 Kết cho thấy, dịch chiết sinh khối có tác dụng ức chế với tế bào ung thư BT474 không ảnh hưởng tới tế bào thận người HEK293 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu thử nghiệm xác định chế phân tử hoạt tính ức chế tế bào ung thư nấm Thượng hoàng đồng thời cần xây dựng mơ hình sản xuất nấm Thượng hồng phịng thí nghiệm quy mơ lớn 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Trần Thị Lụa, Vũ Văn Hạnh (2017), “Nghiên cứu điều kiện nhân sinh khối nấm Thượng Hoàng vàng (Phellinus baumi)”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam, 8(81): 106-108 Phạm Quang Thu (2016), “Đặc điểm sinh học nấm Thượng Hồng (Phellinus linteus) ni cấy thuần khiết”, Tạp chí Khoa học lâm nghiệp 1: 4231- 4237 TÀI LIỆU TIẾNG ANH Begerow D., Nilsson H., Unterseher M., Maier W (2010) “Current state and perspectives of fungal DNA barcoding and rapid identification procedures” Appl Microbiol Biotechnol 87 (1): 99–108 doi:10.1007/s00253-010-2585-4 Bellemain E., Carlsen T., Brochmann C (2010) “ITS as an environmental DNA barcode for fungi: an in silico approach reveals potential PCR biases” BMC Microbiol, 10: 189 https://doi.org/10.1186/1471-2180-10189 Boerjan W., Ralph J., Baucher M (2003) “Lignin biosynthesis” Annu Rev Plant Biol., 54: 519-546 Chang H.Y., Sheu M.J., Yang C.H, Lu T.C., Chang Y.S, Peng W.H., Huang S.H., Huang G.J (2011) “Analgesic effects and the mechanisms of anti-inflammation of hispolon in mice” Evid Based Complement Alternat Med., 47: 824-826 Chen H., Tian t., Miao H., Zhao Y (2016), “Traditional uses, fermentation, phytochemistry and pharmacology of Phellinus linteus”, Fitoterapia ,113: 6-26 Chen Q., Shi Y.Q., Lin X.G., Chen X., Jiang R.J (2005), “A preliminary study on the liquid culture conditions of rare medicinal fungus Phellinus linteus”, Edible Fungi of China, 1: 41–44 53 Cho J.Y., Kwon Y.J, Sohn M.J., Seok S.J, Kim W.G (2011) “Phellinstatin, a new inhibitor of enoyl-ACP reductase produced by the medicinal fungus Phellinus linteus” Bioorg Med Chem Lett., 21 (6): 1716-1718 10 Ganley A., Takehiko K (2011) “Monitoring the Rate and Dynamics of Concerted Evolution in the Ribosomal DNA Repeats of Saccharomyces cerevisiae Using Experimental Evolution” Mol Biol Evol., 28 (10): 288391 doi: 10.1093/molbev/msr117 11 Huang G.J., Yang C.M., Chang Y.S., Amagaya S., Wang H.C., Hou W.C, Huang S.S., Hu M.L (2010) “Hispolon suppresses SK-Hep1 human hepatoma cell metastasis by inhibiting matrix metalloproteinase-2/9 and urokinase-plasminogen activator through the PI3K/Akt and ERK signaling pathways” J Agric Food Chem., 58 (17): 9468-9475 12 Hui J., Li H., Zhu C.Y., Li Q.J., Hu F.Q (2009), “Comparative analysis of nutrients in fruit body and mycelia of Phellinus igniarius” Spec Wild Econ Anim Plant Res., 2: 59–61 13 Hur H (2008) “Cultural Characteristics and Log-Mediated Cultivation of the Medicinal Mushroom, Phellinus linteus” Mycobiology, 36 (2): 81–87 https://doi.org/10.4489/MYCO.2008.36.2.081 14 Hsieh P.W., Wu J.B., Wu J.C (2013) “Chemistry and biology of Phellinus linteus” Biomedicine (3): 106-113 15 Jung J.Y., Lee I.K., Seok S.J., Lee H.J., Kim Y.H., Yun B.S (2008) “Antioxidant polyphenols from the mycelial culture of the medicinal fungi Inonotus xeranticus and Phellinus linteus” J Appl Microbiol 104 (6): 1824-1832 16 Kang H.S., Choi J.H., Cho W.K., Park J.C., Choi J.S (2004) “A sphingolipid and tyrosinase inhibitors from the fruiting body of Phellinus linteus” Arch Pharm Res., 27: 742-750 17 Kojima K., Ohno T., Inoue M., Mizukami H., Nagatsu A (2008) “Phellifuropyranone A: a new furopyranone compound isolated from fruit 54 bodies of wild Phellinus linteus” Chem Pharm Bull., 56 (2): 173-175 18 Lee I.K., Yun B.S (2007) “Highly oxygenated and unsaturated metabolites providing a diversity of hispidin class antioxidants in the medicinal mushrooms Inonotus and Phellinus” Bioorg Med Chem., 15 (10): 33093314 