3. Nội dung nghiên cứu
3.1.2.Định danh mẫu nấm Thượng hoàng bằng đoạn gen ITS
Để định danh mẫu nấm Thượng hoàng thu thập, chúng tôi sử dụng trình tự đoạn gen ITS. DNA mẫu nấm Thượng hoàng được tách chiết theo phương pháp trong phần 2.2.2 chương 2. Quá trình nhân bản đoạn gen ITS được tiến hành với cặp mồi đặc hiệu ITS1 và ITS4 được sử dụng (ITS1: TCC GTA GGT GAA CCT GCG G; ITS4: TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC). Thành phần
và chu trình nhiệt như trình bày trong phần 2.2.3 chương 2. Kết quả khuếch đại đoạn gen ITS thể hiện trên hình 3.3.
Hình 3.3. Sản phẩm PCR đoạn gen ITS.
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
5 15 25 35 45 55
GAGAAAGAGT TTGAAGCGAG ACCTGCTGCT GGTGCGAAAT CGCGCATGTG CACGGTCTTC
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
65 75 85 95 105 115
GCGCTCAAAT CCAACTCAAA CCCCTGTGCA CCTTATATAT CGCGAGTCGA AGTTAGTAGC
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
CTGAGGTCTT GTAAGTAATT AGTAGAAGGG CGAAAGCGAG TCTTGCTCGT TAGGTAGCCT
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
185 195 205 215 225 235
TTCGAAAATG AAAGCGAGTG CGTCGGGTGA AGACTTCGGC TTGTCGTTAC AAAACACCTT
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
245 255 265 275 285 295
ATATTGTCTT TGTGAATGTA ATGCTCCTTG TGGGCGAAAA TAAATACAAC TTTCAACAAC
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
305 315 325 335 345 355
GGATCTCTTG GCTCTCGCAT CGATGAAGAA CGCAGCGAAA TGCGATAAGT AATGTGAATT
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
365 375 385 395 405 415
GCAGAATTCA GTGAATCATC GAATCTTTGA ACGCACCTTG CGCCCCTTGG TATTCCGAGG
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
425 435 445 455 465 475
GGCATGCCTG TTTGAGTGTC ATGTTTATCT CAAACCGCTC GTCTTTCTTA ATTGAAGGGC
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
485 495 505 515 525 535
TTGAGGTTTG GACTTGGAGG TTTACTGCTG GCGCCTTTCG AGGGGTCGGC TCCTCTTAAA
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
TACATTAGCT GGGCTTTGGC TCGCGTTTAC GGTGTAATAG TTGATTCCAT TCACCAACGA ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 605 615 625 635 645 655 GCGCTTGCCT GACGAGCTTG CTTCTAGCCG TCCGCGTCGT CGGACAAGGA GTCACCTCCT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 665 675 685 695 705 715
TCTTGACACC TTTGACCTCA AATCAGGTAG GATTACCCGC CGAACTTAAG CATATCATAG
….|....| .. 725
ACCGGAGGAA AG
Hình 3.4. Trình tự đoạn gen ITS của chủng Phellinus linteus thu tại vùng Madagui, huyện Đạ Huoai, tỉnh Lâm Đồng.
Trên điện di đồ (hình 3.3) cho thấy sản phẩm PCR có kích thước khoảng 750 bp. Kích thước này hoàn toàn phù hợp với tính toán lý thuyết. Các băng đều sáng, đậm, rõ nét và không có sản phẩm phụ.
Sau khi giải trình tự, đoạn gen ITS của nấm Thượng hoàng thu được 732 bp (hình 3.4). Trình tự đoạn gen ITS được blast trên NCBI cho thấy mẫu nấm thu thập được có trình tự tương đồng với Phellinus linteus strain DGUM25004 (99% tương đồng, 100% cover) với gene bank accession: AF080458. Trình tự DGUM25004 (99% trên ngân hàng gene thế giới vrên ngân hàng gene (phụ lục) Chủng nấm này được đặt tên là Phellinus linteus PLUS.