T ng quan v n m linh chi
Gi i thi u chung
Nấm linh chi, hay còn gọi là Ganoderma lucidum (G lucidum), thuộc họ Ganodermataceae, có tên gọi khác là Lingzhi trong tiếng Trung Quốc và Reishi trong tiếng Nhật Tại Việt Nam, nấm linh chi còn được biết đến với các tên gọi như nấm Lim, Tiên Thảo và nấm Trường Thọ Trên thế giới, chi Ganoderma có hơn 250 loài, trong đó có sáu loại chính được nghiên cứu bao gồm linh chi đen, đỏ, xanh, trắng, vàng và tím, nổi bật với những lợi ích cho sức khỏe Các loại nấm linh chi này được phân loại dựa trên màu sắc của chúng.
6 lo i và m i có công d ng khác nhau nh trình bày b ng 1.1
B ng 1.1: Phân lo i n m linh chi
V chua, tính bình, không đ c, sáng m t, t ng c ng trí nh
V đ ng, tính bình, không đ c, t ng c ng trí nh
V ng t, tính bình, không đ c, an th n
B ch chi V cay, tính bình, không đ c, ích ph i, an th n, ch a ho
H c chi V m n, tính bình, không đ c, ích th n
T ch V ng t, tính ôn, không đ c, tr đau nh t kh p x ng, gân c t
Nấm linh chi có hình dáng đặc trưng với cuống nấm dài hoặc ngắn, thường có đường kính từ 0,5-3 cm Cuống nấm thường không phân nhánh và đôi khi uốn khúc cong Mặt trên của nấm có màu nâu đen bóng, trong khi mũ nấm có hình tròn hoặc hơi xòe, với các vân gạch đậm tâm màu sắc đa dạng như vàng chanh, vàng nghệ, vàng nâu, vàng cam, đen nâu và nâu tím Khi nấm già, bề mặt sẽ trở nên láng bóng và phần đỉnh nấm có màu nâu ngày càng dày lên Kích thước nấm thường từ 5-12 cm và dày từ 0,8-3,3 cm, với phần đỉnh thường gồ lên hoặc hơi lõm.
Nấm linh chi có nhiều tác dụng hiệu quả lên các hệ cơ quan của cơ thể, bao gồm hệ miễn dịch, hệ thần kinh, hệ tuần hoàn và hệ tiêu hóa, giúp bài tiết các độc tố và điều trị bệnh tiêu hóa Các nghiên cứu về dược tính của nấm linh chi chủ yếu tập trung vào khả năng tăng cường hệ miễn dịch, điều hòa tim mạch, huyết áp và bảo vệ gan.
Thành ph n hóa h c
Nấm linh chi chứa nhiều lợi ích cho sức khỏe và có hơn 400 hợp chất hoạt tính sinh học, bao gồm triterpenoid, polysaccharide, nucleotide, sterol, steroid, axit béo và protein Nó có khả năng chống khối u, chống vi khuẩn, chống oxy hóa, và chống viêm Thành phần chính của nấm là nước, chiếm đến 90%, trong khi 10% còn lại bao gồm các thành phần dinh dưỡng như protein (10–40%), chất béo (28%), carbohydrate (3–28%), chất xơ (3–32%) và tro (8–10%) Ngoài ra, nấm còn chứa các vitamin, axit béo, khoáng chất thiết yếu như kẽm và selen.
B ng 1.2 trình bày hàm l ng ch t khoáng và vitamin có trong n m
B ng 1.2: Hàm l ng ch t khoáng và vitamin có trong n m linh chi [10]
Ch t khoáng và vitamin HƠmăl ng (mg/100g)
Các polysaccharide c a n m linh chi có tác d ng sinh h c nh kháng viêm, h đ ng huy t, ch ng loét, ch ng l i s hình thành kh i u, và t ng c ng kh n ng mi n d ch
Trong nấm linh chi, có hơn 200 loại polysaccharide, trong đó hai loại chính là galactan và glucan Glucan, đặc biệt là β-glucan, là một hợp chất sinh học có nhiều công dụng quý giá cho con người β-glucan là chuỗi các phân tử D-glucose liên kết với nhau qua liên kết (1,3)- hoặc (1,6)- Các sản phẩm tự nhiên chứa β-glucan đã được sử dụng từ lâu, nhưng nghiên cứu về β-glucan chỉ mới được chú trọng gần đây Hợp chất này được sử dụng để điều trị một số bệnh như ung thư, bệnh truyền nhiễm, bệnh tiêu hóa và các bệnh tim mạch Cấu trúc hóa học của β-glucan được trình bày trong hình 1.2.
Hình 1.2: C u trúc -glucan phân l p t n m linh chi [17]
Saponin, hay còn gọi là saponosid, là một nhóm glycosid có cấu trúc genin với thành phần triterpen hoặc steroid Chúng thường được tìm thấy trong thực vật, đặc biệt là trong các loại như nhân sâm và sao biển Tên gọi "saponin" xuất phát từ từ "sapo" trong tiếng Latin, có nghĩa là xà phòng.
Saponin là một nhóm hợp chất có tính tẩy rửa, được chia thành ba loại chính: saponin triterpenoid, saponin steroid và saponin steroid alkaloid Trong nấm linh chi, các triterpenoid thuộc nhóm saponin triterpenoid, đóng vai trò quan trọng trong các đặc tính sinh học của loại nấm này.
Triterpenoid là hợp chất hữu cơ có cấu trúc từ ba đơn vị terpene, với công thức phân tử C30H48 Chúng được phân loại thành sáu loại chính: acyclic (nhóm squalene), monocyclic (achilleol A), bicyclic (pouoside A), tricyclic (lansioside A), tetracyclic (bao gồm lanostane, dammarane và euphane), và pentacyclic (nhóm oleanane, ursane, lupane và hopane).
Triterpenoid là các hợp chất tự nhiên không có phần phân cực, có cấu trúc vòng và chứa nhiều nhóm chức như –OH, –O–, C=O Chúng có tính chất chung là tan tốt trong etanol và metanol, nhưng ít tan trong nước, ngoại trừ khi kết hợp với đường để tạo thành glycosid Các triterpenoid có độ bền và khả năng chịu nhiệt, thường được tìm thấy trong nấm linh chi.
Cấu trúc hóa học của các triterpenoid trong nấm linh chi được xác định dựa trên lanostan, là một chất chuyển hóa của lanosterol Nghiên cứu trước đây đã chiết xuất cao từ nấm bằng dung môi CH2Cl2 và CH3OH, thu được các triterpenoid thuộc nhóm lanostane, bao gồm ganoderol A, ganodermadiol, axit applanoxidic A, axit applanoxididic F, ganoderone A, lucidadiol và ganoderal A.
Nấm linh chi chứa các triterpenoid với hàm lượng từ 3-5%, trong đó các axit ganoderic A, B, C, D, F, H, I và J là thành phần chính Những triterpenoid này tạo nên sự khác biệt cho nấm linh chi so với các loại nấm khác Hàm lượng triterpenoid có thể thay đổi tùy theo các bộ phận khác nhau của nấm và giai đoạn phát triển của nó.
