Nghiên cứu trích ly hợp chất curcuminoid trong củ nghệ vàng bằng ethanol

TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA HÓA HỌC ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU TRÍCH LY HỢP CHẤT CURCUMIN TRONG CỦ NGHỆ VÀNG Ở HUYỆN THANH CHƢƠNG, TỈNH NGHỆ AN BẰNG ETANOL Giảng viên hướng dẫn : ThS Trần quốc Toàn Sinh viên thực hiện: Mã sinh viên : Lớp : Vinh, 5/2016 PGS.TS Trần Đình Thắng Nguyễn Thị Lê 1152043892 52k3- Công nghệ Thực phẩm LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp này, trước hết tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành, sâu sắc tới PGS TS Trần Đình Thắng giao đề tài , nhiệt tình hướng dẫn giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình thực đồ án tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Trần Quốc Tồn -Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên - Viện hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện trang thiết bị, phịng thí nghiệm, tài liệu nghiên cứu có đóng góp quý báu trình thực đồ án tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn anh chị công tác Trung tâm Nghiên cứu Phát triển sản phẩm thiên nhiên, Phịng Hóa Sinh Hữu - Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên - Viện hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam quan tâm, tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện để làm đồ án Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô, anh chị nghiên cứu sinh cơng tác Trung tâm phân tích chuyển giao công nghệ Thực phẩm -Môi trường, trường Đại học Vinh bảo, truyền đạt kinh nghiệm q báu giúp tơi hồn thành đồ án tốt nghiệp Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn đến gia đình, người thân bạn bè quan tâm chia sẻ khó khăn động viên tơi hoàn thành đồ án tốt nghiệp Tuy nhiên, đồ án chắn cịn nhiều thiếu sót, mong q thầy bạn góp ý để đồ án hoàn thiện hơn, giúp học hỏi, rút kinh nghiệm cho công tác nghiên cứu sau Cuối cùng, lần xin gửi đến tất người quan tâm, giúp đỡ chúng tơi hồn thành đồ án lời cảm ơn chân thành ! Vinh, ngày 25 tháng năm 2016 Sinh Viên Nguyễn Thị Lê MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cảm ơn Mục lục PHẦN MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: Tổng quan 1.1 Tìm hiểu nghệ 1.1.1 Mô tả thực vật 1.1.2 Thành phần hóa học 1.1.3 Dƣợc tính 1.1.4 phân bố 1.2 Tìm hiểu curcumin 1.2.1.Thành phần hóa học 1.2.2.Hoạt tính sinh học curcumin 1.3.Tình hình sử dụng hoạt chất curcumin thực phẩm chăm sóc sức khỏe 10 1.3.1 Trong công nghiệp thực phẩm 11 1.3.2 Trong công nghiệp mỹ phẩm dƣợc phẩm 12 1.4 Khái quát công nghệ phân lập Curcumin từ củ nghệ vàng tác giả trƣớc 13 1.4.1 Công nghệ phân lập Curcumin từ Nghệ vàng cách tạo phức với axetat chì 13 1.4.2 Công nghệ phân lập Curcumin từ Nghệ vàng dầu béo 14 1.4.3 Công nghệ phân lập Curcumin từ Nghệ vàng kiềm axit 15 1.4.4 Công nghệ phân lập Curcumin từ củ Nghệ vàng dung môi hƣu 15 CHƢƠNG 2: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Các phƣơng pháp kỹ thuật 16 2.1.1 Phƣơng pháp tách biệt tinh chế hợp chất hữu 16 2.1.1.1 Phƣơng pháp chiết 16 2.1.1.1.1.