3. Nội dung nghiên cứu
2.2.7.Thử nghiệm hoạt tính trên tế bào ung thư vú (BT474) và tế bào thận
người (HEK293).
2.2.6.1. Hoạt hóa tế bào.
Chuẩn bị: Môi trường DMEM low glucose bổ sung 10 % FBS, 1% Pen/strep; được làm ấm trước khi sử dụng ở 37oC. Lấy ống tế bào được bảo quản trong nitơ lỏng ra và đưa nhanh vào bể ổn nhiệt 37oC, lắc nhẹ đến khi dung dịch trong ống tan hết. Hút 4 ml môi trường mới đã được làm ấm vào ống falcon 15ml, sau đó hút tế bào trong ống giống vào ống falcon đã có sẵn môi trường, đảo nhẹ nhàng bằng cách hút lên và nhả ra nhẹ nhàng với pipet, tránh tạo bọt khí. Ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút. Loại bỏ môi trường phía trên nhẹ nhàng để không tạo bọt khí. Hòa lại tế bào trong 10 ml môi trường mới và đưa vào đĩa petri dành riêng cho nuôi cấy tế bào động vật. Đặt tế bào vào tủ ấm 37oC với 5% CO2 và theo dõi quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào.
2.2.6.2. Tiến hành thí nghiệm.
Tế bào được cấy chuyển sang đĩa mới khi mật độ tế bào đạt 80 - 90 % đĩa. Thực hiện thí nghiệm ở lần cấy chuyển thứ 2 hoặc 3 khi tế bào đã đạt độ ổn định trong sinh trưởng. Tế bào được duy trì trong môi trường DMEM low glucose bổ sung 10 % FBS, 1% Pen/strep. Đếm tế bào sử dụng Trypan blue và chia ra đĩa 96 giếng ở nồng độ 104 tế bào/giếng/100 µl. Ủ qua đêm để tế bào bám chắc vào bề mặt đĩa. Bổ sung dịch chiết nước nóng của nấm Thượng hoàng ở các nồng độ 0,425 mg/ml, 0,85 mg/ml, 1,7 mg/ml, 3,4 mg/ml; dịch chiết cồn của nấm Thượng hoàng ở các nồng độ: 0,15 mg/ml, 0,3 mg/ml, 0,6 mg/ml, 1,2 mg/ml trên tổng 10 µl vào mỗi giếng và tiếp tục theo dõi sau khi ủ 24h, 48h. Ảnh hưởng của dịch chiết nấm Thượng hoàng đến các tế bào được đánh giá theo phương pháp MTS sử dụng Kit CellTiter 96® AQueous One
Solution Cell Proliferation Assay (MTS) của hãng Promega. Mỗi mẫu thí nghiệm được lặp lại 2 lần.
Phương pháp MTS: Xét nghiệm tăng sinh tế bào CellTiter 96® AQueous One Solution là phương pháp so màu để xác định số lượng của các tế bào sống trong xét nghiệm tăng sinh hoặc xét nghiệm độc tế bào. Thuốc thử CellTiter 96® AQueous One Solution chứa một hợp chất tetrazolium mới. Hợp chất tetrazolium MTS (thuốc thử Owen) khi ủ với tế bào được các tế bào sinh ra thành một sản phẩm formazan có màu hòa tan trong môi trường nuôi cấy mô (Hình 2.2). Các xét nghiệm được thực hiện bằng cách thêm một lượng nhỏ thuốc thử CellTiter 96® AQueous One Solution trực tiếp vào giếng nuôi cấy, ủ trong 2 giờ và sau đó ghi lại độ hấp phụ ở bước sóng 490 nm với đầu đọc đĩa 96 giếng. Số lượng sản phẩm formazan được đo bằng độ hấp phụ ở bước sóng 490 nm tỷ lệ thuận với số lượng tế bào sống trong các giếng nuôi cấy (Hình 2.3).
Hình 2.3. Ảnh hưởng của số lượng tế bào đến độ hấp phụ tại bước sóng 490 nm được đo bằng CellTiter 96®Aqueous One Solution Assay [53]
Nguyên lý hoạt động của phương pháp MTS: Xét nghiệm MTS là một phương pháp so màu để định lượng sự nhạy cảm các tế bào sống trong xét nghiệm tăng sinh tế bào. Các enzyme dehydrogenase phụ thuộc NAD (P) trong các tế bào hoạt động trao đổi chất có thể làm giảm hợp chất tetraolium MTS và tạo ra sản phẩm formazan có thể hòa tan trong môi trường nuôi cấy tế bào. Vì các tế bào sống có thể chuyển đổi hợp chất tetraolium MTS thành sản phẩm formazan hòa tan và có màu, sẽ mang lại sự gia tăng đáng kể về cường độ màu, có thể dễ dàng định lượng bằng cách đo độ hấp phụ ở mức 490 - 500 nm. Xét nghiệm MTS có thể được sử dụng cho các nghiên cứu về sự tăng sinh tế bào để đáp ứng với các kích thích bên ngoài như cytokine, thuốc thử gây độc tế bào và các yếu tố tăng trưởng. Vì xét nghiệm này có thể được sử dụng để phân tích các hợp chất gây độc tế bào như thuốc chống ung thư và các hợp chất dược phẩm, nên xét nghiệm này cũng có thể được áp dụng rộng rãi để phát triển các loại thuốc mới [53].
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN