Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của nấm hexagonia tenuis, phellinus gilvus, phellinus baumii và ganoderma australe ở vùng bắc trung bộ tt

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH ĐỖ XUÂN HƯNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA NẤM Hexagonia tenuis, Phellinus gilvus, Phellinus baumii Ganoderma australe Ở VÙNG BẮC TRUNG BỘ CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỮU CƠ MÃ SỐ CHUYÊN NGÀNH: 9440114 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC NGHỆ AN – 2020 Công trình được hoàn thành tại: Viện Sư phạm Tự nhiên - Trường Đại học Vinh Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Đặng Ngọc Quang GS TS Trần Đình Thắng Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án được bảo vệ tại Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường họp tại: Phịng bảo vệ, tầng 6, Nhà Cơng nghệ cao Trường Đại học Vinh vào hồi … giờ … phút, ngày … tháng … năm 2020 Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Thư viện Quốc gia Việt Nam Trung tâm Thông tin - Thư viện Nguyễn Thúc Hào – Trường Đại học Vinh MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Nấm sinh vật khơng thể thiếu đời sống, khơng có nấm, chu trình tuần hồn vật chất bị mắt xích quan trọng việc phân hủy chất bã hữu Nấm nguồn thực phẩm giàu đạm, đầy đủ axit amin thiết yếu, hàm lượng chất béo chủ yếu axit béo chưa bão hịa, giá trị lượng cao, giàu khống chất vitamin có tác dụng tốt cho sức khỏe người Ngồi ra, nấm cịn chứa nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học, góp phần ngăn ngừa điều trị bệnh cho người Ngày nay, ngày nhiều nhà khoa học tập trung nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi nấm nhằm phát hoạt chất có dược tính mạnh bệnh nan y viêm gan, kháng viêm ung thư, HIV…Việc đưa vào sử dụng rộng rãi chế phẩm tách chiết từ nấm giúp người khỏe mạnh, phòng chống nhiều bệnh tiềm ẩn, nguy hiểm Việt Nam quốc gia có đa dạng sinh học cao giới với cấu trúc địa chất độc đáo, địa lý thủy văn đa dạng, khí hậu nhiệt đới gió mùa, kiểu sinh thái khác nhau… góp phần tạo nên đa dạng khu hệ nấm Việt Nam Đến năm 2010, có khoảng 2500 lồi nấm ghi nhận lãnh thổ Việt Nam, số khoảng 1400 lồi thuộc 120 chi loài nấm lớn Các loài nấm lớn Việt Nam có giá trị tài nguyên đáng kể nhiều mặt, có khoảng 50 lồi nấm ăn q như: loài mộc nhĩ, ngân nhĩ, nấm hương (Lentinula edodes), nấm rơm, nấm mối, nấm thông (Boletus edulis Bull.), nấm chàm (Boletus aff felleus Bull.), nấm bào ngư (Pleurotus spp.), nấm mào gà (Cantherellus cibarius Fr.), nấm ngọc châm (Hypsizigus marmoreus), nấm kim châm (Flammulina velutipes) Có khoảng 200 lồi nấm dùng làm dược liệu, có nhiều loài dược liệu quý như: linh chi (G lucidum), linh chi sò (G capense), cổ linh chi (G applanatum), vân chi (Trametes versicolor), phiến chi (Schizophyllum commune), nấm hương (Lentinula edode), nấm kim châm (Flammulina velutipes), mộc nhĩ, ngân nhĩ, đông trùng hạ thảo (Cordycep sinensis, Cordycep militaris)… Những nghiên cứu bước đầu hợp chất có hoạt tính sinh học số nấm lớn Việt Nam cho thấy chúng giàu hợp chất có khối lượng phân tử lớn polysaccharit, polysaccharit-peptit, lectin… chất