Định nghĩa 16 2.1.1.1.2.kỹ thuật chiết chất lỏng 17 2.1.1.1.3.Chiết chất rắn 18 2.1.1.1.4.Phƣơng pháp chiết Soxhlet 18 2.1.1.2 Phƣơng pháp kết tinh lại 20 2.1.1.2.1.Định nghĩa 20 2.1.1.2.2.Chọn dung môi 20 2.1.1.2.3.Các thao tác kết tinh 22 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM 3.1 Nguyên liệu 24 3.1.1 Chọn nguyên liệu 24 3.1.2 Xử lý ban đầu 24 3.2 Dụng cụ hóa chất 25 3.1.1 Dụng cụ 25 3.1.2 Hóa chất 25 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 25 3.3.2 Phƣơng pháp quang phổ hấp phụ nguyên tử 25 3.3.3 Phƣơng pháp chiết chất rắn 25 3.4 Quy trình thực nghiệm 26 3.4.1 Sơ đồ công nghệ 26 3.4.2 Thuyết minh quy trình 26 3.4.2.1 Chiết Curcumin từ củ nghệ 26 3.4.2.2.Tinh chế 27 3.4.2.Chiết curcumin 27 3.4.3 Khảo sát số yếu tố đến hiệu suất chiết Curcumin 27 3.4.5 Kết tinh Curcumin thô 27 3.4.5 Tinh chế sản phẩm 28 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1.Khảo sát số yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu suất trình 29 4.1.1 Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ cồn đến hiệu suất phân lập curcumin 29 4.1.2.Ảnh hƣởng nhiệt độ tới hiệu suất trình chiết curcumin 30 4.1.3 Ảnh hƣởng thời gian tới hiệu suất trình chiết 31 4.2.Sản xuất thử nghiệm theo điều kiện tối ƣu 33 4.3 Xác định số tiêu chất lƣợng sản phẩm 34 4.3.1 Định tính phƣơn 34 4.3.2 Kiểm định chất lƣợng sản phẩm.g pháp hóa học 34 PHẦN KẾT QUẢ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Nghệ (Curcuma longa Linn) loại thân thảo lâu năm thuộc họ gừng Chúng sử dụng ăn Việt Nam, Ấn Độ,Trung Quốc,…Thân rễ nghệ gồm curcumin, curcuminoid, tinh dầu, Oleoresin nghệ sử dụng điều trị bệnh vàng da (bệnh gan), khó tiêu, nhiễm trùng đường tiết niệu, viêm khớp dạng thấp côn trùng cắn,…Đặc biệt Việt Nam nghệ biết đến phương thuốc chữa đau dày hiệu Trong tinh bột nghệ có chứa hoạt chất curcumin có tác dụng kháng viêm, chống oxy hóa kháng khuẩn Cũng có nhiều nghiên cứu curcumin làm vơ hiệu hóa tế bào ung thư Ngăn chặn hình thành tế bào ung thư mới, điều trị viêm gan B, C nhiễm HIV Curcumin thành phần đặc biệt hoạt chất tạo nên màu vàng đặc trưng cho củ nghệ Trong lượng curcumin chiếm khoảng 0,3 - 1% khối lượng củ nghệ Chỉ có curcumin tự nhiên củ nghệ có khả phịng chống lại phát triển tế bào ung thư bệnh khác cao Việt Nam nước nông nghiệp nhiệt đới nóng ẩm vùng đơng nam Châu Á, điều kiện phù hợp với loại lấy củ như: gừng, nghệ, tỏi, hành,… Trong nghệ cấy trồng rộng rãi số nước Châu Á Ấn Độ, Trung Quốc Việt Nam khơng ngoại lệ Ở nước ta nói chung tỉnh Nghệ An nói riêng nghệ trồng phổ biến với nhiều chủng loại đa dạng phong phú Với nguồn nguyên liệu dồi phong phú nói với kiến thức biết thao tác thí nghiệm học mơn hóa học thực nghiệm.Tơi tiến hành nghiên cứu trích ly curcumin từ củ nghệ vàng với tên đề tài “Nghiên cứu trích ly hợp chất curcuminoid củ nghệ vàng Ethanol” Đối tƣợng nghiên cứu Củ nghệ thu từ nghệ trồng huyện Thanh Chương, tỉnh Nghệ An Phạm vi nghiên cứu - Tìm hiểu thành phần,ứng dụng củ nghệ hoạt chất curcumin - Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết: thời gian, tỉ lệ nguyên liệu dung mơi chiết - Nghiên cứu ly trích curcumin, từ thiết lập quy trình chiết tách Curcumin củ nghệ vàng - Tách Curcumin khỏi tạp chất dung dịch chiết để Curcumin tinh khiết - Định lượng curcumin HPLC Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu ly trích hợp chất curcumin củ nghệ vàng Ethanol Phƣơng pháp nghiên cứu - Nghiên cứu tài liệu có liên quan đến đề tài - Tự tìm tịi, tự nghiên cứu - Thu thập, tổng hợp tài liệu, tư liệu, sách báo nước phân loại thực vật, đặc điểm sinh thái thành phần hóa học nghệ, hóa học Curcumin, phương pháp chiết tách - Phương pháp phân tích trọng lượng để xác định độ ẩm - Phương pháp phân hủy mẫu phân tích để khảo sát hàm lượng tro - Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS để xác định hàm lượng kim loại củ nghệ vàng - Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) xác định lượng curcumin Phạm vi ứng dụng nghiên cứu - Ứng dụng vào sản xuất thực phẩm chức - Ứng dụng bào chế số chế phẩm curcumin - Ứng dụng làm chất màu dùng thực phẩm CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tìm hiểu nghệ - Nghệ cịn có tên uất kim, khƣơng hồng, safran des Indes - Tên khoa học Curcuma longa L (Curcuma domestica Lour) - Thuộc họ Gừng Zingiberaceae - Ta dùng thân rễ gọi khương hoàng (Rhizoma Curcumae longae) rễ củ gọi uất kim (Radix Curcumae longae) 1.1.1 Mơ tả thực vật Nghệ lồi cỏ cao 0.60m đến 1m Thân rễ thành củ hình trụ dẹt, bẻ cắt ngang có màu vàng cam sẫm Lá hình trái xoan thon nhọn hai đầu, hai mặt nhẵn dài tới 45cm, rộng tới 18cm Cuốn có bẹ, cụm hoa mọc từ lên, thành hình nón thưa, bắc hữu thụ khum hình máng rộng, đầu trịn màu xanh lục nhạt, bắc bất thụ hẹp hơn, màu tím nhạt Tràng có phiến, cánh hoa ngồi màu xanh lục vàng nhạt, chia thành ba thùy, thùy to hơn, phiến cánh hoa chia thành ba thùy, thùy hai bên đứng phẳng, thùy hõm thành máng sâu Quả nang ngăn, mở van Hạt có áo hạt trồng khắp nơi nước ta để làm gia vị làm thuốc ngồi cịn mọc trồng nước Ấn Độ, Inđônêxia, Campuchia, Lào, Trung Quốc, nước nhiệt đới Nghệ thường thu hoạch vào mùa thu Hình 1.1 Thân, hoa, củ nghệ 1.1.2 Thành phần hóa học Trong nghệ, người ta phân tích được: - Chất màu curcumin 0,3%- 1%, tinh thể nâu đỏ ánh tím, khơng tan nước, tan rượu, ete, clorofoc, dung dịch có huỳnh quang màu xanh lục Công thức curcumin xác định sau: - Các chất màu vàng gọi chung curcumin Vào đầu kỉ XIX người ta chiết curcumin tinh thể không tan nước, tan cồn, ete, dầu béo Nhưng năm 1953 Srinivasan K R chứng minh sắc kí cột silic hỗn hợp: + Curcumin thức (cịn gọi curcumin I) chiếm 60% đixeton đối xứng không no coi diferuloyl-metan (axit ferulic axit hydroxy-4metoxy-3-xinamic) + Curcumin II hay demetoxy-curcumin chiếm 24% curcumin III hay bisdemetoxy-curcumin chiếm 14% hay hydroxyxinamic thay cho axit ferulic Nếu dùng sắc kí giấy thấy chất curcumin khác với lượng nhỏ + Năm 1977, Nguyễn Khang (đại học Dược Hà Nội) chiết từ bột củ nghệ sau cất lấy hết tinh dầu bezen, sau thu hồi dung mơi áp lực giảm kết