Hình 1.3: M t s axit ganoderic ph bi n trong n m linh chi
Trong các thành phần hóa học, nhóm triterpenoid là một trong những dược chất quý hiếm được phát hiện đầu tiên với nhiều tác dụng Triterpenoid là chất chính được sử dụng làm tiêu chuẩn để đánh giá chất lượng của các loài nấm linh chi khác nhau Nhóm này có hàm lượng cao trong nấm linh chi và có những tác động nổi bật, vì vậy trong luận văn này, đề tài nghiên cứu tập trung vào việc chiết xuất triterpenoid và thử nghiệm hoạt tính sinh học của cao chiết.
Ho t tính sinh h c c a triterpenoid
Kháng oxy hóa
Trong cơ thể sống, quá trình trao đổi chất diễn ra liên tục và tạo ra các phản ứng oxy hóa - khử, liên quan đến sự trao đổi năng lượng của tế bào Những phản ứng này tạo ra các dạng oxy hoạt động như superoxide (O2), hydro peroxid (H2O2) và hydroxyl (HO), dẫn đến sự tích lũy các sản phẩm oxy hóa trong cơ thể Sự tích lũy này có thể gây ra các tổn thương oxy hóa cho các sinh vật Ngoài ra, các gốc tự do cũng có thể phát sinh từ các nguyên nhân bên ngoài như tia UV, chất kích thích sinh trưởng, chất bảo quản thực phẩm và chất thải công nghiệp.
Các ion kim lo i chuy n ti p (Cu 2+ , Fe 2+ …) có th xúc tác cho ph n ng t o g c hydroxyl t superoxide và hydro peroxide Ph n ng này g i là ph n ng Fenton (1.1):
c ch t bào ung th
Kh n ng c ch t bào ung th c a các h p ch t có th là do quá trình apoptosis
Apoptosis là quá trình quan trọng trong sự phát triển và duy trì cân bằng tế bào bằng cách loại bỏ các tế bào không mong muốn Nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng, một số chất hóa học có khả năng kích thích quá trình apoptosis ở các tế bào và mô mục tiêu Các hợp chất tự nhiên đã được chứng minh là gây ra apoptosis ở một số dòng tế bào ung thư mà không ảnh hưởng đến tế bào bình thường Mặc dù cơ chế phân tách mà flavonoid gây ra apoptosis vẫn chưa được làm rõ hoàn toàn, nhưng một số cơ chế có thể liên quan bao gồm hoạt động của ADN topoisomerase I/II, tăng cường các loài oxy phản ứng (ROS), điều hòa con đường truyền tín hiệu, giải phóng cytochrome C và kích hoạt tiếp theo của caspase.
9 và caspase 3, [28] đi u hòa gi m bi u hi n Bcl 2 và Bcl X, nh ng thúc đ y bi u hi n Bax và Bak, kích ho t endonuclease và c ch Mcl 1 protein [29].
Kháng khu n
Ho t tính kháng khu n c a các h p ch t t nhiên th ng đ c th hi n nh th hi n trong hình 1.6 bao g m các quá trìnhμ
c ch sinh t ng h p vách t bào vi khu n b ng cách ng n c n sinh t ng h p l p peptidoglycan nên không t o đ c khung murein;
Gây rối loạn chức năng màng sinh chất có thể làm thay đổi sự khác biệt của điển hình trong và ngoài màng tế bào Các hợp chất tự nhiên có tính kháng khuẩn giúp bảo vệ màng sinh chất khỏi sự xâm nhập của vi khuẩn, đồng thời giảm thiểu khả năng chuyển hóa các chất bên trong tế bào.
Cấu trúc protein được hình thành từ các chuỗi axit amin, được tổng hợp chủ yếu tại ribosome Ngoài ra, các yếu tố tham gia vào quá trình dịch mã và sau dịch mã cũng đóng vai trò quan trọng Nếu protein không được tạo thành đúng cách, chúng sẽ không có hoạt tính sinh học.
Hình 1.4: C ch kháng khu n c a h p ch t có ho t tính sinh h c đ i v i vi khu n
Escherichia coli a) và Staphylococcus aureus b) [30]
1.3 Các ph ngăphápătrích ho t ch t trong n m linh chi
Trích ly là phương pháp quan trọng để tách hợp chất sinh học từ nguyên liệu có nguồn gốc thực vật Hiện nay, các nhà nghiên cứu áp dụng nhiều phương pháp trích ly khác nhau, từ quy mô phòng thí nghiệm đến công nghiệp, nhằm thu nhận các hợp chất có hoạt tính sinh học Những hợp chất này được trích xuất từ các bộ phận khác nhau của thực vật như lá, thân, rễ, hạt, hoa và quả, sử dụng các kỹ thuật trích ly phù hợp.
M i ph ng pháp trích ly đ u có u nh c đi m riêng nh th hi n b ng 1.4 [32]
B ng 1.4: u và nh c đi m c a ph ng pháp trích ly
Ph ngăpháp uăđi m Nh căđi m
Ph ng pháp truy n th ng
Ngâm d m n gi n, d th c hi n, chi phí th p
N ng su t th p, thao tác th công, m t nhi u th i gian, có th t vài gi đ n vài tu n và s d ng l ng dung môi l n
Trích đ c ho t ch t t i đa t ng ng v i nhi t đ xác đnh, d dàng th c hi n
L ng m u l n (kho ng vài gam đ n vài ch c gam), nhi t đ t i bình trích cao (b ng
12 nhi t đ đun), th i gian trích dài, ho t ch t có kh n ng b phân h y
Thi t b d s d ng, v n hành đ n gi n, th i gian trích ly ng n, hi u su t trích ly cao, gi m đ c nhi t đ và áp su t,
T ng t c đ hòa tan và t ng kh n ng khu ch tán c a các ch t vào trong dung môi, l ng hóa ch t s d ng ít
Dung môi khó có thể làm mới trong suốt quá trình trích ly, do đó hiệu suất trích ly bằng siêu âm phụ thuộc vào hệ số phân ly, thời gian lắc và tỷ lệ dung môi Việc sử dụng nhiều dung môi có thể dẫn đến việc nâng cao hiệu suất trích xuất, giúp tối ưu hóa quá trình trích ly các hợp chất có giá trị.
Không có quán tính nhi t đ, thiết bị trích ly cao giúp tối ưu hóa hiệu suất, an toàn và bảo vệ môi trường Với nguồn năng lượng sạch, thời gian trích ly nhanh chóng và tác động đặc biệt đến các phân tử phân cực, thiết bị này là lựa chọn lý tưởng cho quy trình trích ly hiệu quả.
Không áp d ng cho các h p ch t không phân c c, quy mô th nghi m nh , nhi t đ sôi các dung môi đ t đ c r t nhanh và có th gây n enzym
Tăng năng suất trích ly và hoạt tính sinh học là yếu tố quan trọng giúp giảm lượng dung môi cần thiết trong quá trình chiết xuất Nhờ đó, thời gian chiết xuất được rút ngắn và nâng cao năng suất của hợp chất cần trích ly.
