3. Nội dung nghiên cứu
2.2.3. Nghiên cứu phân loại nấm
- Tách chiết DNA tổng số nấm:
Nấm nuôi lắc trong 7 ngày trong 50 ml môi trường lỏng ở bình tam giác 250 ml. Ly tâm thu sinh khối với tốc độ 5000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó sinh khối nấm được nghiền mịn trong nitơ lỏng. Hòa tan sinh khối đã nghiền mịn trong 800 µl đệm TE, vortex trong 5 phút để trộn đều sinh khối với đệm TE. Bổ sung 30 µl lysozyme 100mg/ml, ủ ở 37°C trong 1h. Bổ sung 80 µl SDS 10%, trộn đều. Bổ sung 16 µl proteinaise K (20 mg/ml), trộn đều, ủ ở 56°C trong 30 phút. Tiếp tục bổ sung thêm 200 µl CTAB/NaCl, trộn đều. Bổ sung 200 µl NaCl 5M, trộn đều, ủ ở 65°C trong 10 phút. Bổ sung 800µl hỗn hợp Phenol/Cloroform/Isoamylalcohol (25 : 24 : 1), đảo nhẹ nhàng, sau đó ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút. Hút và chuyển dịch nổi ở trên sang một ống mới. Lặp lại bước này 2 lần. Bổ sung 500 µl isopropanol để kết tủa DNA, đảo ống và ủ ở - 20°C trong 1giờ. Sau đó ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4ºC. Rửa tủa bằng 500 µl ethanol 70% và ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4ºC. Loại bỏ dịch nổi phía trên và để khô. Hòa tan lại DNA trong 200 µl đệm TE và tiếp tục tách chiết lần thứ 2 sử dụng GeneJET Genomic DNA purification KIT (Thermo scientific) theo hướng dẫn sử dụng của KIT.
- Phương pháp PCR:
Để nhân bản đoạn gene mã hóa cho vùng gene ITS đặc hiệu của nấm Thượng hoàng có kích thước khoảng 800 bp, cặp mồi ITS1 và ITS4 được sử dụng (ITS1: TCC GTA GGT GAA CCT GCG G; ITS4: TCC TCC GCT TAT
TGA TAT GC). Thành phần phản ứng PCR gồm: 1x PCR buffer 22,5 µl, 10 pmol primer 0,5 µl mỗi loại, DNA khuôn 0,5 µl, nước khử ion đã khử trùng vừa đủ 25 µl (EZ PCR mix, Phusa Biochem). Phản ứng PCR nhân bản gene ITS được thực hiện trên máy chu trình nhiệt Applied Bioscience Veriti 96 giếng theo chương trình như sau: 1, Tiền biến tính 95oC trong 3 phút; 2, biến tính 95oC trong 30 giây; 3, gắn mồi ở 58oC trong 50 giây; và 4, kéo dài chuỗi ở 72oC trong 40 giây; lặp lại các bước 2 đến bước 4 cho 30 đến 35 chu kỳ; và bước kéo dài chuỗi cuối cùng là 72oC trong 5 phút. Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên 1% agarose gel ở điện thế 100V trong thời gian 30 phút và kiểm tra kết quả bằng cách soi với đèn UV visualizer.
- Đọc trình tự:
Sản phẩm PCR được đọc trình tự theo phương pháp Sanger trên máy đọc trình tự ABI PRISM 3100 tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm công nghệ gene, Viện Công nghệ sinh học, Viện HLKHCNVN. Kết quả trình tự được xử lý bằng phần mềm BioEdit. Sử dụng công cụ BLAST của NCBI để đánh giá mức độ tương đồng của chủng Phellinus linteus thu được với các trình tự gene trong cơ sở dữ liệu của ngân hàng gene thế giới.