19 Lee I.K., Yun B.S (2011) “Styrylpyrone-class compounds from medicinal fungi Phellinus and Inonotus spp and their medicinal importance” J Antibiot, 64: 349-359 20 Lee M., Hwang B.S., Lee I., Seo G., Yun B (2015), “Chemical Constituents of the Culture Broth of nus linteusand Their Antioxidant Activity”, Mycobiology, 43 (1): 43-8 doi: 10.5941/MYCO.2015.43.1.43 21 Lee Y.S., Kang Y.H, Jung J.Y., Kang Y.J., Han S.N., Chung J.S., Shin H.K., Lim S.S (2008) “Inhibitory constituents of aldose reductase in the fruiting body of Phellinus linteus” Biol Pharm Bull., 31 (4): 765-768 22 Lee Y.S., Kang Y.J., Jung J.Y., Lee S., Ohuchi K., Shin K.H., Kang I.J., Han J., Park Y., Shin K.H., Lim S.S (2008) “Protein glycation inhibitors from the fruiting body of Phellinus linteus” Biol Pharm Bull., 31 (10): 1968-1972 23 Liu C.L., Wang J.M., Chu C.Y., Cheng M.T., Tseng T.H (2002) “In vivo protective effect of protocatechuic acid on tert-butyl hydroperoxide-induced rat hepatotoxicity” Food Chem Toxicol., 40 (5): 635-641 24 Lu T.L., Huang G.J., Lu T.J., Wu J.B., Wu C.H., Yang T.C., Iizuka A., Chen Y.F (2009) “Hispolon from Phellinus linteus has antiproliferative effects via MDM2-recruited ERK1/2 activity in breast and bladder cancer cells” Food Chem Toxicol., 47 (8): 2013-2021 25 Mandal S., Shivapurkar N.M., Galati A.J., Stoner G.D (1988) “Inhibition of N-nitrosobenzylmethylamine metabolism and DNA binding in cultured rat esophagus by ellagic acid” Carcinogenesis, (7): 1313-1316 26 Mandal S., Stoner G.D (1990) “Inhibition of N-nitrosobenzylmethylamine55 induced esophageal tumorigenesis in rats by ellagic acid” Carcinogenesis., 11 (1): 55-61 27 Min B.S., Yun B.S., Lee H.K., Jung H.J., Jung H.A., Choi J.S (2006) “Two novel furan derivatives from Phellinus linteus with anti-complement activity” Bioorg Med Chem Lett., 16 (12): 3255-3257 28 Nagatsu A., Itoh S., Tanaka R., Kato S., Haruna M., Kishimoto K Hirayama H., Goda Y., Mizukami H., Ogihara Y (2004) “Identification of novel substituted fused aromatic compounds, meshimakobnol A and B, from natural Phellinus linteus fruit body” Tetrahedron Lett., 45 (30): 59315933 29 Narayanan B.A., Geoffroy O., Willingham M.C., Re G.G., Nixon D.W (1999) “p53/p21(WAF1/CIP1) expression and its possible role in G1 arrest and apoptosis in ellagic acid treated cancer cells” Cancer Lett., 136 (2): 215-221 30 Nilsson R.H., Ryberg M., Abarenkov K., Sjökvist E., Kristiansson E (2009) “The ITS region as a target for characterization of fungal communities using emerging sequencing technologies” FEMS Microbiol Lett., 296 (1): 97-101 doi: 10.1111/j.1574-6968.2009.01618 31 Olthof M.R., Hollman P.C., Katan M.B (2001) “Chlorogenic acid and caffeic acid are absorbed in humans” J Nutr., 131 (1): 66-71 32 Park I.H., Jeon S.Y., Lee S.Y., Kim S.Y., Song K.S (2004) “A betasecretase (BACE1) inhibitor hispidin from the mycelial cultures of Phellinus linteus” Planta Med., 70 (2): 143-146 33 Qi X , Zhang J., Chen Y., Wang C.L (2010), “Comparative analysis of bioactive components in fruit bodies of Phellinus linteus growing on six species of trees”, Food Sci., 31: 199–201 34 Rajendra P.N., Karthikeyan A., Karthikeyan S., Reddy B.V (2011) “Inhibitory effect of caffeic acid on cancer cell proliferation by oxidative mechanism in human HT-1080 fibrosarcoma cell line” Mol Cell Biochem., 56 349 (1-2): 11-19 35 Ramberg J.E., Nelson E.D., Sinnott R.A (2010) “Immunomodulatory dietary polysaccharides: a systematic review of the literature” Nutr J., 9: 54 36 Rao S.R., Ravishankar G.A (2000) “Biotransformation of protocatechuic aldehyde and caffeic acid to vanillin and capsaicin in freely suspended and immobilized cell cultures of Capsicum frutescens” J Biotechnol., 76 (2-3): 137-146 37 Samchai S., Seephonkai P., Kaewtong C (2011), “Two indole derivatives and phenolic compound isolated from mushroom Phellinus linteus”, Chin J Nat Med 9:173–175 38 Seeram N.P., Adams L.S., Henning S.M., Niu Y., Zhang Y., Nair M.G., Heber D (2005) “In vitro antiproliferative, apoptotic and antioxidant activities of punicalagin, ellagic acid and a total pomegranate tannin extract are enhanced in combination with other polyphenols as found in pomegranate juice” J Nutr Biochem., 16 (6): 360-367 39 Sliva D., Jedinak A., Kawasaki J., Harvey K., Slivova V (2008) “Phellinus linteus suppresses growth, angiogenesis and invasive behaviour of breast cancer cells through the inhibition of AKT signalling” Br J Cancer, 98 (8):1348-1356 doi: 10.1038/sj.bjc.6604319 40 Sliva D (2010), “Medicinal mushroom Phellinus linteusas an alternative cancer therapy” Exp Ther Med., 1(3):407-411 doi: 10.3892/etm_00000063 41 Song K.S., Cho S.M., Lee J.H., Kim H.M., Han S.B., Ko K.S (1995), “BLymphocyte-Stimulating polysaccharide from mushroom Phellinus linteus”, Chem Pharm Bull, 2105–2108 42 Shetty K., Vattem D.A (2005) “Biological Function of Ellagic Acid: A Review” J Food Biochem., 29 (3): 234-266 43 Teel R.W., Babcock M.S., Dixit R., Stoner G.D (1986) “Ellagic acid 57 toxicity and interaction with benzo[a]pyrene and benzo[a]pyrene 7,8dihydrodiol in human bronchial epithelial cells” Cell Biol Toxicol (1): 53-62 44 Wang G.J., Tsai T.H., Chang T.T., Chou C.J., Lin L.C (2009) “Lanostanes from Phellinus igniarius and their iNOS inhibitory activities”, Planta Med 75: 1602–1607 45 Wood M (2006) “Nuts' New Aflatoxin Fighter: Caffeic Acid?” Agricult Research., 54: 46 Yang K.L., Chang W.T., Chuang C.C., Hung K.C., Li E.I.C (2008) “Antagonizing TGF-beta induced liver fibrosis by a retinoic acid derivative through regulation of ROS and calcium influx” Biochem Biophys Res Commun., 365 (18): 484-489 47 Yeo W.H., Hwang E.I., So S.H., Lee S.M (2007) “Phellinone, a new furanone derivative from the Phellinus linteus KT&G PL-2” Arch Pharm Res., 30 (8): 924-926 48 Liu Y., Wang C., Li J., Mei Y., Liang Y (2019) “Hypoglycemic and Hypolipidemic Effects of Phellinus Linteus Mycelial Extract from SolidState Culture in A Rat Model of Type Diabet” Nutrients, 11 (2): 296 doi: 10.3390/nu11020296 49 Zhu T., Kim S.H., Chen C.Y (2008) “A medicinal mushroom: Phellinus linteus” Curr Med Chem 15 (13): 1330-1335 50 Zhong J.J., Tang Y.J., Fang Q.H (2003) “Submerged Fermentation of the Medicinal Mushroom Ganoderma lucidum for Production of Polysaccharide and Ganoderic Acid” Fermentation Biotechnology 862, Chapter 7, 108- 123 51 Yong H L., Jinlan R., Shilin C., Jingyuan S., Kun L., Dong L., Hui Y (2010), “Authentication of Taxillus chinensis using DNA barcoding technique”, J Med Plants Research, (24): 2706-2709 52 Vijayan K., Tsou C H (2010), “DNA barcoding in plants: taxonomy in a 58 new perspective”, Current science, 99: 1530 - 1540 TÀI LIỆU INTERNET 53 CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technicalbulletins/0/celltiter-96-aqueous-one-solution-cell-proliferation-assaysystem-protocol.pdf Ngày 03/11/2020 54 36 Năm Cách sử dụng nấm thượng hoàng hiệu https://medimart.com.vn/tin-tuc/5-cach-su-dung-nam-thuong-hoang-hieuqua.html Ngày 03/11/2020 55 37 Mushroom to increase prostate cancer drug power http://www.ecofriend.com/mushroom-to-increase-prostate-cancer-drugpower.html Ngày 03/11/2020 59 ...ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HOÀNG VÂN THANH ĐỊNH DANH VÀ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA NẤM THƯỢNG HOÀNG (PHELLINUS LINTEUS) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số:... tài: ? ?Định danh thử nghiệm hoạt tính sinh học nấm Thượng hồng (Phellinus linteus)? ?? Mục tiêu nghiên cứu Định danh loài đánh giá hoạt tính ức chế dịng tế bào ung thư sinh khối nấm Thượng hoàng (Phellinus. .. có hoạt tính sinh học [18], [35] xác định phân lập thành phần có hoạt tính sinh học, chức kháng u chế dược lý nấm Thượng hoàng [15], [32], [49] Ngoài ra, nấm Thượng hồng cịn chứng minh có hoạt