Chi phí enzym đ t ti n, khó nâng cao lên quy mô công nghi p vì enzym là các phân t protein, khác v i các ch t xúc tác hóa h c thông th ng
CO2 là m t ch t d ki m, r ti n, là m t ch t tr , ít có ph n ng k t h p v i các ch t c n
Chi phí cao, yêu c u ph i n m v ng thao tác v n hành
ăCácăph ngăphápătríchăho t ch t trong n m linh chi
Ph ng pháp trích ly b ng l u ch t siêu t i h n
1.3.1.1 Tr ng thái siêu t i h n c a l u ch t
Dung môi siêu tĩnh là trạng thái đặc biệt của chất lỏng xảy ra dưới nhiệt độ và áp suất cao trên thị trường hiện nay Trong điều kiện thông thường, chất có thể tồn tại ở ba trạng thái: rắn, lỏng và khí Khi nén chất khí ở áp suất cao, chất khí sẽ hóa lỏng Tuy nhiên, tại một giá trị áp suất nhất định, nếu nâng nhiệt độ lên, chất lỏng sẽ không trở về trạng thái khí mà chuyển vào vùng trạng thái siêu tĩnh Trạng thái này kết hợp nhiều đặc tính của cả chất khí và chất lỏng, tạo ra một dung môi với tính trung gian giữa khí và lỏng.
B ng 1.5: Tr ng thái t i h n c a s c a m t s l u ch t
Kh iăl ngă phơnăt ă (g/mol)
Nhi tăđ ă t iăh năT c (K) Ễpăsu tă t iăh năP c
Kh iăl ngă riêngăt iăh nă
Trong s các l u ch t, CO2 đ t tr ng thái siêu t i h n đi u ki n không quá kh c nghi t và thân thi n môi tr ng nên đ c s d ng ph bi n Nh ng đ c tính c a khí nén
CO2 đư đ c quan tâm cách đây h n 130 n m N m 1κ61, Gore là ng i phát hi n ra
CO2 lỏng có khả năng hòa tan comphor và naphtalen một cách dễ dàng, tạo ra màu sắc rất đẹp, nhưng lại khó hòa tan các chất béo Andrew (1κ75 – 1κ76) đã nghiên cứu trạng thái siêu tĩnh của CO2, tức là CO2 chuyển từ trạng thái lỏng sang trạng thái khí mà vẫn giữ được áp suất và nhiệt độ gần giống như các số liệu hiện tại Sau đó, Buchner (1λ06) cũng đã công bố về một số hợp chất hữu cơ khó bay hơi có khả năng hòa tan trong CO2.
CO2 siêu t rạng cao hơn nhiều trong CO2 lỏng Từ năm 1960, nhiều công trình nghiên cứu về dung môi trạng thái siêu t rạng đã được thực hiện, trong đó có các dung môi như ethanol, methanol và các chất tan dùng để nghiên cứu nhựa dẻo, cùng với các dẫn xuất halogen.
CO2 siêu tới hạn là một dung môi độc đáo được sử dụng trong các phương pháp chiết xuất nhờ vào các tính chất vượt trội mà các dung môi khác không có Từ thế kỷ 80, công nghệ này đã được phát triển mạnh mẽ và thu hút sự nghiên cứu sâu rộng, nhấn mạnh vai trò quan trọng của CO2 trong các ứng dụng công nghiệp.
Khí CO2 đ c đ a lên nhi t đ , áp su t cao h n nhi t đ , áp su t t i h n (trên TC 31 o C, PC = 73,8 bar), CO2 s chuy n sang tr ng thái siêu t i h n T i tr ng thái này
CO2 mang hai đ c tínhμ c tính phân tách c a quá trình trích ly và đ c tính phân tách c a quá trình ch ng c t
1.3.1.3 u đi m c a dung môi CO2 siêu t i h n
CO2 tr ng thái siêu t i h n có các đ c tính n i b t nh μ
T tr ng x p x t tr ng c a ch t l ng;
Kh n ng hòa tan d đi u ch nh b ng nhi t đ và áp su t
1.3.1.4 u đi m so v i dung môi khác
CO2là m t ch t d ki m, r ti n vì nó là s n ph m ph c a nhi u ngành công ngh hoá ch t khác;
Là m t ch t tr , ít có ph n ng k t h p v i các ch t c n tách chi t;
Không b t l a, không duy trì s cháy;
Không làm ô nhi m môi tr ng;
CO2không đ c v i c th , không n mòn thi t b ;
Có sự chuyển hóa khi hòa tan và không hòa tan các kim loại nặng, điều này điều chỉnh các thông số trạng thái và tạo ra các tính chất lý hóa khác nhau của dung môi.
1.3.1.5 u đi m c a k thu t l u ch t siêu t i h n so v i các ph ng pháp truy n th ng
S n ph m có ch t l ng caoμ i v i tinh d u thì có màu, mùi t nhiên, không l n nhi u thành ph n không mong mu n, v i các h p ch t t nhiên thì tách đ c các ch t có ho t tính cao;
Là m t k thu t hi n đ i và an toàn v i các s n ph m t nhiên;
Không gây ô nhi m môi tr ng.
1.3.1.6 Nguyên lý ho t đ ng và s bi n đ i tr ng thái c a CO2 trong quá trình trích ly Khí CO2 lúc ban đ u trong bình ch a tr ng thái 1 th ng là áp su t trong kho ng
45 – 55 bar, nhi t đ 12 – 20 o C Khi đ c h nhi t đ đi u ki n đ ng áp t tr ng thái
Quá trình chiết xuất bằng CO2 siêu tới hạn bắt đầu khi CO2 ở trạng thái lỏng tại nhiệt độ 0 – 1 độ C và áp suất cao Khi CO2 lỏng được nén dưới áp suất cao, dòng chảy được điều chỉnh vào bình chiết Qua phần làm lạnh, CO2 lỏng được nén qua van điều chỉnh để đạt được nhiệt độ và áp suất phù hợp, chuyển sang trạng thái 3 Tại trạng thái 3, CO2 tiếp tục được điều chỉnh để chuyển sang trạng thái siêu tới hạn 4 trong bình chiết Quá trình chiết xuất có thể thực hiện liên tục hoặc gián đoạn tùy theo yêu cầu công nghệ Van an toàn áp suất được lắp đặt để bảo vệ hệ thống trong quá trình chiết Sau khi kết thúc, dịch chiết được dẫn vào bình phân tách, nơi áp suất giảm và các phân đoạn khác nhau được tách ra Trong quá trình này, hệ thống thiết bị không thu hồi CO2, và khí CO2 tách ra được sử dụng trở lại trong sản xuất công nghiệp.
Hình 1.6a minh họa trạng thái của CO2 ở điểm ba (5,04 atm và 56,7 °C), cho thấy sự phân cách rõ ràng giữa hai pha rắn và pha khí Hình 1.6b thể hiện sự tồn tại của CO2 ở điểm nhiệt độ cao hơn, với áp suất được duy trì trong khi nhiệt độ đạt đến trạng thái siêu tĩnh, và CO2 ở trạng thái lỏng Hình 1.6c mô tả trạng thái siêu tĩnh của CO2 (73,8 atm và 31,1 °C), nơi pha lỏng và pha khí không tồn tại riêng biệt mà tạo thành một pha đồng nhất gọi là pha siêu tĩnh.
Hình 1.6: S chuy n pha siêu t i h n c a CO2
1.3.1.7 S đ h th ng trích ly b ng CO2 siêu t i h n
H th ng trích ly chính đ c th hi n nh hình 1.7
Hình 1.7: H th ng CO2 siêu t i h n
Khí CO2 đ c làm l nh b ng thi t b làm l nh Nhi t đ làm vi c: 10 đ n 40 °C
L u l ng: 8 L/phút Công su t làm l nh: 680 BTU/gi H th ng làm l nh đ c th hi n hình 1.8
Hệ thống làm lạnh dung môi được bổ sung vào bình chứa bằng hệ thống bơm dung môi với áp suất vận hành lên đến 10.000 psi Lưu lượng bơm có thể điều chỉnh tối đa lên đến 10 mL/phút.
12 mL/phút) th hi n hình 1.9 B đi u khi n vi x lý: Hi n th trên màn hình c m
Tình hình nghiên c uătrongăvƠăngoƠiăn c
Tình hình nghiên c u trong n c
Việt Nam đang ngày càng chú trọng nghiên cứu công nghệ CO2 siêu tới hạn để trích ly hoạt chất từ nấm linh chi và các loại thảo dược khác Những kết quả nghiên cứu đã đạt được thể hiện tiềm năng phát triển đa dạng và phong phú trong lĩnh vực này.
B ng 1.6: Tình hình nghiên c u trong n c
Caroten trong h t qu g c đ c trích ly b ng k thu t CO2 Bên c nh đó, nh h ng c a áp su t, nhi t đ và l u l ng khí đ n hi u su t trích ly c ng đ c kh o sát
Mô hình toán h c đ c th c hi n đ tính toán đ hòa tan c a d u
Quá trình trích ly carbon dioxide siêu tĩnh diễn ra dưới áp suất từ 200 đến 400 bar, nhiệt độ từ 313 đến 343K, với lưu lượng dòng chảy đạt 50 đến 90 kg CO2 mỗi giờ Mô hình toán học và dữ liệu hòa tan của dung môi đã được xác định cho điều kiện áp suất 400 bar và nhiệt độ 343K.
K, đ thu h i d u g c trên 95 % sau 120 phút trích ly Hàm l ng Caroten trong d u g c lên đ n 11.000 ppm
Nghiên c u kh o sát nh h ng c a nhi t đ và th i gian trích ly đ n hàm l ng polysaccharide và tannin trong n m linh chi đ
T i nhi t đ 130 o C và th i gian trích ly
30 phút cho hàm l ng polysaccharide trong n c linh chi cao nh t (684,1 ± 14,5 mg/L) Hàm l ng tannin cao nh t (630,9 ±18,2 mg/L) đ t đ c khi th c hi n quá trình trích nhi t đ 120 o C và th i gian 45 phút
[35] nh l ng các thành ph n có trong n m linh chi nuôi tr ng t i Vi t Nam và gi ng hoang dã b ng HPLC
Xác đ nh đ ng th i 17 h p ch t bao g m triterpene lanostane m i (butyl lucidenate E2, uracil, axit 5- dihydrobenzoic, 12 d n xu t triterpene lanostane nh l ng 14 triterpenoid trong sáu lo i n m hoang dã và b n lo i n m đ c nuôi tr ng
(2019) [36] ánh giá hi u qu sinh h c và các thành ph n ho t tính sinh h c chính c a ba ch ng n m linh chi đ c tr ng t i th tr n Tam o
Hàm l ng cao h n c a axit lucidenic
N và axit ganoderic A đ c phát hi n trong ch ng GA3 và ch ng GA2 v i hàm l ng l n l t là 0,33 mg/g và 0,32 mg/g, đ i v i axit lucidenic N, và t l 2,38 mg/g và 2,08 mg/g đ i v i axit ganoderic A
Dưới đây là một đoạn văn được viết lại từ nội dung bài viết của bạn, tuân thủ các quy tắc SEO:Quá trình trích ly dầu và nước từ dừa bằng CO2 siêu tới hạn diễn ra dưới điều kiện áp suất, nhiệt độ và lưu lượng khác nhau Tổng sản lượng dầu và nước thu được được kiểm soát chặt chẽ trong quá trình khai thác Các hợp chất tocopherol và carotenoid được phân tích cả trong mẫu dầu trích ly và trong bã dừa.
Nghiên cứu cho thấy rằng việc thu hồi các hợp chất có giá trị từ dòng chảy chất thải đạt hiệu suất từ 60-70% sau 60 phút và 80-90% sau 120 phút Sử dụng kỹ thuật CO2 siêu tới hạn giúp thu hồi nhiều tocopherol và carotenoid hơn so với các phương pháp truyền thống.
Mô hình hóa quá trình trích ly c ng đ c th c hi n đ m r ng quy mô.
Tình hình nghiên c u ngoài n c
Nh ng nghiên c u ngoài n c v k thu t CO2 siêu t i h n đ c trình bày trong b ng 1.7
B ng 1.7: Tình hình nghiên c u ngoài n c
Nhóm nghiên c u Tóm t t nghiên c u K t qu
Polysaccharide trong n m linh chi đ c trích ly b ng k thu t
CO2 siêu t i h n nh h ng c a các thông s g m áp su t, nhi t đ , th i gian và t c đ dòng CO2 đ n hàm l ng polyaccharide đ c kh o sát
Hình thái giáp bào t nguyên ban đầu và bào t được xử lý đã được nghiên cứu thông qua nh SEM Điều kiện tối ưu để phá vỡ bào t nấm là áp suất 35 MPa, nhiệt độ 25 độ C, thời gian 4 giờ và tốc độ dòng CO2 10 kg/h Sau quá trình trích ly CO2 siêu tĩnh, hiệu suất polysaccharid đạt 2,98% Kỹ thuật CO2 siêu tĩnh là phương pháp trích ly nhanh, hiệu quả và tiên tiến để phá vỡ bào t của nấm linh chi.
Khảo sát ảnh hưởng của áp suất, thời gian và nhiệt độ đến hàm lượng chất béo trong nấm linh chi Tối ưu hóa điều kiện trích xuất bằng CO2 siêu tới hạn bằng phương pháp luân phiên, đã phân tích và so sánh sản lượng lipid, hàm số axit béo và nội dung sterol trong GSL được trích xuất bởi SFE, soxhlet và sonication.
Dưới điều kiện SFE tại áp suất 35 MPa, thời gian 3 giờ và nhiệt độ 48 độ C, hiệu suất lipid đạt 29,50%, cao hơn đáng kể so với phương pháp xà phòng hóa (23,74%) và không có sự khác biệt đáng kể so với chiết xuất Soxhlet (30,02%).
Khảo sát ảnh hưởng của lưới chất siêu tĩnh đến việc loại bỏ phthalate trong bào tử nấm linh chi Bên cạnh đó, ảnh hưởng của SFE lên các giá trị axit và peroxit của dầu bào tử cũng được đánh giá.
Lựa chọn siêu tách tinh chất từ bào tẩm linh chi sử dụng 100% di-iso-butyl phthalate, di-nbutyl phthalate và di-2-ethylhexyl phthalate Hàm lượng triterpenoid và polysaccharide được chiết xuất từ bào tẩm linh chi đạt 8,145 ± 0,248 mg/100g và 1,161 ± 0,027 mg/100g.