tinh cồn etylic có độ chảy không thay đổi vết sắc kí lớp mỏng thu 0,76 – 1,1% curcumin I tinh khiết, độ chảy 182 -1830 C Nếu chọn củ nghệ thu vào tháng 1, tháng đạt tới 1,5% curcumin + Tinh dầu – 5% có màu vàng nhạt, thơm Trong tinh dầu gồm có 25% cacbua tecpenic, chủ yếu zingiberen 65% xeton sespuitecpenic, chất tumeron, curcumen C15 H24 cacbon không no Tumeron + Ngồi cịn tinh bột, canxi oxalat, chất béo Củ nghệ chứa – 10% nước, – 8% chất vô cơ, 40 – 50% tinh bột nhựa 1.1.3 Dược tính Củ nghệ biết đến với nhiều công dụng khác nhau, đặc biệt Ấn Độ nhiều nước, phương đông lẫn phương Tây, sử dụng loại dược liệu trị bách bệnh  Tác dụng chống oxy hoá: khử gốc tự do, giúp phịng bệnh tim mạch, lão hố tương tụ vitamin E, C, betacaroten Tinh chất nghệ - Cucurmin có khả chống ơxy hóa mạnh (mạnh gấp 300 lần vitamin E), giúp thể tiêu diệt gốc tự do, chống lão hóa, giúp da trắng hồng, mịn màng, giảm nám, mờ vết tàn nhang, giảm trường hợp dị ứng da, bảo vệ hồng cầu, hàn gắn vết thương thể, loại bỏ độc tố có thực phẩm dùng ngày  Tinh chất nghệ Cucurmin chứa lượng lycopen cao, hoạt chất “vàng” ngành mỹ phẩm nhờ tác dụng:  Nuôi da: Kích thích trao đổi chất mạch máu da, đẩy nhanh trình tái tạo tế bào giúp da mịn màng tươi trẻ  Giảm nám: Tăng cường đào thải tế bào da nhiễm sắc tố sinh nám ngăn cản tác hại từ tia UV, giúp da trắng mờ nhanh vết nám  Chống nhăn: Chống oxy hóa tế bào da, giữ vững cấu trúc collagen giúp da săn chắc, giảm nếp nhăn mắt  Ngăn rụng tóc: Ni dưỡng chân tóc giúp mọc nhanh, sợi bóng đẹp, giảm khô gãy  Tác dụng chống viêm loét dày: Do làm tăng tiết chất nhớt mucin, giúp bảo vệ niên mạc dày  Tác dụng gây hưng phấn kích thích co bóp tử cung: Nghệ có tác dụng kích thích tố estrogen  Tác dụng giải độc gan lọc máu: Nghệ có tác dụng lợi mật thông mật, làm giảm lượng enzim gan alamin aminotranspherase Alat ( SGPT) aspartat amintransferase Ất ( Sgot) máu  Tác dụng kháng sinh vi khuẩn gram dương ( Staphylococcus aureus…) vi khuẩn gram âm ( Samonella typhi…): Tương tự penicillin streptomycin Nghệ Curcumin ngăn chặn phát triển vi trùng lao  Tác dụng kháng nấm, tiêu biểu Trychophyton gypcum, Candida albicans…nhất Aspergillus parasiticus phóng tích Aflatoxin, tác nhân gây nhiễm độc gan thường xảy dung thực phẩm đóng hộp  Tác dụng làm giảm lượng mỡ triglyceride huyết cholesterol huyết toàn phần: đặc biệt cholesterol toàn phần, curcumin làm tăng tỷ lệ hàm lượng HDL (high densitly lipoprotein, đóng vai trò quan trọng bảo vệ tim mạch), phòng chống xơ vữa động mạch Do chức chuyển hoá phân huỷ lượng mỡ dư thừa thể curcumin, người ta sử dụng curcumin để phụ trị hội chứng béo phì mỡ tích tụ thái mô tế bào  Tác dụng chống sinh huyết khối ức chế enzim tiểu cầu cyclooxygenase thromboxane B2: giúp ngăn ngừa đột quỵ, nhồi máu tim ( tương tự aspirin)  Tác dụng kháng viêm: ức chế enzim lypoxygenase cyclooxygenase, giúp ngăn cản tiến q trình phóng thích chất gây viêm ( prostaglandin, thromboxan…) tương đương với cortisone, phenybutaron… Curcumin xem chất kháng viêm tối ưu không phản ứng phụ chữa trị chứng viêm khớp  Tác dụng phòng chống ung thư: - Bổ sung 1% curcumin vào phần ăn ngày, co khả ức chế phát triển khối u dày, khối u vú - Bổ sung 0,2% curcumin vào phần ăn ngày, có khả ngăn chặn ung thư đại tràng gây azo xymethan - Thoa thuốc mỡ 5% curcumin lên vết thương ung thư da 62 bệnh nhân , có tác dụng làm giảm ngứa đau 50% giảm rỉ nước 70% giảm mùi hôi thối 90% trường hợp - Cho 100 bệnh nhân bị ung thư miệng uống 500mg curcumin lần ngày vòng 30 ngày Đa số bệnh nhân thuyên giảm rõ rệt sau 15 ngày tiến triển ngày khả quan sau 30 ngày điều trị  Tác dụng phòng chống HIV/AIDS: - Năm 1994, Hội thảo AIDS San Francisco (Mỹ) báo cáo kết qảu điều trị curcumin trren 18 bệnh nhân bị nhiễm HIV Cho bệnh nhân uống curcumin với liều lượng 2000mg ngày vòng 127 ngày Trước sau điều trị người ta đo lượng thực bào T bao gồm CD-4 (T-suppressor) ghi nhận kết thật phấn khởi: CD-4 tăng từ lên 615 tế bào /ml máu CD-8 tăng từ 283 lên 1467 tế bào/ml máu - Người ta cho curcumin có khả tăng cường hệ thống miến dịch tác động ức chế curcumin enzim HIV-type entegrase - Curcumin cịn có khả ức chế phóng thích cytokine, tác nhân độc hại tham gia qua trình gây nhiễm HIV 1.2 Tìm hiểu curcumin [8], [9] 1.2.1 Thành phần hóa học Tên IUPAC: (1E, 6E) -1,7-bis (4-hydroxy-3-metoxyphenyl) -1,6-heptadien-3,5dion - Cơng thức phân tử: C21H20O6 Q trình sắc ký lỏng dựa chế chất hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ (rây phân tử) Tìm hiểu hệ thống HPLC Hình 2.4 Sơ đồ máy HPLC Bình đựng dung mơi - Hiện máy HPLC thường có đường dung môi vào đầu bơm cao áp cho phép sử dụng bình chứa dung mơi lần để rửa giải theo tỉ lệ mong muốn tỉ lệ dung môi đường 100% Tuy nhiên theo kinh nghiệm sử dụng đường dung môi lúc mà cho sử dụng tối đa đường cho hệ pha động pha trộn đồng hơn, hệ pha động đơn giản để trình rửa giải ổn định - Hiện đường dung môi phục vụ chủ yếu cho việc rửa giải Gradial dung môi theo thời gian công tác xây dựng tiêu chuẩn Lƣu ý: + Tất dung môi dùng cho HPLC phải dung môi tinh khiết có ghi rõ nhãn dùng cho HPLC hay dung mơi tinh khiết phân tích + Tất hóa chất dùng để pha mẫu pha hệ đệm phải sử dụng hóa chất tinh khiết phân tích + Sử dụng hóa chất tinh khiết nhằm mục đích tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo nên peak tạp trình phân tích Bộ khử khí Degasse Mục đích khử khí nhằm loại trừ bọt nhỏ cịn sót lại dung mơi pha động Nếu q trình phân tích mà dung mơi pha động cịn sót bọt khí số tượng sau xảy ra: + Tỉ lệ pha động đường dung môi không cho thời gian lưu cuả Peak thay đổi + Trong trường hợp bọt q nhiều khử khí khơng thể loại trừ hết bơm cao áp khơng hút dung mơi áp suất khơng lên máy sắc ký ngừng hoạt động Trong trường hợp nêu cho kết phân tích sai Bơm cao áp Mục đích để bơm pha động vào cột thực trình chia tách sắc ký Pump phải tạo áp suất cao khoảng 250 at – 500 at (1at = 0,98 bar) pump phải tạo dòng liên tục Lưu lượng bơm từ 0,1 – 9,999 ml/phút Máy sắc ký lỏng thường có áp suất tối đa 412bar (khoảng 420at) Tốc độ dòng 0,1 – 9,999 ml/phút Tốc độ bơm định theo