3. Nội dung nghiên cứu
3.3.3.Đánh giá tác dụng của dịch chiết sinh khối nấm thượng hoàng lên tế
3.3.3.1. Dịch chiết sinh khối nấm bằng cồn.
Đo tế bào sống bằng phương pháp MTS trên 2 dòng tế bào HEK293 và BT474 khi ủ với các nồng độ khác nhau của dịch chiết sinh khối nấm chiết cồn, kết quả độ hấp phụ tại bước sóng 490 nm được thể hiện ở bảng 3.11.
Bảng 3.11. Kết quả đo độ hấp phụ của tế bào HEK293 và BT474 khi ủ với dịch chiết sinh khối nấm bằng cồn.
Nồng độ dịch chiết (mg/ml) Thời gian 24 giờ 48 giờ HEK293 BT 474 HEK293 BT 474 DC1 0,73 1,59 1,08 1,57 DC2 0,85 1,58 1,05 1,59 0 (mg/ml) 0,73 1,82 1,02 1,60 0,15 (mg/ml) 0,82 1,66 1,45 1,74 0,3 (mg/ml) 0,86 1,58 1,40 1,66 0,6 (mg/ml) 0,83 1,56 1,54 1,63 1,2 (mg/ml) 0,78 1,50 1,25 1,67
Trong đó: DC1: 0,2% DMSO; DC2: 0,1% DMSO (là nồng độ DMSO tương đương có trong mẫu dịch chiết 0,6 mg/ml chiết và 0,3 mg/ml chất chiết với cồn).
Từ kết quả bảng 3.11, vẽ đồ thị thể hiện độ hấp phụ của tế bào HEK293 và BT474 tại bước sóng 490 nm khi được ủ với các nồng độ khác nhau của dịch chiết sinh khối nấm chiết cồn, hình ảnh thu được như sau:
Hình 3.21. Đồ thị so sánh độ hấp phụ của tế bào BT474 và HEK293 khi ủ với dịch chiết sinh khối nấm bằng cồn.
DC1: là mẫu tế bào được ủ với 0,2% DMSO. DC2 là mẫu tế bào được ủ với 0,1% DMSO.
Nhận xét:
- Sau 24 giờ: Độ hấp phụ của tế bào BT474 cao gần gấp 2 lần độ hấp phụ của HEK237 ở tất cả các nồng độ dịch chiết. Vì vậy có thể suy đoán rằng sau 24 giờ với dịch chiết thì dịch chiết vẫn chưa thể hiện được tác dụng, BT474 vẫn chưa bị ức chế và đang tăng sinh rất mạnh so với tế bào thường HEK293.
- Sau 48 giờ: Kết quả khác biệt rõ rệt khi độ hấp phụ của tế bào BT474 gần như không tăng đáng kể nhưng tế bào HEK lại tăng mạnh, có thời điểm gần như cân bằng với BT474. Điều này đã chứng minh được tác dụng ức chế tế bào ung thư của các dịch chiết từ sinh khối chiết cồn.
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 1,60 1,80 2,00 DC 1 DC 2 1,2 (m g/m l) 0,6 (m g/m l) 0,3 (m g/m l) 0,15 ( m g/ m l) 0 (m g/m l) DC 1 DC 2 1,2 (m g/m l) 0,6 (m g/m l) 0,3 (m g/m l) 0,15 ( m g/ m l) 0 (m g/m l) 24 giờ 48 giờ Đ ộ h ấ p p h ụ t ạ i b ướ c só n g 490n m HEK293 BT 474
3.3.3.2. Dịch chiết sinh khối nấm chiết bằng nước nóng. Nồng độ dịch chiết (mg/ml) Thời gian 24 giờ 48 giờ HEK293 BT 474 HEK293 BT 474 DC3 1,03 1,69 1,28 1,67 0 (mg/ml) 0,73 1,82 1,02 1,60 0,425 (mg/ml) 1,02 1,78 1,30 1,78 0,85 (mg/ml) 0,99 1,88 1,32 1,76 1,7 (mg/ml) 0,92 1,56 1,29 1,62 3,4 (mg/ml) 0,72 1,79 0,96 1,61
Bảng 3.12. Kết quả đo độ hấp phụ của tế bào HEK293 và BT474 khi ủ với dịch chiết sinh khối nấm bằng nước nóng.
Trong đó, DC3: Đối chứng với nước cất.