có khối lượng phân tử nhỏ flavonoit, steroit, terpenoit… có tác dụng chống viêm, tăng cường đáp ứng miễn dịch, hỗ trợ điều trị bệnh hiểm nghèo ung thư, suy giảm miễn dịch, tiết niệu, tim mạch… Khoảng 50 lồi nấm có khả sinh enzym số hoạt chất quý ứng dụng công nghệ sinh học bảo vệ môi trường Bắc Trung khu vực có nhiều vườn quốc gia, khu bảo tồn thiên nhiên Phong Nha - Kẻ Bàng, Vũ Quang, Hồ Kẻ Gỗ, Pù Mát, Pù Huống, Pù Hoạt Bến En Đây vùng đánh giá có tính đa dạng sinh học cao, có chứa đựng nguồn lợi lớn đa dạng sinh học, có nguồn lợi lớn nấm sử dụng chúng làm nguyên liệu tốt cho ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm… Các nghiên cứu nấm Việt Nam nói chung khu vực Bắc Trung nói riêng cịn vấn đề mới, chưa nhận quan tâm mức nhà khoa học Do vậy, việc nghiên cứu nấm vùng Bắc Trung yêu cầu thiết, có ý nghĩa lý luận thực tiễn, góp phần quan trọng việc tìm hiểu nguồn tài nguyên thiên nhiên, giá trị kinh tế tầm quan trọng nguồn dược liệu thiên nhiên nước ta nói chung tỉnh vùng Bắc Trung nói riêng Vì lý chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học nấm Hexagonia tenuis, Phellinus gilvus, Phellinus baumii Ganoderma australe vùng Bắc Trung bộ” Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu luận án thể bốn loài nấm H tenuis, P gilvus, P baumii G australe thu hái vùng Bắc Trung bộ, Việt Nam Nhiệm vụ nghiên cứu - Chiết hỗn hợp hợp chất từ thể bốn loài nấm Hexagonia tenuis, Phellinus gilvus, Phellinus baumii Ganoderma australe - Sử dụng phương pháp sắc ký để phân lập hợp chất từ dịch chiết loại nấm - Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập - Thử hoạt tính sinh học số hợp chất phân lập Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp lấy mẫu: mẫu sau lấy rửa sạch, phân lập bảo quản nhiệt độ thích hợp Việc xử lý tiếp mẫu phương pháp chiết chọn lọc với dung môi thích hợp để thu hỗn hợp hợp chất dùng cho nghiên cứu nêu phần thực nghiệm - Phương pháp phân tích, tách hỗn hợp phân lập chất: sử dụng phương pháp sắc ký cột thường (CC), sắc ký lớp mỏng phân tích điều chế, sắc ký cột nhanh (FC) với pha tĩnh khác silica gel, sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) phân tích pha đảo, pha silica gel - Phương pháp khảo sát cấu trúc hợp chất: cấu trúc hoá học hợp chất phân lập xác định phương pháp vật lý đại phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng phun mù electron (ESI-MS), phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều (1D-NMR) hai chiều (2D-NMR) với kỹ thuật khác 1H-NMR, 13 C-NMR, DEPT, 1H-1H COSY, HSQC HMBC - Cấu trúc lập thể tương đối hợp chất xác định phương pháp phổ NMR - Thăm dị hoạt tính hoạt tính kháng vi sinh vật, kháng nấm kháng tế bào ung thư Những đóng góp mới luận án Đây nghiên cứu có hệ thống Việt Nam thành phần hóa học thể bốn lồi nấm Hexagonia tenuis, Phellinus gilvus, Phellinus baumii Ganoderma australe - Từ dịch chiết thể nấm Hexagonia tenuis phân lập xác định cấu trúc hợp chất: 03 hợp chất triterpenoid: Hexagonin F, Hexatenuin A, Hexagonin B Các hợp chất Hexagonin F, Hexagonin B lần phân lập từ lồi nấm Trong đó, Hexagonin F hợp chất mới; 02 hợp chất sterol: Ergosterol, Ergosterol peroxide Cả năm hợp chất có khả ức chế tế bào khối u SK-LU-1 (ung thư phổi), HepG2 (ung thư gan), Hep3B (ung thư gan), SW480 (ung thư ruột kết) MCF-7 (ung thư vú) Đây hoạt tính lần khảo sát hợp chất - Từ dịch chiết thể Phellinus gilvus phân lập hợp chất: 03 hợp chất phenolic: 1,2,4,5-tetrachloro-3,6-dimethoxybenzene, (E)-4-(3,4dihydroxyphenyl)but-3-en-2-one, 4,4’-dihydroxy-3,3’,6,6’-tetramethyl-[1,1’bi(cyclohexane)]-3,3’,6,6’-tetraene-2,2’,5,5’-tetraone; 02 hợp chất sterol: Ergosterol, Ergosterol peroxide, chất có khả gây độc tế bào KB (ung thư biểu mô) - Từ dịch chiết thể nấm Phellinus baumii phân lập hợp chất: 05 hợp chất polyphenol: 1,2,4,5-tetrachloro-3,6-dimethoxybenzene; aldehyde 3,4dihydroxylbenzoic; methyl 3,4-dihydroxybenzoate; (E)-4-(3,4dihydroxyphenyl)but-3-en-2-one; Inoscavin A Kết thử hoạt tính cho thấy 1,2,4,5-tetrachloro-3,6-dimethoxybenzene (PBE1) khơng có hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mô KB, hai hợp chất (E)-4-(3,4-dihydroxyphenyl)but-3-en2-one (PBE4) Inoscavin A (PBE5) có hoạt tính trung bình - Từ dịch chiết thể nấm Ganoderma australe phân lập hợp chất: 04 hợp chất triterpenoid: Ganoderic acid Sz, Ganoderic acid Y, Ganoderal A, Ganoderol B; 02 hợp chất sterol: Ergosterol, Ergosterol peroxide Cấu trúc luận án Luận án bao gồm 115 trang với 30 bảng số liệu, 49 hình sơ đồ với 129 tài liệu tham khảo Kết cấu luận án gồm: mở đầu (4 trang), tổng quan (25 trang), phương pháp thực nghiệm (14 trang), kết thảo luận (60 trang), kết luận (1 trang), danh mục công trình cơng bố (1 trang), tài liệu tham khảo (9 trang) Ngồi cịn có phần phụ lục gồm 90 trang công thức cấu tạo phổ hợp chất chọn lọc CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Luận án tiến hành tổng quan tài liệu nội dung: Tổng quan chi Hexgonia - Giới thiệu hợp chất chuyển hóa bậc hai: steroid, terpenoid, sesquiterpenoid, diterpenoid, triterpenoid… Nấm Hexagonia tenuis - Giới thiệu đặc điểm phân bố loài nấm Hexagonia tenuis - Thành phần hóa học nấm Hexagonia tenuis - Hoạt tính sinh học nấm Hexagonia tenuis Tổng quan chi Phellinus - Giới thiệu hợp chất chuyển hóa bậc hai: polysaccharide proteinpolysaccharide, steroid, terpenoid, sesquiterpenoid, diterpenoid, triterpenoid, flavone, styrylpyrone, furanone, polychlorinat… Nấm Phellinus baumii - Giới thiệu đặc điểm phân bố lồi nấm Phellinus baumii - Thành phần hóa học Phellinus baumii Nấm Phellinus gilvus - Giới thiệu đặc điểm phân bố loài nấm Phellinus gilvus - Thành phần hóa học Phellinus gilvus Tổng quan chi Ganoderma - Giới thiệu hợp chất chuyển hóa bậc hai: polysaccharide proteinpolysaccharide, steroid, terpenoid, sesquiterpenoid, diterpenoid, triterpenoid… Nấm Ganoderma australe - Giới thiệu đặc điểm phân bố loài nấm Ganoderma australe - Thành phần hóa học Ganoderma australe CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 2.1 Phương pháp nghiên cứu 2.1.1 Phương pháp lấy mẫu: Mẫu nấm thu hái vào thời điểm thích hợp năm Mẫu tươi sau lấy rửa sạch, để nơi thoáng mát, tiến hành phân lập bảo quản điều kiện thích hợp dùng để thí nghiệm 2.1.2 Phương pháp chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc các chất phân lập được: Sắc ký lớp mỏng (TLC); sắc ký cột thường (CC); sắc ký cột nhanh (FC); sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC); phương pháp kết tinh 2.1.3 Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất: Phổ tử ngoại (UV); phổ hồng ngoại (IR); phổ khối lượng (ESI-MS), (HR-ESI-MS); phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR; phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR; phổ cộng hưởng từ hạt nhân DEPT, HMBC, HSQC; cấu trúc lập thể tương hợp chất xác định phương pháp phổ NMR 2.1.4 Phuơng pháp thử hoạt tính sinh học Q trình thử hoạt tính Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên thực theo phương pháp Skehan, Likhitwitayawuid, Vander, Vlietlinck, McKane 2.2 Hóa chất và thiết bị 2.2.1 Hoá chất: Các dung môi để ngâm chiết mẫu nấm dùng loại tinh khiết (pure), dùng cho loại sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột nhanh sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA) 2.2.2 Thiết bị: sắc ký lớp mỏng (TLC); sắc ký cột (CC); sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC); phổ tử ngoại (UV); phổ hồng ngoại (FT-IR); phổ khối lượng (MS); phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR); điểm nóng chảy; độ quay cực riêng 2.2.3 Phương pháp lấy mẫu Nấm Hexagonia tenuis, Phellinus gilvus, Phellinus baumii Ganoderma australe thu hái vườn quốc gia Pù Mát - Nghệ An, Việt Nam vào tháng 08 năm 2017 PGS.TS Ngô Anh, khoa Sinh, Trường Đại học Khoa học Huế tiến hành định danh mẫu nấm thu Tiêu lưu giữ Viện Cơng nghệ Hóa, Sinh, Mơi trường - Trường Đại học Vinh 2.2.4 Phương pháp phân lập Quả thể nấm nghiền nhỏ, ngâm chiết lần dung môi methanol (10L x 3) nhiệt độ phòng, thiết bị siêu âm chưng cất áp suất giảm thiết bị quay cất chân không thu cao methanol tổng Cao methanol hòa tan nước chiết phân bố với dung môi ethyl acetate, n-butanol thu dịch tương ứng (ethyl acetate, n-butanol dịch nước) chưng cất chân không thu phần: cao ethyl acetate, cao nbutanol dịch nước Các hợp chất loài nấm phân lập theo sơ đồ 2.1-2.4 sau: Quả thể nấm H tenuis (2,5kg) Ngâm chiết với Methanol (3x10L) Cao methanol (254g) - Hòa tan nước - Chiết với Ethyl acetate, buthanol Cao ethyl acetate (82g) Cao butanol (57g) Dịch nước (90g) SKC, Silica gel Chlorofrom:methanol (100:0 - 2:1) F1 5.3 (g) F2 (3,6g) F3 (2,7g) F5 (1,8g) F8 (2,2g) (8,6 g) (g) (g) (8,6 g) (8,6 g) SKC, Silica gel Hexane:ethyl acetate (100:0, 25:1, 15:1, 10:1, 4:1) F1.4 (0.75g) F1.1 (1g) CC, Silica gel Hexane: ethyl acetate (100:0, 25:1, 15:1, 10:1, 4:1) F1.6 (0,5g) SKC, Silica gel (8,6 Hexane:acetone g) (9:1, 6:1) F2.5 (0,7g) HTM2 (84mg) CC, Silica gel Chloroform:methanol (9:1, 6:1) F3.2 (0,6g) LH-20 Methanol/ nước RP-18 Methanol/ nước HTM4 (103mg) SKC, Silica gel (8,6 Hexane:acetone g) (9:1, 6:1, 4:1, 1:1) HTM1 (31mg) RP-18 Methanol/ nước HTM3 (24mg) HTM5 (34mg) Sơ đồ 2.1: Phân lập hợp chất từ nấm H tenuis (1g) (1g) (1g) (1g) Quả thể P Gilvus (2,0kg) Ngâm chiết với ethanol (3x10L) Chiết hỗ trợ sóng siêu âm Cao methanol (93,0g) - Hòa tan nước - Chiết với hexane, ethyl acetate, chloroform - Cất quay chân không thu hồi dung