3. Nội dung nghiên cứu
2.2.4.Phương pháp xác định khả năng tiết enzyme ngoại bào của nấm
Thượng hoàng.
Phương pháp xác định vòng thủy phân (khuếch tán trên đĩa thạch):Nguyên tắc: Sử dụng dịch chứa enzyme tác dụng với cơ chất có trong môi trường thach, cơ chất bị phân hủy dưới tác của enzyme làm cho độ đục của môi trường giảm, môi trường trở nên trong suốt. Độ lớn đường kính của phần trong suốt trên đĩa thạch phản ánh hoạt độ của enzyme. Phương pháp này xác định, định tính enzyme.
Phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch.
Cách tiến hành: Nấm TH được nuôi lắc với tốc độ 150 vòng trên phút trong môi trường lỏng và thu dịch môi trường nuôi sau 7 ngày. Thu 50 ml dịch môi trường bằng cách ly tâm và hút dịch trong phía trên.
Chuẩn bị đĩa thạch gồm có agar 15 g/l, và một trong các thành phần như: CMC (carboxymethyl cellulose), tinh bột (10 g/l); khử trùng môi trương thạch ở 121oC, áp suất 1 atm, trong 20 phút. Chờ thạch nguội bớt thì đổ đĩa ( ~ 25 ml/đĩa, đường kính 10 cm). Với skim milk (10g/l) thì hòa tan skim milk trong nước cất ấm đã khử trùng và trộn cùng dung dịch agar 3% ấm đã khử trùng theo tỉ lệ 1:1. Để đĩa nguội cho đông cứng.
Sử dụng đầu tip 1 ml vô trùng đục lỗ trên đĩa thạch (đường kính d = 8 mm). Dùng pipet vô trùng nhỏ 100 µl dich ly tâm trên vào lỗ thạch đã đục. Đối chứng là nước cất vô trùng. Để đĩa petri ở tủ lạnh 4 oC trong 2 h cho môi trường đủ thời gian thẩm thấu trong thạch. Sau đó ủ đĩa thạch trong tủ ấm 30 oC trong 24 h. 24 h tráng đĩa thạch với thuốc thử lugol 1% (đĩa chứa tinh bột), 3% (đĩa chứa CMC) và quan sát trực tiếp với đĩa chứa skim milk. Quan sát kết quả và đo đường kính vòng phân giải enzyme với thước đo chia kích thước mm.
2.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến sự phát triển của sợi nấm Thượng hoàng.
Môi trường lỏng ban đầu được chuẩn bị dựa trên tham khảo của Lee và cộng sự [18] như trong phần nguyên vật liệu. Các điều kiện tối ưu được thay đổi như ở dưới. Sợi nấm được nuôi trong bình tam giác 250 ml với 50 ml môi trường đã hấp khử trùng ở 121°C trong thời gian 15 - 20 phút, để nguội và cấy giống nấm theo tỉ lệ 10% giống. Mọi thao tác đổ đĩa, cấy giống được thực hiện trong tủ cấy vi sinh đã được khử trùng bằng đèn tím. Các thí nghiệm được lặp lại ít nhất 3, kết quả là giá trị trung bình giữa các lần thí nghiệm.
Ảnh hưởng của nguồn carbon: Nấm Thượng hoàng được nuôi cấy lắc trong môi trường, lần lượt thay thế glucose bằng fructose, maltose, dextrose với hàm lượng 4%; pH 6; 28°C; 150 vòng/phút; thời gian nuôi cấy 15 ngày. Thu và đánh giá lượng sinh khối sợi nấm.
Ảnh hưởng của nguồn nitơ: Môi trường và điều kiện khác như trên, lần lượt thay thế cao nấm men bằng tryptone, peptone, cao thịt bò, dịch chiết ngô với hàm lượng 2%.
Ảnh hưởng của nhiệt độ: Môi trường được giữ nguyên với nguồn các bon là glucose, nguồn nitơ là cao nấm men. Nhiệt độ được thay đổi từ 26°C 27°C , 28°C, 30°C , và 33°C . Các điều kiện khác cũng được giữ nguyên. Đánh giá sinh khối của sợi nấm sau 15 ngày nuôi cấy.
Ảnh hưởng của vòng lắc: Nấm Thượng hoàng được nuôi cấy trong môi trường dịch thể trên máy lắc tốc độ lần lượt là 100, 120, 150, 200 vòng/phút trong thời gian 15 ngày. Đánh giá sinh khối của sợi nấm ở chế độ lắc khác nhau.
Ảnh hưởng của pH: Nấm Thượng hoàng được nuôi cấy trên môi trường có pH là 4,0; 5,0; 5,5; 6,0; 7,0 sử dụng NaOH hoặc H2SO4 1N để chỉnh pH môi trường. Đánh giá sinh khối của sợi nấm sau 15 ngày nuôi cấy.
Xác định sinh khối sợi nấm khô: Xác định sinh khối sợi nấm khô: Từ 50 ml dịch nuôi cấy nấm, ly tâm 4.000 vòng/phút trong thời gian 30 phút, loại bỏ nước. Sinh khối sợi nấm được sấy ở 70°C tới khối lượng không đổi.