Đo tế bào sống bằng phương pháp MTS trên 2 dòng tế bào HEK293 và BT474 khi ủ với các nồng độ khác nhau của dịch chiết sinh khối nấm chiết nước nóng, kết quả độ hấp phụ tại bước sóng 490 nm được thể hiện ở bảng 3.12:
Từ kết quả bảng 3.12, vẽ đồ thị thể hiện độ hấp phụ của tế bào HEK293 và BT474 tại bước sóng 490 nm khi được ủ với các nồng độ khác nhau của dịch chiết sinh khối nấm chiết nước nóng (hình 3.22).
Hình 3.22. Đồ thị so sánh độ hấp phụ của tế bào BT474 và HEK293 khi ủ với dịch chiết sinh khối nấm bằng nước nóng.
DC3: Đối chứng với nước cất.
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 1,60 1,80 2,00 DC 3 3,4 (m g/m l) 1,7 (m g/m l) 0,85 ( m g/ m l) 0.4 25 (m g/m l) 0 (m g/m l) DC 3 3,4 (m g/m l) 1,7 (m g/m l) 0,85 ( m g/ m l) 0,42 5 (m g/m l) 0 (m g/m l) 24 giờ 48 giờ Đ ộ h ấ p p h ụ t ạ i b ướ c só n g 490n m HEK293 BT474
Nhận xét:
So sánh độ hấp phụ của các tế bào ở các thời đã thấy được kết quả khả quan. Sau 48h độ hấp phụ của tế bào BT474 đã giảm chứng tỏ số lượng tế bào BT474 đã giảm. Bên cạnh đó tế bào HEK293 có độ hấp phụ tăng khá nhiều ở tất cả các nồng độ. Như vậy là HEK 293 vẫn phát triển, không bị ảnh hưởng bởi dịch chiết sinh khối nấm có trong môi trường.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
Mẫu nấm Thượng hoàng thu tại vùng Madagui, huyện Đạ Huoai, tỉnh Lâm Đồng được định loại bằng đoạn gen ITS. Sau khi giải trình tự đoạn gen ITS của nấm Thượng hoàng thu được 732 bp. Trình tự đoạn gen ITS có độ tương đồng 99% với Phellinus linteus mã số AF080458. Trình tự được đăng ký với mã số MW365317. Chủng nấm này được đặt tên là Phellinus linteus PLUS. Chủng nấm Phellinus linteus PLUS có khả năng sinh enzyme ngoại bào bao gồm cellulase và amylase, và không có khả năng sinh protease ngoại bào.
Sau khi xác định khả năng sinh emzym ngoại bào và môi trường tối ưu cho sự phát triển của nấm Thượng hoàng, tiến hành chiết thu sinh khối nấm Thượng hoàng bằng cồn và nước nóng. Với 10 g bột sinh khối nấm, ta thu được 2,01 g chất đã hòa tan trong cồn và 3,45 g chất tan trong nước nóng.
Đã đánh giá hoạt tính của dịch chiết nấm Thượng hoàng đối với tế bào BT474 và HEK237. Kết quả cho thấy, dịch chiết sinh khối có tác dụng ức chế với tế bào ung thư BT474 và không ảnh hưởng tới tế bào thận người HEK293.
Kiến nghị
Tiếp tục nghiên cứu thử nghiệm và xác định cơ chế phân tử hoạt tính ức chế đối với các tế bào ung thư của nấm Thượng hoàng đồng thời cần xây dựng mô hình sản xuất nấm Thượng hoàng trong phòng thí nghiệm và trên quy mô lớn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Trần Thị Lụa, Vũ Văn Hạnh (2017), “Nghiên cứu điều kiện nhân sinh khối nấm Thượng Hoàng vàng (Phellinus baumi)”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, 8(81): 106-108.
2. Phạm Quang Thu (2016), “Đặc điểm sinh học của nấm Thượng Hoàng (Phellinus linteus) trong nuôi cấy thuần khiết”, Tạp chí Khoa học lâm nghiệp 1: 4231- 4237.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
3. Begerow D., Nilsson H., Unterseher M., Maier W. (2010) “Current state and perspectives of fungal DNA barcoding and rapid identification procedures”. Appl. Microbiol. Biotechnol. 87 (1): 99–108. doi:10.1007/s00253-010-2585-4
4. Bellemain E., Carlsen T., Brochmann C. (2010) “ITS as an environmental DNA barcode for fungi: an in silico approach reveals potential PCR biases”. BMC Microbiol, 10: 189. https://doi.org/10.1186/1471-2180-10- 189
5. Boerjan W., Ralph J., Baucher M. (2003) “Lignin biosynthesis”. Annu. Rev. Plant. Biol., 54: 519-546.
6. Chang H.Y., Sheu M.J., Yang C.H, Lu T.C., Chang Y.S, Peng W.H., Huang S.H., Huang G.J. (2011) “Analgesic effects and the mechanisms of anti-inflammation of hispolon in mice”. Evid Based Complement Alternat Med., 47: 824-826.