môi Cao hexane (7,8g ) Cao ethyl acetate (19,2g ) Cao chloroform (26,3g ) Dịch chiết nước (28,1g) - CC, Silica gel - hexane: ethyl acetate (1:1-1:6) F-1 (4,1g) F-4 (2,7g) F-3 (1,5g) CC, Silica gel Hexane: ethyl acetate (2:1) Tinh chế Methanol F-31 F-34 PGE1 (380,5mg) - SKC, Silica gel - CC, Silica gel - Hexane:ethyl acetate (1:2) - Hexane:ethyl acetate(1:2,5,1:3) (1:2) (1:2,5; 1:3) F-4.1 F-4.2 F-4.3 F-5.1 - HPLC điều chế - Hexane:ethyl acetate (1:2) F-316 F-9 (4,8g) F-5 (4,8g) PGE4 (20,4mg) F-5.2 - HPLC điều chế - Hexane:ethyl acetate (1:3) (1:2) PGE5 (4,7mg) PGE2 (11,4mg) PGE3 (11,6mg) Sơ đồ 2.2: Phân lập hợp chất từ thể nấm P Gilvus Quả thể P baumi (3,0kg) -Ngâm chiết với methanol (3x10L) -Chiết hỗ trợ sóng siêu âm Cao methanol (99,5g) - Hịa tan nước - Chiết với hexane, ethyl acetate, chloroform - Cất quay chân không thu hồi dung môi Cao hexane (10,5g ) Cao ethyl acetate (20,1g ) Cao chloroform (33,8g ) Dịch chiết nước (27,9g) - CC, Silica gel - hexane:ethyl acetate (gradient) F-1 F-4 F-2 F-6 Tinh chế Methanol F-21 F-6.1 F-24 F-6.3 PBE1 (20,0 mg) F-216 PBE5 (105,1mg) PBE2 (15,0 mg) PBE3 (8,1 mg) PBE4 (10,2 mg) Sơ đồ 2.3: Phân lập hợp chất từ thể nấm P baumii 11 Phổ IR thể dải hấp thụ mạnh cho nhóm hydroxy (3435 cm ) nhóm carbonyl khơng bão hịa (1646 cm-1) Phổ 1H-NMR HTM1 xuất tín hiệu singlet sáu nhóm methyl δH 0,83 (6H, CH3-29 & 30), 0,95 (3H, CH3-19), 1,01 (3H, CH3-28) 1,73 (6H, CH3-18 & 27) cho thấy cấu trúc HTM1 triterpene lanostanoid Ngồi ra, tín hiệu proton doublet triplet đặc trưng δ H 3,18 (t, J = 6,5 Hz), 4,22 (dd, J = 9,0, 6,0 Hz), cho thấy diện nhóm hydroxy, δH 6,62 (t, J = 7,0 Hz) liên kết đôi carbon-carbon tín hiệu singlet δH 9,38 nhóm chức formyl -1 Hình 3.2 Phổ 1H NMR hợp chất HTM1 Hình 3.3 Phổ 1H-NMR hợp chất HTM1 12 Ở khu vực trường thấp phổ 13C-NMR, có hai methine oxy hóa δC(ppm) 73,7 (C-12) 79,6 (C-3), liên kết đôi C=C bậc bốn δC 135,3 (C-9) 136,2 (C-8), hai carbone olefinic δC 141,0 (C-25) 155,5 (C-24), nhóm carboxylic acid δC 177,8 (C-21) nhóm carbonyl dạng ketone aldehyde δC 197,1 Hình 3.4 Phổ 13C NMR hợp chất HTM1 Hình 3.5 Phổ 13C NMR hợp chất HTM1 13 Hình 3.6 Phổ DEPT hợp chất HTM1 Vị trí liên kết đơi C bậc bốn nằm C-8 C-9, xác định tương quan 3J-HMBC từ CH3-18 đến C-9 từ CH3-30 đến C-8 Các tín hiệu phổ 1D 2D-NMR đề cập phù hợp với đặc điểm cấu trúc khung 24(E)-3β-hydroxylanosta-8,24-dien-26-al-21-oic acid Hình 3.7 Phổ HMBC hợp chất HTM1 14 Hình 3.8 Phổ HMBC hợp chất HTM1 Hình 3.9 Phổ HMBC hợp chất HTM1 Sự khác biệt cấu trúc hợp chất HTM1 xuất thêm tín hiệu nhóm hydroxy Trong phổ HMBC có tương quan 2J, 3J từ H12 đến C-9, C-14 C-19; CH3-18 đến C-1, C-5, C-9 C-10; từ H-20 đến C21; từ H-24 đến C-23, C-26, C-27; từ CH3-30 đến C-3 C-5, tương ứng, 15 xác nhận xuất C-3 C-12 hydroxyl, liên kết đôi C-24/ C-25, formyl C-26 carboxylic acid C-21 Cấu hình nhóm 3-OH xác định β dựa theo số tách J = 6,5 Hz H-3 Ngoài ra, tương quan H-12 CH3-30 phổ NOESY cho thấy cấu hình 12-OH có cấu hình β Hình 3.10 Phổ HMBC hợp chất HTM1 Hình 3.11 Phổ HMBC hợp chất HTM1 16 Hình 3.12 Phổ HSQC hợp chất HTM1 Hình 3.13 Phổ COSY hợp chất HTM1 17 Hình 3.14 Phổ COSY hợp chất HTM1 Hình 3.15 Phổ NOESY hợp chất HTM1 18 Hình 3.16 Phổ NOESY hợp chất HTM1 Bảng 3.1 Dữ liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) 13C-NMR HTM1 (125 MHz, CD3OD) Vị trí DEPT δC δH (ppm, J (Hz)) HMBC (H→C) (ppm) CH2 38,8 1,81 (m); 1,95 (m) C-18; C-10 CH2 30,6 1,41 (m); 1,36 (m) C-4 CH 79,6 3,18 (t, 6,5) C-1; C-29; C-28 C 39,9 CH 51,8 1,07 (d, 13,0) C-4; C-10; C-3 CH2 19,4 1,01 (d, 9,0) C-5; C-8 CH2 28,2 2,24 (m) C-6; C-5; C-8 C 136,2 C 135,3 10 C 38,3 11 CH2 21,7 2,05 (d, 9,0) C-12; C-13; C-9 12 CH 73,7 4,22 (dd, 9,0, 6,0) C-11; C-13; C-9 13 C 46,0 14 C 52,6 15 CH2 32,0 1,55 (m) C-13; C-14; C16; C-8 16 CH2 28,5 1,64 (m) 19 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 CH CH3 CH3 CH C CH2 CH2 CH C CH CH3 CH3 CH3 CH3 47,1 19,6 17,7 48,5 179,8 37,0 27,9 155,5 141,0 197,1 9,1 28,6 16,2 16,8 2,20 (m) 1,73 (s) 0,95 (s) 2,25 (m) C-21; C-15; C-13 C-1; C-5 C-12; C-13; C-14 C-21; C-23 1,25 (dd, 15,0, 6,5) 2,38 (dd, 15,0, 7,5) 6,62 (t, 7,0) C-21; C-24 C-24; C-20 C-26; C-27; C-23 9,38 (s) 1,73 (s) 1,01 (s) 0,83 (s) 0,83 (s) C-27; C-24 C-26; C-24 C-4; C-3; C-29 C-4; C-3; C-5 C-14; C-15; C-8 27 25 HOOC HO 26 CHO 21 23 24 19 12 14 10 30 HO 16 15 22 13 20 17 11 18 28 29 Sự tương tác COSY (▬) HMBC (→) hợp chất HTM1 Với việc phân tích phổ 1D 2D cấu trúc hóa học HTM1 làm sáng tỏ Đây hợp chất lần công bố vể cấu trúc hóa học đặt tên hexagonin F 27 25 HOOC HO 26 CHO 21 23 24 19 12 17 11 18 10 14 30 HO 16 15 22 13 20 28 29 3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học quả thể nấm Phellinus gilvus 3.2.1 Phân lập các hợp chất Quả thể nấm Phellinus gilvus ngâm chiết dung môi methanol Cất thu hồi dung môi dịch chiết cao thơ methanol Cao thơ 20 hịa tan nước chiết phân bố với dung môi ethyl acetate thu cao ethyl acetate tương ứng Từ cao ethyl acetate nấm P gilvus phương pháp sắc ký cột silica gel phân lập hợp chất xác định hợp chất phương pháp phổ (Bảng 3.3) Bảng 3.3 Các hợp chất tách từ nấm Phellinus gilvus TT Ký hiệu hợp chất PGE1 PGE2 PGE3 PGE4 PGE5 Tên chất Hàm lượng 1,2,4,5-tetrachloro-3,6-dimethoxybenzene 380,5 mg Ergosterol 11,4 mg Ergosterol peroxide 11,6 mg (E)-4-(3,4-dihydroxyphenyl)but-3-en-2-one 20,4 mg 4,4’-dihydroxy-3,3’,6,6’-tetramethyl-[1,1’4,7 mg bi(cyclohexane)]-3,3’,6,6’-tetraene2,2’,5,5’-tetraone 3.3 Nghiên cứu thành phần hóa học quả thể nấm Phellinus baumii 3.3.1 Phân lập các hợp chất Quả thể nấm Phellinus baumii ngâm chiết dung môi methanol Cất loại dung môi thu cao chiết thơ methanol Cao thơ hịa tan nước chiết phân bố với dung môi ethyl acetate thu cao ethyl acetate tương ứng Từ cao ethyl acetate nấm Phellinus baumii phương pháp sắc ký cột silica gel phân lập hợp chất xác định hợp chất phương pháp phổ (Bảng 3.4) Bảng 3.4 Các hợp chất tách từ nấm Phellinus baumii Ký hiệu hợp chất PBE1 PBE2 PBE3 PBE4 PBE5 TT Tên chất 1,2,4,5-tetrachloro-3,6dimethoxybenzene 3,4-dihydroxylbenzoic aldehyde Methyl 3,4-dihydroxybenzoate (E)-4-(3,4-dihydroxyphenyl)but-3-en-2one Inoscavin A 3.4 Nấm Ganoderma australe 3.4.1 Phân lập các hợp chất Hàm lượng 20,0 mg 15,0 mg 8,1 mg 10,2 mg 105,1 mg 21 Quả thể nấm G australe ngâm chiết dung môi methanol Cất thu hồi