Triterpenoid trong nấm linh chi được trích ly bằng phương pháp siêu âm, với các yếu tố ảnh hưởng như nhiệt độ chiết, nồng độ ethanol, thời gian trích ly và tỷ lệ dung môi Nguyên liệu được khảo sát dựa trên mô hình BBD Hiệu suất trích ly triterpenoid đạt 0,99 %, không có sự khác biệt đáng kể giữa các giá trị dự đoán (0,λλ %) và thực nghiệm (0,97 ± 0,04 %).
Ngoài ra, nghiên cứu cho thấy hàm lượng triterpenoid trong chiết xuất có khả năng ức chế sự phá vỡ tế bào dưới tác động của sóng siêu âm Thêm vào đó, chiết xuất này cũng thể hiện khả năng bắt gốc tự do DPPH.
Bào tử nấm linh chi được chiết xuất bằng công nghệ CO2 siêu tới hạn để thu nhận các axit béo Các axit béo này sau đó được vi bọc bằng phương pháp phun sấy đông lạnh nhằm bảo vệ và hạn chế quá trình oxy hóa.
Các axit béo t n m linh chi đ c vi b c b ng hai ch t mang là gum Arabic: maltodextrin và hi u qu vi b c lên đ n 83,57 % v i nhi t đ 80 °C, n ng đ ch t bao 1 % và t l axit béo: ch t mang là 1:
3 K t qu kh o sát kh n ng kháng oxy hóa cho th y vi b c
23 góp ph n t ng c ng kh n ng kháng oxy hóa c a các axit béo
Phương pháp trích ly có hiệu quả cao trong việc chiết xuất axit ganoderic từ nấm linh chi, với các yếu tố ảnh hưởng như nồng độ, thời gian ngâm và tỉ lệ nguyên liệu Ngoài ra, phương pháp đáp ứng bậc hai (BBD) được áp dụng để tối ưu hóa điều kiện trích ly, giúp nâng cao hiệu suất chiết xuất.
Hàm l ng axit ganoderic cao nh t đ t đ c b ng cách nghi n m u n m linh chi v i natri bicacbonat (372,60 mg/g) và axit xitric trong 0,87 phút v i t l n c:nguyên li u là 10,58
Ph m vi hi u chu n tuy n tính là t 0,01 –5 g/mL đ i v i axit lucidenic C, axit ganoderic G, axit ganoderic A, axit lucidenic
A, axit ganoderic D, axit ganoderic F và có đ tuy n tính t t v i h s t ng quan 0,λλλ1 Ngoài ra, LOD thu đ c c a sáu ch t phân tích đích là 1,46 –2,97 ng/mL và LOQ là 4,88 –9,90 ng/mL.
Tính c p thi t, m c tiêu, n iădung,ăph ngăphápănghiênăc u
Tính c p thi t
Mối quan hệ giữa các nhà khoa học trong quá trình nghiên cứu rất quan trọng, đặc biệt là trong việc trích ly các hợp chất tự nhiên một cách hiệu quả và bền vững Đề tài "Nghiên cứu thu nhận cao chiết từ nấm linh chi bằng kỹ thuật CO2 siêu tới hạn và thử nghiệm hoạt tính sinh học" là một nghiên cứu tiên tiến tại Việt Nam, mang lại tính ứng dụng cao và thân thiện với môi trường Các công bố quốc tế cho thấy rằng phương pháp trích ly bằng kỹ thuật siêu tới hạn thu được hàm lượng triterpenoid cao hơn và có hoạt tính tốt hơn so với các phương pháp truyền thống.
24 pháp nh μ vi sóng, Soxhlet, siêu âm, truy n th ng…V i nh ng u đi m v t tr i nh v y thì đây đ c xem là m t trong nh ng h ng nghiên c u kh thi.
M c tiêu
Trích ly thành công ho t ch t triterpenoid t n m linh chi b ng k thu t l u ch t siêu t i h n và kh ng đ nh ho t tính sinh h c c a cao chi t
a ra đi u ki n trích ly phù h p đ đ t đ c hàm l ng triterpenoid cao nh t
Kh ng đnh ho t tính sinh h c c a cao chi t thông qua đánh giá ho t tính: kháng oxy hoá, c ch t bào ung th và kháng khu n.
N i dung nghiên c u
Nghiên cứu này khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện trích ly triterpenoid từ nấm linh chi bằng phương pháp CO2 siêu tới hạn, đồng thời đánh giá ảnh hưởng của các thông số vận hành đến hàm lượng triterpenoid thu được.
N i dung 2: Phân tích b m t nguyên li u tr c và sau khi trích ly và các nhóm ch c đ c tr ng có trong cao chi t;
N i dung 3: Th nghi m ho t tính sinh h c c a các lo i cao chi t thông qua đánh giá kháng oxy hóa, kháng ung th và kháng khu n n i dung 1.
Ph ng pháp nghiên c u
1.5.4.1 Ph ng pháp kh o sát s nh h ng c a đi u ki n trích ly đ n hàm l ng triterpenoid a) nh h ng c a t ng y u t
Nghiên cứu này tập trung vào việc khảo sát bốn yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly, bao gồm áp suất, tỷ lệ etanol/nguyên liệu, nhiệt độ và thời gian trích ly Phương pháp thực hiện là luân phiên tĩnh biên, trong đó các yếu tố được khảo sát một cách có hệ thống để tối ưu hóa hiệu suất trích ly.
6 m c v i hàm m c tiêu là hàm l ng triterpenoid b) nh h ng đ ng th i c a các y u t
Sau khi lựa chọn các không biên thiên phù hợp, tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố áp suất, nhiệt độ và thời gian bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology - RSM) Phương pháp RSM bao gồm các kỹ thuật toán học để tối ưu hóa quá trình.
Phương pháp RSM (Response Surface Methodology) được áp dụng để xác định các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hàm mục tiêu trong mô hình thiết kế và dữ liệu thực nghiệm Phương pháp này cho phép kiểm soát các yếu tố có thể đo lường và đánh giá ảnh hưởng của chúng đến kết quả Với số lượng thí nghiệm hạn chế, RSM giúp xác định các điều kiện tối ưu cho quá trình, từ đó xây dựng mô hình tính toán thực nghiệm Mục tiêu là tìm ra giá trị tối đa cho hàm mục tiêu trong các điều kiện đã xác định.
Ph ng trình h i quy c a RSM có d ng t ng quát nh th hi n ph ng trình (1.2)
Y là hàm mục tiêu của quá trình nghiên cứu, trong đó các hệ số quy định ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm mục tiêu Các yếu tố xi ảnh hưởng đến hàm mục tiêu, trong khi bij thể hiện mối quan hệ đồng thời giữa hai yếu tố xi và xj Bijk là hệ số quy định mối quan hệ đồng thời của ba yếu tố xi, xj và xk Cuối cùng, bi là hệ số quy định ảnh hưởng của hai yếu tố đến kết quả thực nghiệm.
Trong luận văn này, tác giả áp dụng phương pháp RSM theo mô hình Box-Behnken, vì đây là một thiết kế tối ưu với ít điểm mấu và yêu cầu ba cấp độ cho mỗi yếu tố, với các thiết lập là -1, 0 và +1 Phương pháp này cho phép phân tích hàm lượng hoạt chất trong cao chiết một cách hiệu quả.