7. Chen H., Tian t., Miao H., Zhao Y. (2016), “Traditional uses, fermentation, phytochemistry and pharmacology of Phellinus linteus”, Fitoterapia ,113: 6-26.
8. Chen Q., Shi Y.Q., Lin X.G., Chen X., Jiang R.J. (2005), “A preliminary study on the liquid culture conditions of rare medicinal fungus Phellinus linteus”, Edible Fungi of China, 1: 41–44
9. Cho J.Y., Kwon Y.J, Sohn M.J., Seok S.J, Kim W.G. (2011) “Phellinstatin, a new inhibitor of enoyl-ACP reductase produced by the medicinal fungus
Phellinus linteus”. Bioorg. Med. Chem. Lett., 21 (6): 1716-1718.
10. Ganley A., Takehiko K. (2011) “Monitoring the Rate and Dynamics of Concerted Evolution in the Ribosomal DNA Repeats of Saccharomyces cerevisiae Using Experimental Evolution”. Mol. Biol. Evol., 28 (10): 2883- 91. doi: 10.1093/molbev/msr117.
11. Huang G.J., Yang C.M., Chang Y.S., Amagaya S., Wang H.C., Hou W.C, Huang S.S., Hu M.L. (2010) “Hispolon suppresses SK-Hep1 human hepatoma cell metastasis by inhibiting matrix metalloproteinase-2/9 and urokinase-plasminogen activator through the PI3K/Akt and ERK signaling pathways”. J. Agric. Food Chem., 58 (17): 9468-9475.
12. Hui J., Li H., Zhu C.Y., Li Q.J., Hu F.Q. (2009), “Comparative analysis of nutrients in fruit body and mycelia of Phellinus igniarius”. Spec. Wild Econ. Anim. Plant Res., 2: 59–61
13. Hur H. (2008). “Cultural Characteristics and Log-Mediated Cultivation of the Medicinal Mushroom, Phellinus linteus”. Mycobiology, 36 (2): 81–87. https://doi.org/10.4489/MYCO.2008.36.2.081
14. Hsieh P.W., Wu J.B., Wu J.C. (2013) “Chemistry and biology of Phellinus linteus”. Biomedicine. 3 (3): 106-113.
15. Jung J.Y., Lee I.K., Seok S.J., Lee H.J., Kim Y.H., Yun B.S. (2008) “Antioxidant polyphenols from the mycelial culture of the medicinal fungi
Inonotus xeranticus and Phellinus linteus”. J. Appl. Microbiol. 104 (6): 1824-1832.
16. Kang H.S., Choi J.H., Cho W.K., Park J.C., Choi J.S. (2004) “A sphingolipid and tyrosinase inhibitors from the fruiting body of Phellinus linteus”. Arch. Pharm. Res., 27: 742-750.
17. Kojima K., Ohno T., Inoue M., Mizukami H., Nagatsu A. (2008) “Phellifuropyranone A: a new furopyranone compound isolated from fruit
bodies of wild Phellinus linteus”. Chem. Pharm. Bull., 56 (2): 173-175 18. Lee I.K., Yun B.S. (2007) “Highly oxygenated and unsaturated metabolites
providing a diversity of hispidin class antioxidants in the medicinal mushrooms Inonotus and Phellinus”. Bioorg Med Chem., 15 (10): 3309- 3314.
19. Lee I.K., Yun B.S. (2011) “Styrylpyrone-class compounds from medicinal fungi Phellinus and Inonotus spp. and their medicinal importance”. J. Antibiot, 64: 349-359.