thông số cài đặt Hiện bơm có Pisstone thay phiên để đẩy dung môi liên tục Bộ phận tiêm mẫu Để đưa mẫu vào cột phân tích theo phương pháp khơng ngừng dịng chảy với dung tích -100µl Có cách lấy mẫu vào cột: tiêm mẫu thủ công tiêm mẫu tự động (Autosample) Cột sắc ký Cột chứa pha tĩnh coi trái tim hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao - Cột pha tĩnh thông thường làm thép không rỉ, chiều dài cột khoảng 10 – 30cm, đường kính – 10mm, hạt chất nhồi cột cỡ φ = – 10µm, ngồi - - - cịn số trường hợp đặc biệt kích thước kích cỡ hạt,… Vi chất nhồi cột cỡ φ = 1,8 – 5µm dùng cột ngắn (3 – 10cm) nhỏ (đường kính từ – 4,6mm) loại cột có hiệu tách cao Chất nhồi cột tùy theo loại cột kiểu sắc ký Thông thường chất nhồi cột Silicagel (pha thuận) Silicagel Silan hóa học bao lớp mỏng hữu (pha đảo), người ta cịn dùng loại hạt khác như: Nhơm oxit, Polyme xốp, chất trao đổi ion Đối với số phương pháp phân tích địi hỏi phải có nhiệt độ cao thấp nhiệt độ phịng cột đặt phận điều nhiệt Detector Là phận phát chất chúng cột cho tín hiệu ghi sắc đồ định tính định lượng Tùy theo tính chất chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại Detector thích hợp phải thõa mãn điều kiện nồng độ định chất phân tích A = k.C Trong đó: A tín hiệu đo C nồng độ chất phân tích K số thực nghiệm Detector chọn Tín hiệu là: Độ hấp thụ quang; cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện; độ dẫn nhiệt, chiết suất… Trên sở người ta chế tạo loại Detector sau: - Detector quang phổ tử ngoại 200 – 380 nm để phát UV - Detector quang phổ tử ngoại khả kiến (UV – VIS): 190 – 900nm để phát chất hấp thụ quang Đây loại thông dụng - Detector huỳnh quang phát chất hữu chứa huỳnh quang tự nhiên dẫn xuất có huỳnh quang, loại Detector có độ chọn lọc cao - Loại đại có Detector Diod Array (Detector tán xạ bay hơi) Detector có khả qt chồng phổ định tính chất theo độ hấp thụ cực đại chất Ngoài ra, số loại Detector khác là: - Detector điện hóa: Đo dịng, cực phổ, độ dẫn, điện lượng… - Detector chiết suất vi sai: Detector khúc xạ (thông thường dùng cho đo chất đường) - Detector đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt,… Bộ phận ghi tín hiệu Để ghi tín hiệu phát Detector truyền sang - Trong máy hệ cũ sử dụng máy ghi đơn giản vẽ sắc ký đồ, thời gian lưu, diện tích Peak, chiều cao - Các máy hệ dùng phần mềm chạy máy tính lưu tất thông số, phổ đồ thông số Peak tính đối xứng, hệ số phân giải… q trình phân tích đồng thời xử lí, tính tốn thơng số theo u cầu người sử dụng In kết Sau phân tích xong mẫu ta in kết phần mềm tính tốn giấy hồn thiện hồ sơ CHƢƠNG THỰC NGHIỆM 3.1 Nguyên liệu 3.1.1 Chọn nguyên liệu - Chọn nghệ già, thân vàng, bị khơ rụi, khơng cịn xanh tươi, thu hoạch địa bàn huyện Thanh Chương, tỉnh Nghệ An Lấy củ, chọn củ tốt khỏe, màu vàng sẫm.da bóng,khong mọc mầm, khơng bị úng, thối,khơng bị sâu Sau cắt rời khỏi thân rễ - Rửa nước, để khơ ráo, cắt lát nhỏ sau đem sấy 1100C để diệt men 30 phút sau hạ nhiệt độ xuống 600C đến nghệ nước hoàn toàn Dùng máy xay sinh tố nghiền nghệ sấy thành bột