V xác định hàm lượng các hoạt chất triterpenoid có thể thực hiện bằng nhiều phương pháp phân tích hiện đại Nghiên cứu này đã xác định được hàm lượng axit ursolic, một triterpenoid quan trọng, thông qua sự ghi nhận lăng kính hiệu năng cao.
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật hóa lý dùng để tách và định lượng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên sự phân bố khác nhau giữa các chất trong hai pha luôn tiếp xúc nhưng không trộn lẫn với nhau: pha tĩnh và pha động (dung môi rửa giải) Khi dung dịch của hỗn hợp các chất cần phân tích được đưa vào cột bằng hệ thống bơm ở áp suất cao, quá trình tách biệt các thành phần diễn ra hiệu quả.
Sự phân tích thành phần phụ thuộc vào bản chất của vật liệu trong cấu trúc và chất cần phân tích Khi thay đổi thành phần pha, sự tương tác giữa chất cần phân tích và pha động có thể khác nhau, dẫn đến sự di chuyển của các chất này trong quá trình phân tách.
HPLC là một phương pháp phân tích hiện đại, được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như dược phẩm, thực phẩm và môi trường nhờ độ nhạy cao, có khả năng phát hiện hàm lượng vật chất ở mức ppm, ppb Vì vậy, việc sử dụng HPLC để phân tích hàm lượng axit ursolic trong cao chiết là hoàn toàn phù hợp.
Thi t b HPLC g m các bình ch a dung môi, b m cao áp, b ph n tiêm m u, c t s c kí, đ u dò, b ph n ghi nh n tín hi u và bình th i đ c mô t trong hình 1.10
Hàm lượng triterpenoid trong cao chiết nấm linh chi được phân tích bằng phương pháp HPLC, và tính toán dựa theo phương trình chuẩn 1.3, trong đó x là hàm lượng axit ursolic (g/mL) và y là diện tích đỉnh (peak) sắc ký Hiệu quả trích ly được đánh giá thông qua hàm lượng axit ursolic trong nấm linh chi, được tính theo công thức 1.4.
Hình 1.11:H th ng s c ký l ng hi u n ng cao HPLC
Hàm lượng axit ursolic trong nấm linh chi được xác định bằng công thức G xV n m (1.4), trong đó G là hàm lượng axit ursolic (mg/g), x là hàm lượng axit ursolic (g/mL), V là thể tích dung môi (mL), n là hệ số pha loãng, m là khối lượng nấm linh chi ban đầu (g), và là hệ số chuyển đổi.
1.5.4.2 Phân tích b m t nguyên li u tr c và sau khi trích ly và các nhóm ch c đ c tr ng có trong cao chi t a) Phân tích b m t nguyên li u li u b ng kính đi n t quét
Kính hiển vi điện tử quét phân giải cao (FE-SEM) là một loại kính hiển vi sử dụng chùm điện tử để quét bề mặt mẫu, cho phép tạo ra hình ảnh với độ phân giải cao.
Việc thực hiện vi c t o nh c a m u đ c th c hi n thông qua ghi nh n và phân tích các b c x phát ra t t ng tác c a chùm đi n t v i b m t m u Ph ng pháp SEM v i u đi m cho phép thu đ c nh ng b c nh ba chi u rõ nét mà không cần ph c t p trong khâu chu n b m u Phân gi i c a nh SEM l n g p nhi u l n so v i kính hi n vi quang h c, có th đ t t i 10 – 100 nm Ng d ng c ung c p hình thái b m t nguyên li u tr c và sau khi trích, cùng với phân tích thành ph n cao chi t b ng ph h ng ngo i chuy n hóa Fourier.
Ph h ng ngo i chuy n hóa Fourier (Fourier – transform infrared spectroscopy – FTIR) s d ng các b c x đi n t v i b c sóng 4000 – 400 cm -1 đ xác đ nh các nhóm ch c, các liên k t trong c u trúc v t li u
Chùm tia hồng ngoại được phát ra từ nguồn độc tách ra thành hai phần, một phần đi qua mẫu và phần còn lại đi qua môi trường đo Đầu dò sẽ so sánh cường độ hai chùm tia và chuyển đổi thành tín hiệu điện tương ứng với phần bức xạ được hấp thụ bởi mẫu Dòng điện này có cường độ rất nhạy, do đó cần phải khuếch đại nhiều lần trước khi chuyển sang phần thu ghi và lưu trữ vào máy tính để xử lý số liệu Kết quả được biểu diễn bằng đồ thị, trong đó trục hoành là số sóng (cm^-1) và trục tung là độ truyền qua (%) Ứng dụng: Xác định sự có mặt của các nhóm chức trong cao su tự nhiên.
1.5.4.3 Th nghi m ho t tính sinh h c c a cao chi t a) Ho t tính kháng oxy hoá
Có nhiều phương pháp khảo sát hoạt tính oxy hóa, trong đó hoạt tính kháng oxy hóa được thực hiện chủ yếu bằng hai phương pháp: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) và phương pháp ferric reducing-antioxidant power (FRAP).
Ph ng pháp b t g c t do DPPH
Tính m i
Nấm linh chi là loại dược liệu được nghiên cứu khá nhiều tại Việt Nam và trên thế giới Tuy nhiên, việc nghiên cứu điều kiện trích ly triterpenoid (axit ursolic) bằng kỹ thuật CO2 siêu tới hạn vẫn còn hạn chế Bên cạnh đó, việc áp dụng quy hoạch thực nghiệm để tìm ra điều kiện trích ly với hàm lượng hoạt chất cao nhất còn là hướng nghiên cứu mới Thêm vào đó, việc sử dụng các phương pháp phân tích hiện đại để xác định hàm lượng hoạt chất một cách chính xác so với phương pháp chuẩn cũng rất cần thiết Việc đánh giá các hoạt tính sinh học như kháng oxy hóa, kháng ung thư, kháng khuẩn và kháng tiểu đường góp phần quan trọng trong việc định giá dược liệu của nấm linh chi.
Ô nhiễm môi trường đang gây ra nhiều nguy cơ ảnh hưởng đến sức khỏe con người, và việc sử dụng các hoạt chất có nguồn gốc sinh học từ nấm linh chi đang được quan tâm Trích ly triterpenoid từ nấm linh chi bằng kỹ thuật CO2 siêu tới hạn là phương pháp hiệu quả và ít độc hại, giúp giảm ô nhiễm môi trường CO2 là dung môi dồi dào và phù hợp cho quá trình trích ly, trong khi cao chiết có hàm lượng hoạt chất cao, mang lại nhiều lợi ích trong y học, dược phẩm và mỹ phẩm.
2.1 Nguyên li u, hoáăch t,ăd ng c , thi t b vƠăđ aăđi m th c hi n
Nấm linh chi sử dụng trong luận văn này là loại nấm dược trị hoàn toàn từ linh chi Ngọc Anh, Củ Chi, Thành phố Hồ Chí Minh Mẫu nấm được đánh giá là loài linh chi đỏ (Ganoderma lucidum) Nấm được xay và rây qua rây 1 mm, có độ ẩm khoảng 10% và bảo quản điều kiện 4 độ C để tiến hành các thí nghiệm Hình 2.1 mô tả nấm linh chi trước và sau khi xay.