20. Lee M., Hwang B.S., Lee I., Seo G., Yun B. (2015), “Chemical Constituents of the Culture Broth of nus linteusand Their Antioxidant Activity”, Mycobiology, 43 (1): 43-8. doi: 10.5941/MYCO.2015.43.1.43 21. Lee Y.S., Kang Y.H, Jung J.Y., Kang Y.J., Han S.N., Chung J.S., Shin
H.K., Lim S.S. (2008) “Inhibitory constituents of aldose reductase in the fruiting body of Phellinus linteus”. Biol. Pharm. Bull., 31 (4): 765-768. 22. Lee Y.S., Kang Y.J., Jung J.Y., Lee S., Ohuchi K., Shin K.H., Kang I.J.,
Han J., Park Y., Shin K.H., Lim S.S. (2008) “Protein glycation inhibitors from the fruiting body of Phellinus linteus”. Biol. Pharm. Bull., 31 (10): 1968-1972.
23. Liu C.L., Wang J.M., Chu C.Y., Cheng M.T., Tseng T.H. (2002) “In vivo
protective effect of protocatechuic acid on tert-butyl hydroperoxide-induced rat hepatotoxicity”. Food Chem. Toxicol., 40 (5): 635-641.
24. Lu T.L., Huang G.J., Lu T.J., Wu J.B., Wu C.H., Yang T.C., Iizuka A., Chen Y.F. (2009) “Hispolon from Phellinus linteus has antiproliferative effects via MDM2-recruited ERK1/2 activity in breast and bladder cancer cells”. Food Chem. Toxicol., 47 (8): 2013-2021.
25. Mandal S., Shivapurkar N.M., Galati A.J., Stoner G.D. (1988) “Inhibition of N-nitrosobenzylmethylamine metabolism and DNA binding in cultured rat esophagus by ellagic acid”. Carcinogenesis, 9 (7): 1313-1316.
induced esophageal tumorigenesis in rats by ellagic acid”. Carcinogenesis.,
11 (1): 55-61.
27. Min B.S., Yun B.S., Lee H.K., Jung H.J., Jung H.A., Choi J.S. (2006) “Two novel furan derivatives from Phellinus linteus with anti-complement activity”. Bioorg. Med. Chem. Lett., 16 (12): 3255-3257.
28. Nagatsu A., Itoh S., Tanaka R., Kato S., Haruna M., Kishimoto K. Hirayama H., Goda Y., Mizukami H., Ogihara Y. (2004) “Identification of novel substituted fused aromatic compounds, meshimakobnol A and B, from natural Phellinus linteus fruit body”. Tetrahedron Lett., 45 (30): 5931- 5933.
29. Narayanan B.A., Geoffroy O., Willingham M.C., Re G.G., Nixon D.W. (1999) “p53/p21(WAF1/CIP1) expression and its possible role in G1 arrest and apoptosis in ellagic acid treated cancer cells”. Cancer Lett., 136 (2): 215-221.
30. Nilsson R.H., Ryberg M., Abarenkov K., Sjökvist E., Kristiansson E. (2009) “The ITS region as a target for characterization of fungal communities using emerging sequencing technologies”. FEMS Microbiol. Lett., 296 (1): 97-101. doi: 10.1111/j.1574-6968.2009.01618.
31. Olthof M.R., Hollman P.C., Katan M.B. (2001) “Chlorogenic acid and caffeic acid are absorbed in humans”. J. Nutr., 131 (1): 66-71.
32. Park I.H., Jeon S.Y., Lee S.Y., Kim S.Y., Song K.S. (2004) “A beta- secretase (BACE1) inhibitor hispidin from the mycelial cultures of
Phellinus linteus”. Planta Med., 70 (2): 143-146.
33. Qi X. , Zhang J., Chen Y., Wang C.L. (2010), “Comparative analysis of bioactive components in fruit bodies of Phellinus linteus growing on six species of trees”, Food Sci., 31: 199–201.
34. Rajendra P.N., Karthikeyan A., Karthikeyan S., Reddy B.V. (2011) “Inhibitory effect of caffeic acid on cancer cell proliferation by oxidative mechanism in human HT-1080 fibrosarcoma cell line”. Mol. Cell Biochem.,
349 (1-2): 11-19.
35. Ramberg J.E., Nelson E.D., Sinnott R.A. (2010) “Immunomodulatory dietary polysaccharides: a systematic review of the literature”. Nutr J., 9: 54.
36. Rao S.R., Ravishankar G.A. (2000) “Biotransformation of protocatechuic aldehyde and caffeic acid to vanillin and capsaicin in freely suspended and immobilized cell cultures of Capsicum frutescens”. J. Biotechnol., 76 (2-3): 137-146.