mịn 3.1.2 Xử lý ban đầu - Nguyên liệu đem có lẫn nhiều tạp chất chủ yếu tạp chất rắn (đất, đá…) tạp chất hữu (lá mục, xơ…) Vì bước ta phải làm học - Đầu tiên cho củ nghệ chọn vào chậu, đổ nước vào ngâm khoảng 10 phút, sau vớt củ nghệ rửa củ vòi nước chảy, để rổ cho củ nghệ nước hong khô - Việc hong khô tiến hành điều kiện bình thường, nơi tránh ánh nắng trực tiếp chiếu vào Mục đích: tránh tượng oxy hóa gây biến chất màu Và dùng quạt để thổi không khí - Sau hong khơ nghệ ta tiến hành gọt vỏ, tẩy nhựa, thái lát, cho vào tủ sấy để sấy khô, nhiệt độ sấy 600 C kiểm tra chất lượng trước đem chiết - Nghệ lát khô xay thành bột cỡ hạt khoảng 0,5mm 3.2 Dụng cụ hóa chất 3.1.1 Dụng cụ - Tủ sấy - Bộ chiết Soxhlet - Hệ thống HPLC - Hệ thống máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS - Dụng cụ phịng thí nghiệm thơng thường: cốc thủy tinh, đũa thủy tinh, phễu, giấy lọc,bình cầu,bình tam giác… - Cân phân tích - Máy li tâm 3.1.2 Hóa chất - nước cất lần - Axeton 3.3 quy trình cơng nghệ Ngun liệu củ nghệ tươi Rửa Nguyên liệu bóc vỏ Tẩy nhựa Nguyên liệu Tách nước Nguyên liệu khô Nghiền Nguyên liệu bột Chiết cồn Dịch chiết Cất loại dung môi Dịch thu Etanol Kết tinh Curcumin thô Tạo tủa Curcumin tinh 3.4 Thuyết minh quy trình 3.4.1 Chiết tách curcumin từ củ nghệ Mẫu sau làm sạch, cắt lát cất lôi nước để loại tinh dầu, đem sấy khô tán thành bột Tiến hành chiết soxhlet với dung môi etanol Chiết nhiệt độ 800C, 4h ta thu dịch chiết chứa Curcumin 3.4.2 Kết tinh Curcumin thô Dung dịch sau cất loại dung môi đựơc tủa Curcumin dần hỗn hợp etanol – nước Dịch lọc loại nhựa dầu bổ sung thêm etanol để lạnh 24h Sau đs lọc lấy tủa Curcumin thơ cịn lẫn nhựa tinh dầu 3.4.3 Tinh chế Curcumin thô thu lẫn nhiều tạp chất,tinh dầu nhựa dầu, đem tinh chế lại để thu curcumin tinh Hòa tan curcumin thô hỗn hợp dung dung môi axeton/n-hexan, lcj bỏ phần khơng tan sau cất loại dung môi kết tinh lại lần etanol, thu lấy sản phẩm sấy khô đến khối lượng không đổi Sản phẩm thu kiểm tra chất lượng HPLC 3.4 Khảo sát số yếu tố đến hiệu suất chiết Curcumin a, Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ cồn đến hiệt suất chiết Curcumin - Các thí nghiệm bố trí với nồng độ cồn thay đổi từ 70%, 75%, 80%, 85%, sau chiết nhiệt độ 600C Sau 4h chiết, so sánh hiệt suất chiết mẫu b, Nghiên cứu ảnh hƣởng nhiệt độ chiết đến hiệu suất chiết Curcumin - Các thí nghiệm bố trí với nhiệt độ thay đổi 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80°C, Sau 4h thủy phân, so sánh hiệt suất chiết Curcumin c, Nghiên cứu ảnh hƣởng thời gian chiết tới hiệu suất trình chiết Curcumin - Thực thí nghiệm khảo sát q trình chiết Curcumin với điều kiện thời gian chiết thay đổi Q trình thí nghiệm dừng lại hiệt suất chiết Curcumin tăng khơng tăng Từ xác định thời gian chiết Curcumin để đạt hiệu suất cao CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Khảo sát số yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu suất trình 4.1.1 Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ cồn đến hiệu suất phân lập curcumin