Hình 2.1: Qu th n m Linh chi a) tr c khi xay và b) sau khi xay
Các hóa ch t s d ng đ c trình bày nh b ng 2.1
B ng 2.1: Các hóa ch t đ c s d ng
STT Hóa ch t Tr ng thái Ngu n g c
Các thi t b ph c v lu n v n t i Phòng thí nghi m Tr ng đi m i h c Qu c gia H
Chí Minh Công ngh Hóa h c và D u khí (Key CEPP Lab), Tr ng i h c Bách Khoa- HQG H Chí Minh đ c th hi n trong b ng 2.2
B ng 2.2: Thi t b s d ng trong lu n v n
STT Tên thi t b Thi t b Thông s k thu t
B siêu âm Sonic 410 (40 kHz- 700W) c a hãng Hwashin-Hàn
Máy ly tâm ROTANA 460 (2000 vòng/phút) c a hãng Hetich- c
Máy UV-vis Horiba Dual-FL,
H th ng HPLC 1200 Series c a hãng Agilent, M
FTIR Alpha II c a hãng Bruker, c
Applied Separations, M ) đ c s d ng, có nhi t đ ho t đ ng có th lên t i 240 o C, áp su t v n hành 10,000 psi (~6λ0 bar), l u l ng b m 400 mL/phút.
Các thí nghi m đ c th c hi n t i Phòng thí nghi m Tr ng đi m i h c Qu c gia H Chí Minh Công ngh Hóa h c và D u khí
(Key CEPP Lab), Tr ng i h c Bách Khoa- HQG H Chí Minh
2.2.1 Kh o sát nh h ng c a các y u t đ n hàm l ng triterpenoid
Quy trình trích ly triterpenoid t n m linh chi đ c th hi n hình 2.2
Hình 2.2: S đ quy trình trích ly triterpenoid t n m linh chi b ng k thu t CO2 siêu t i h n
Quá trình trích ly đ c th c hi n b ng h th ng CO2 siêu t i h n (Spe ed SFE model
Trong nghiên cứu này, quá trình chiết xuất được thực hiện bằng cách sử dụng thiết bị trích ly áp suất cao, với áp suất tối đa 10.000 psi (600 bar) và nhiệt độ lên tới 240 °C Các vòng cao su và polypropylene được lắp vào hai đầu của ngưng trích, nơi chứa nguyên liệu cần chiết xuất Trước khi bắt đầu, áp suất và nhiệt độ của CO2 được điều chỉnh đến trạng thái siêu tới hạn Quá trình chiết xuất được thực hiện với các thông số khác nhau về nhiệt độ, áp suất, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu và thời gian Lưu lượng CO2 và etanol được duy trì ở mức không đổi là 2 L/phút Sau khi hoàn tất quá trình chiết xuất, khí CO2 được loại bỏ bằng cách giảm áp suất Dịch chiết sau đó được cô quay chân không để thu được cao chiết, và chất lượng cao chiết được xác định bằng phương pháp HPLC.
Luận văn nghiên cứu các yếu tố có ảnh hưởng đến quá trình trích ly, bao gồm áp suất, tỉ lệ ethanol/nguyên liệu, thời gian và nhiệt độ Các yếu tố này được khảo sát nhằm xác định sự ảnh hưởng của từng yếu tố đến quá trình trích ly, và mỗi yếu tố được khảo sát theo 6 mức khác nhau Thí nghiệm được lặp lại 3 lần để tính giá trị trung bình, với vùng khảo sát được thể hiện trong bảng 2.3.
N m linh chi sau khi xay ă
Y u t kh o sát Áp su t (MPa)
Nhi tăđ (C) Th i gian (gi )
Áp suất đóng vai trò quan trọng trong quá trình trích ly các hợp chất triterpenoid Quy trình trích ly được mô tả chi tiết trong hình 2.2, trong đó các yếu tố như tỉ lệ etanol/nguyên liệu, nhiệt độ và thời gian cũng được đề cập Bảng 2.4 trình bày những thay đổi của áp suất trong quá trình này.
B ng 2.4: Kh o sát s nh h ng c a áp su t Áp su t (MPa) 25 30 35 40 45 50
Th i gian (gi ) 1,5 b) nh h ng c a t l etanol:nguyên li u
Khảo sát sinh học của etanol cho thấy nguyên liệu đạt hàm lượng triterpenoid cao Quy trình trích ly đặc thù được trình bày trong hình 2.2, trong đó xác định các yếu tố nhiệt độ, thời gian và áp suất thích hợp Kết quả tìm ra mức độ thay đổi của etanol được thể hiện trong bảng 2.5.
B ng 2.5: Kh o sát s nh h ng c a th i gian trích ly
Th i gian (gi ) 1,5 c) nh h ng c a nhi t đ trích ly
Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng triterpenoid trong quá trình trích ly được thực hiện theo quy trình như hình 2.2 Nghiên cứu đã xác định các yếu tố như thời gian, áp suất và tỉ lệ ethanol:nguyên liệu thích hợp, đồng thời chỉ ra rằng sự thay đổi nhiệt độ trích ly ảnh hưởng đến hiệu quả trích xuất, như trình bày trong bảng 2.6.
B ng 2.6: Kh o sát s nh h ng c a th i gian trích ly
Nhi tăđ ( o C) 35 40 45 50 55 60 Áp su t (bar) Thích h p m c a)
Th i gian (gi ) 1,5 d) nh h ng th i gian trích ly
Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng triterpenoid cho thấy quy trình trích ly đặc biệt được trình bày trong hình 2.2 Kết quả cho thấy áp suất, tỉ lệ etanol:nguyên liệu và thời gian thích hợp là những yếu tố quan trọng, trong đó mức độ trích ly được thể hiện qua bảng 2.7, cho thấy sự thay đổi theo thời gian trích ly.
B ng 2.7: Kh o sát s nh h ng c a th i gian trích ly
Th i gian (gi ) 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 Áp su t (MPa) Thích h p m c a)
Quy trình trích ly triterpenoid được thực hiện theo hình 2.2, trong đó tiến hành phân tích và xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng triterpenoid Ba yếu tố được chọn để khảo sát ảnh hưởng là phương pháp băm t đáp ứng với mô hình Box-Behnken.