37. Samchai S., Seephonkai P., Kaewtong C. (2011), “Two indole derivatives and phenolic compound isolated from mushroom Phellinus linteus”, Chin. J. Nat. Med. 9:173–175.
38. Seeram N.P., Adams L.S., Henning S.M., Niu Y., Zhang Y., Nair M.G., Heber D. (2005) “In vitro antiproliferative, apoptotic and antioxidant activities of punicalagin, ellagic acid and a total pomegranate tannin extract are enhanced in combination with other polyphenols as found in pomegranate juice”. J. Nutr. Biochem., 16 (6): 360-367.
39. Sliva D., Jedinak A., Kawasaki J., Harvey K., Slivova V. (2008) “Phellinus linteus suppresses growth, angiogenesis and invasive behaviour of breast cancer cells through the inhibition of AKT signalling”. Br. J. Cancer, 98 (8):1348-1356. doi: 10.1038/sj.bjc.6604319.
40. Sliva D. (2010), “Medicinal mushroom Phellinus linteusas an alternative cancer therapy”. Exp. Ther. Med., 1(3):407-411. doi: 10.3892/etm_00000063.
41. Song K.S., Cho S.M., Lee J.H., Kim H.M., Han S.B., Ko K.S. (1995), “B- Lymphocyte-Stimulating polysaccharide from mushroom Phellinus linteus”, Chem. Pharm. Bull, 2105–2108.
42. Shetty K., Vattem D.A. (2005) “Biological Function of Ellagic Acid: A Review”. J. Food Biochem., 29 (3): 234-266.
toxicity and interaction with benzo[a]pyrene and benzo[a]pyrene 7,8- dihydrodiol in human bronchial epithelial cells”. Cell Biol. Toxicol. 2 (1): 53-62.
44. Wang G.J., Tsai T.H., Chang T.T., Chou C.J., Lin L.C. (2009) “Lanostanes from Phellinus igniarius and their iNOS inhibitory activities”, Planta Med.
75: 1602–1607.
45. Wood M. (2006) “Nuts' New Aflatoxin Fighter: Caffeic Acid?” Agricult. Research., 54: 9.
46. Yang K.L., Chang W.T., Chuang C.C., Hung K.C., Li E.I.C. (2008) “Antagonizing TGF-beta induced liver fibrosis by a retinoic acid derivative through regulation of ROS and calcium influx”. Biochem Biophys Res Commun., 365 (18): 484-489.
47. Yeo W.H., Hwang E.I., So S.H., Lee S.M. (2007) “Phellinone, a new furanone derivative from the Phellinus linteus KT&G PL-2”. Arch Pharm Res., 30 (8): 924-926.
48. Liu Y., Wang C., Li J., Mei Y., Liang Y. (2019) “Hypoglycemic and Hypolipidemic Effects of Phellinus Linteus Mycelial Extract from Solid- State Culture in A Rat Model of Type 2 Diabet”. Nutrients, 11 (2): 296. doi: 10.3390/nu11020296.
49. Zhu T., Kim S.H., Chen C.Y. (2008) “A medicinal mushroom: Phellinus linteus”. Curr. Med. Chem. 15 (13): 1330-1335.
50. Zhong J.J., Tang Y.J., Fang Q.H. (2003) “Submerged Fermentation of the Medicinal Mushroom Ganoderma lucidum for Production of Polysaccharide and Ganoderic Acid”. Fermentation Biotechnology. 862, Chapter 7, 108- 123.
51. Yong H. L., Jinlan R., Shilin C., Jingyuan S., Kun L., Dong L., Hui Y. (2010), “Authentication of Taxillus chinensis using DNA barcoding technique”, J. Med. Plants Research, 4 (24): 2706-2709.
new perspective”, Current science, 99: 1530 - 1540.
TÀI LIỆU INTERNET
53. CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay. https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-
bulletins/0/celltiter-96-aqueous-one-solution-cell-proliferation-assay- system-protocol.pdf. Ngày 03/11/2020.
54. 36. Năm Cách sử dụng nấm thượng hoàng hiệu quả. https://medimart.com.vn/tin-tuc/5-cach-su-dung-nam-thuong-hoang-hieu- qua.html . Ngày 03/11/2020.
55. 37. Mushroom to increase prostate cancer drug power. http://www.ecofriend.com/mushroom-to-increase-prostate-cancer-drug- power.html. Ngày 03/11/2020.