dung môi dịch chiết cao thô methanol Cao thơ hịa tan nước chiết phân bố với dung môi ethyl acetate, dung môi butanol thu cao ethyl acetate cao butanol tương ứng Từ cao ethyl acetate nấm G australe phương pháp sắc ký cột silica gel phân lập hợp chất xác định hợp chất phương pháp phổ (Bảng 3.5) Bảng 3.5 Các hợp chất tách từ nấm Ganoderma australe TT Ký hiệu hợp chất GAM1 GAM2 GAM3 GAM4 GAM5 GAM6 Tên chất Ganoderic acid Sz Ganoderic acid Y Ganoderal A Ganoderol B Ergosterol Ergosterol peroxide CTPT Hàm lượng C30H46O5 C35H50O7 C31H46O4 C30H48O2 C28H44O C28H44O3 360 mg 10 mg 128 mg 68 mg 180 mg 20 mg 3.5 Hoạt tính sinh học các hợp chất 3.5.1 Hoạt tính sinh học các hợp chất phân lập từ nấm H tenius Các hợp chất tinh khiết kiểm tra độc tính tế bào ống nghiệm dòng tế bào khối u SK-LU-1, HepG2, Hep3B, SW480 MCF-7 mô tả trước (Lee et al 2011) liệu hoạt tính sinh học cung cấp bảng 3.19 Các hợp chất HTM1 HTM3 thể ức chế yếu năm dòng tế bào khối u với giá trị IC50 nằm khoảng 62,7 ± 2,4 97,6 ± 1,1 µM, so với Ellipticine kiểm soát sau (giá trị IC50 nằm khoảng 0,4 ± 0,1 0,5 ± 0,1 µM) Các hợp chất HTM4 HTM5 hoạt tính độc tế bào đáng kể chống lại tế bào SKLU-1 SW480 nồng độ thử nghiệm cao (IC 50 > 50 100 µM, tương ứng) Tuy nhiên, hai cho thấy độc tính tế bào trung bình dịng tế bào ung thư HepG2 Hep3B, với giá trị IC50 nằm khoảng 21,5 ± 5,1 46,9 ± 3,7 µM Ngoài ra, hợp chất HTM4 thể độc tính tế bào vừa phải dịng tế bào MCF7, với giá trị IC 50 43,6 ± 5,1 µM (Bảng 3.6) 22 Bảng 3.6 Hoạt tính độc tế bào hợp chất HTM1-5 từ thể nấm H tenuis STT SK-LU-1 HepG2 Hep3B SW480 MCF7 Tên Mẫu a a a IC50 (μM)a IC50 (μM) IC50 (μM) IC50 (μM) IC50 (μM)a HTM1 62,7 ± 2,1 62,7 ± 2,4 64,3 ± 1,7 94,7 ± 1,8 84,3 ± 1,8 HTM2 97,6 ± 1,1 92,7 ± 1,8 95,2 ± 1,8 75,3 ± 2,8 85,6 ± 0,8 HTM3 82,4 ± 1,1 81,5 ± 1,8 84,7 ± 1,8 94,2 ± 2,8 86,2 ± 0,8 HTM4 >50 21,5 ± 5,1 21,7 ± 2,8 >100 43,6 ± 5,1 HTM5 >50 46,9 ± 3,7 35,2 ± 3,4 >100 >100 b Ellipticine 0,4 ± 0,1 0,4 ± 0,1 0,4 ± 0,1 0,5 ± 0,1 0,4 ± 0,1 a nồng độ cần thiết cho ức chế 50% (IC50) Kết trình bày dạng phương tiện ± SD (n = 3) *** p 128 >128 >128 >128 >128 >128 >128 >128 >128 >128 >128 >128 >128 >128 Bảng 3.8 Kết thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mơ KB cao chiết PGE hợp chất PGE1-3 23 STT Tên mẫu PGE PGE1 PGE2 PGE3 Giá trị IC50 (g/mL) KB >128 >128 12,68 23,5 3.5.3 Hoạt tính sinh học các hợp chất phân lập từ nấm Phellinus baumi Chúng tiến hành nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào với ba mẫu chất PBE1, PBE4 PBE5 Kết sau: Bảng 3.9 Kết nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào chất PBE1, PBE4 PBE5 Giá trị IC50 (μg/ml) dòng KB PBE1 > 128 PBE4 79,83 PBE5 93,17 Ellipticine 0,45 Từ kết cho thấy PBE1 khơng có hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mơ KB với IC50 > 128 (μg/ml), hai hợp chất PBE4 PBE5 có hoạt tính trung bình STT Tên mẫu 24 KẾT LUẬN Nghiên cứu thành phần hoá học hoạt tính sinh học thể nấm Hexagonia tenuis, Phellinus gilvus, Phellinus baumii Ganoderma australe Việt Nam, thu số kết sau: Từ dịch chiết thể nấm Hexagonia tenuis phân lập xác định cấu trúc hợp chất: - 03 hợp chất triterpenoid: hexagonin F, hexatenuin A, hexagonin B Các hợp chất hexagonin F, hexagonin B lần phân lập từ loài nấm Trong đó, hexagonin F hợp chất - 02 hợp chất sterol: grgosterol, grgosterol peroxide - Cả năm hợp chất có khả ức chế tế bào khối u SK-LU-1 (ung thư phổi), HepG2 (ung thư gan), Hep3B (ung thư gan), SW480 (ung thư ruột kết) MCF-7 (ung thư vú) Từ dịch chiết thể Phellinus gilvus phân lập hợp chất: - 03 hợp chất phenolic: 1,2,4,5-tetrachloro-3,6-dimethoxybenzene, (E)-4(3,4-dihydroxyphenyl)but-3-en-2-one, 4,4’-dihydroxy-3,3’,6,6’-tetramethyl[1,1’-bi(cyclohexane)]-3,3’,6,6’-tetraene-2,2’,5,5’-tetraone; - 02 hợp chất sterol: ergosterol, ergosterol peroxide chúng có tác dụng gây độc tế bào biểu mô (KB) Từ dịch chiết thể nấm Phellinus baumii phân lập hợp chất: - 05 hợp chất polyphenol: 1,2,4,5-tetrachloro-3,6-dimethoxybenzene; 3,4dihydroxylbenzaldehyde; methyl 3,4-dihydroxybenzoate; (E)-4-(3,4dihydroxyphenyl)but-3-en-2-one; Inoscavin A - Kết thử hoạt tính cho thấy PBE1 (1,2,4,5-tetrachloro-3,6dimethoxybenzene) khơng có hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mô KB, hai hợp chất PBE4 ((E)-4-(3,4-dihydroxyphenyl)but-3-en-2-one) PBE5 (Inoscavin A) có hoạt tính trung bình Từ dịch chiết thể nấm Ganoderma australe phân lập hợp chất: - 04 hợp chất triterpenoid: ganoderic acid Sz, ganoderic acid Y, ganoderal A, ganoderol B; - 02 hợp chất sterol: ergosterol, ergosterol peroxide 25 DANH MỤC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Do Xuan Hung, Luu Hang Nga, Tran Dinh Thang, Dang Ngoc Quang (2018), Chemical constituents of the ethyl acetate fraction of the fruit bodies of Phellinus gilvus, Vietnam Journal of Science and Technology, 56 (4A), 246251 Do Xuan Hung, Ping-Chung Kuo, Nguyen Ngoc Tuan, Hoang Van Trung, Nguyen Tan Thanh, Nguyen Thi Ha, Bach Long Giang, Nguyen Quang Trung, Nguyen Thi Ngan, Ha Viet Hai, Doan Lan Phuong, Dang Ngoc Quang, Tran Dinh Thang (2019), Triterpenoids and steroids from the fruiting bodies of Hexagonia tenuis and their cytotoxicity, Natural Product Research, DOI: 10.1080/14786419.2019.1624963 Nguyễn Thành Trung, Đỗ Xuân Hưng, Trần Đình Thắng, Nguyễn Tân Thành, Đặng Ngọc Quang (2019), Cytotoxic constituents of the fruit bodies of Phellinus baumii collected in Nghe An Province, Vietnam Journal of Chemistry, 57(6E), 335-339 Đỗ Xuân Hưng, Trần Trung Hiếu, Đặng Ngọc Quang, Trần Đình Thắng (2020), Các hợp chất triterpenoid từ thể nấm cổ linh chi (Ganoderma australe Pat.), Tạp chí Khoa học Trường Đại học Vinh, 49 (3A), 36-41 ... PBE4 PBE5 có hoạt tính trung bình STT Tên mẫu 24 KẾT LUẬN Nghiên cứu thành phần hoá học hoạt tính sinh học thể nấm Hexagonia tenuis, Phellinus gilvus, Phellinus baumii Ganoderma australe Việt... loài nấm Phellinus baumii - Thành phần hóa học Phellinus baumii Nấm Phellinus gilvus - Giới thiệu đặc điểm phân bố loài nấm Phellinus gilvus - Thành phần hóa học Phellinus gilvus Tổng quan chi Ganoderma. .. ra, nấm cịn chứa nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học, góp phần ngăn ngừa điều trị bệnh cho người Ngày nay, ngày nhiều nhà khoa học tập trung nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học