B trí thí nghi m: Thí nghi m theo mô hình Box – Behnken g m 15 thí nghi m, trong đó có 3 thí nghi m tâm đ c trình bày b ng 2.8 X lí s li u b ng ph n m m Design – Expert 11
B ng 2.8: B ng b trí thí nghi m
Hàm l ng triterpenoid đ c đ nh l ng b ng HPLC v i ch t chu n là axit ursolic a) i u ki n v n hành HPLC
Máy HPLC Agilent, đ u dò DAD
C t Agilent Pursuit XRs C18 (250 mm 4.6 mm, 5 àm)
Th tớch tiờm: 20 àL b) nh l ng triterpenoid
Chu n b ch t chu n g c axit ursolic 1000 mg/L: Cân kho ng 10 mg ch t chu n axit ursolic chính xác đ n 0,1 mg, hòa tan và đnh m c 10 mL b ng dung d ch metanol (MeOH), b o qu n 4 o C
Chu n b ch t chu n làm vi c: S d ng micropipet hút ch t chu n g c và đ nh m c b ng dung môi MeOH vào các bình đnh m c 10 mL đ thu đ c dãy chu n có n ng đ
Ti n hành tiêm các dung d ch này vào máy HPLC, th c hi n đi u ki n v n hành HPLC, l p đ ng chu n axit ursolic
Các m u cao chi t đ c hoà tan và đ nh m c 25 mL b ng MeOH, l c qua đ u l c 0,45 m và cho vào l th y tinh (vial)
Ti n hành tiêm các dung d ch này vào máy HPLC, th c hi n t ng t nh đ i v i ch t chu n
2.2.2 Phân tích c u trúc nguyên li u tr c và sau khi trích ly và các nhóm ch c đ c tr ng có trong cao chi t
SEM: M u nguyên li u tr c và sau khi trích ly đ c ch p t i Vi n Hàn Lâm Khoa
H c và Công Ngh Vi t Nam, hãng JEOL-Nh t M u đ c c t lát đ ch p c u trúc l x p bên trong m u
FTIR được sử dụng để đánh giá các nhóm chức năng của chiết xuất G lucidum Trước khi phân tích, bột KBr cần được làm khô Chiết xuất được trộn với KBr theo tỷ lệ 1:100 (w/w) và sau đó được nén áp suất 5,5 tấn trong 3 phút để tạo viên Quang phổ được ghi nhận trong dải tần số từ 400 đến 4000 cm^-1.
2.2.3 Th nghi m ho t tính sinh h c c a cao chi t
2.2.3.1 Th nghi m ho t tính kháng oxy hoá a) Kh n ng b t g c t do DPPH
Chu n b dung d ch DPPH có n ng đ 1 mM trong methanol (b c kính tránh ánh sáng và s d ng ngay khi pha)
Axit ascorbic đ c s d ng làm đ i ch ng d ng trong thí nghi m Dung d ch axit ascorbic có hàm l ng 100 mg/mL đ c pha thành các n ng đ 1,56; 3,13; 6,25; 12,5;
25 và 50 àg/mL trong methanol
M u tr ng, ch ng d ng đ c th c hi n t ng t nh m u nh ng thay 4 mL dung d ch m u l n l t b ng 4 mL methanol và 4 mL axit ascorbic
Hòa tan 6 mL dung dịch DPPH vào 4 mL dung dịch mẫu, sau đó để trong bóng tối trong 30 phút ở nhiệt độ phòng và đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 517 nm Để xác định nồng độ kháng sinh, cao chiết được pha loãng trong metanol để thu được các nồng độ khác nhau Tiếp theo, thêm 1 mL mẫu vào 2,5 mL dung dịch đệm phosphate 0,2 M (pH = 6,6), ủ ở 50 độ C trong 20 phút, rồi bổ sung 2,5 mL dung dịch axit tricloacetic 10% Hỗn hợp được ly tâm ở 2000 vòng/phút trong 10 phút, lấy 2,5 mL dung dịch lỏng trên, thêm 2,5 mL nước cất và 0,5 mL dung dịch FeCl3 0,1% Đo độ hấp thụ quang tại 700 nm, giá trị OD phản ánh nồng độ kháng sinh trong mẫu; giá trị OD càng cao chứng tỏ nồng độ kháng sinh càng lớn Axit ascorbic được sử dụng làm đối chứng.
Mức độ pha loãng của mẫu được xác định là 256 µg/mL, 64 µg/mL, 8 µg/mL, 16 µg/mL và 4 µg/mL Để thực hiện thí nghiệm, 200 µL dung dịch chứa 3×10^4 tế bào/mL được bổ sung vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng trong môi trường RPMI 1640 cho các dòng tế bào Hep-G2, MCF-7, KB, và môi trường DMEM cho dòng tế bào Lu1 Các giếng được điều kiện ở nhiệt độ 37°C với 5% CO2 trong thời gian 72 giờ.
Sau 72 giờ, thêm 50 µL MTT (1 mg/mL pha trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh) và tiếp tục ủ ở 37 độ C trong 4 giờ Sau đó, loại bỏ môi trường, thêm 100 µL DMSO và đo quang phổ ở bước sóng 540 nm bằng máy spectrophotometer Genios TECAN Phân tích dữ liệu được thực hiện bằng phần mềm máy tính để xây dựng đường cong Địa chỉ liên hệ: Phòng Sinh học ứng dụng – Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ, Phòng 601, 18A, Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội.
2.2.3.3 Th nghi m ho t tính kháng khu n
D ch chi t đi u ki n t i u đ c th nghi m ho t tính kháng khu n trên v i ba vi khu n là Staphylococcus aureus (ATCC ® 653κ™), Bacillus subtilis (ATCC ® 6633™),
Lactobacillus fermentum (ATCC ® 9338™),, Salmonella enterica (ATCC ® 13311™), Escherichia coli (ATCC ® κ73λ™) và Pseudomonas aeruginosa (ATCC ® 27κ53™)
- M u ban đ u đ c pha loãng trong DMSO 5 % và n c c t vô trùng thành m t dãy các n ng đ khác nhau (256; 64; 16; 4; và 1 mM)
- Chu n b dung d ch vi khu n v i n ng đ 5×10 5 CFU/mL khi ti n hành th
- Sau 24 gi , đ c giá tr MIC Giá tr MIC đ c xác đ nh t i gi ng có n ng đ m u th th p nh t gây c ch hoàn toàn s phát tri n c a vi khu n
Giá trị IC50 được tính toán theo công thức (2.1) dựa trên số liệu đo đạc từ tế bào bằng máy quang phổ TECAN với bước sóng 4λ2 nm và dữ liệu thô Trong đó, μ IC là nồng độ cần thiết để ức chế 50%, A là hấp thu của mẫu chứa vật liệu cần thử nghiệm, A là hấp thu của mẫu chứa chất kháng khuẩn trước nồng độ cần thiết, và A là hấp thu của mẫu không chứa chất kháng khuẩn.
- MBC đ c xác đnh t i gi ng có n ng đ th p nh t có kh n ng làm gi m 99,9% l ng vi khu n b ng ph ng pháp đ m khu n l c
M u đ i ch ng d ngμ kháng sinh Ampicilin 10 mg/mL trong n c cho vi khu n Gram (+) và Cefotaxim 10mg/mL trong n c cho vi khu n Gram (-)
M u đ i ch ng âm: DMSO 5% aăđi m g i m u: Phòng Sinh h c ng d ng – Vi n Hóa h c – Vi n hàn lâm khoa h c và công ngh , Phòng 601, 18A, Hoàng Qu c Vi t, C u Gi y, Hà N i
CH NGă3:ă K T QU VÀ BÀN LU N
3.1 nhăh ng c aăđi u ki nătríchălyăđ n hàm lu ng triterpenoid
3.1.1 nh h ng c a t ng đi u ki n
Hình 3.1 th hi n nh h ng c a áp su t đ n hàm l ng triterpenoid trong cao chi t
![Hình 1.2: C u trúc -glucan phân l p t n m linh chi [17] - Nghiên cứu thu nhận cao chiết từ nấm linh chi bằng kỹ thuật co2 siêu tới hạn và thử nghiệm hoạt tính sinh học](https://media.store123doc.com/figures/005/625/hinh-c-u-truc-glucan-phan-linh-chi-5625014.webp)