Trong trình chiết curcumin, cần chọn nồng độ dung môi cồn nhằm tạo điều kiện hòa tan tốt curcumin giảm khả hòa tan số loại keo dầu Từ tăng hiệu suất trình phân lập - Tiến hành phản ứng điều kiện:  Khối lượng nghệ khô: kg   Nhiệt độ: 800C Thời gian chiết: 4h  Nồng độ cồn thay đổi từ 70 – 95% (theo thể tích) Kết nghiên cứu thể bảng sau: STT Nồng độ cồn (%) Khối lượng curcumin thu (g) Hiệu suất(%) 70 18,0 38,29 75 18,8 40 80 24,7 52,55 85 27,3 58,08 90 26,9 57,72 95 22,3 47,44 Bảng 1: Ảnh hưởng nồng độ đến hiệu suất Từ kết ta có đồ thị thể ảnh hưởng nồng độ cồn đến hiệu suất trình chiết xuất curcumin Đồ thị 4.1 Ảnh hƣởng nồng độ cồn đến hiệu suất chiết curcumin Từ đồ thị ta nhận thấy hiệu suất chiết curcumin tăng chậm tăng nồng độ cồn từ 70 lên 75% tăng nhanh tăng nồng độ cồn từ 75 lên 85%, tiếp tục tăng nồng độ cồn từ 85 lên 90 95%, hiệu suất thu hồi giảm Vì vậy, để đạt hiệu tối ưu, dự kiến sử dụng cồn 85% (V) để đảm bảo hiệu suất chiết curcumin đạt cao 4.1.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ tới hiệu suất trình chiết curcumin Trong trình chiết curcumin, nhiệt độ có ảnh hưởng lớn tới hiệu trình chiết curcumin Nếu nhiệt độ thấp, thời gian chiết kéo dài chiết không triệt để Nếu nhiệt độ cao gây lãng phí lượng, từ ảnh hưởng tới giá thành sản phẩm - Tiến hành trình khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ điều kiện:  Dung môi sử dụng: etanol 85%  Thời gian chiết: 4h Kết nghiên cứu thể bảng sau: STT Nhiệt độ ( 0C) Khối lượng curcumin thu được(g) Hiệu suất (%) 35 12 25,53 40 13,8 29,36 45 15,3 32,55 50 18,3 38,94 55 23,7 50,42 60 25,8 54,89 65 26,9 57,23 70 27,3 57,08 75 27,2 57,87 10 80 27,3 57,23 Bảng Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất chiết curcumin Đồ thị 4.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ tới hiệu suất chiết curcumin Từ đồ thị ta nhận thấy hiệu suất chiết curcumin tăng từ từ khoảng nhiệt độ từ 35 tới 450C, tăng nhanh khoảng nhiệt độ từ 45 tới 600C, tăng chậm khoảng từ 60 tới 700C không tăng thêm khoảng từ 70 tới 800C Vì vậy, để đảm bảo tiết kiệm lượng, đề nghị chiết curcumin khoảng nhiệt độ từ 65 tới 700C hợp lý 4.1.3 Ảnh hƣởng thời gian tới hiệu suất trình chiết Trong trình chiết curcumin, thời gian có ảnh hưởng lớn tới hiệu trình chiết curcumin Nếu thời gian chiết ngắn, lượng curcumin chiết khơng triệt để cịn thời gian kéo dài, gây lãng phí lượng ảnh hưởng tới kế hoạch sản xuất Tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng thời gian tới hiệu chiết theo điều kiện: Dung môi sử dụng: etanol 85%, nhiệt độ chiết: 700C Các kết thu bảng sau: STT Thời gian (phút) Khối lượng Curcumin thu được(g) Hiệu suất (%) 30 12,3 26,17 60 14,2 30,21 90 15,7 33.40 120 18,4 39,14 150 23,1 49,14 180 25,6 54,47 210 26,6 56,59 240 27,4 58,29 270 27,5 58,51 10 300 27,3 58,08 Bảng Ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất trình Đồ thị 4.2 Ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất chiết curcumin Từ đồ thị 4, ta thấy hiệu suất q trình chiết curcumin tăng từ từ khoảng thời gian từ 30 tới 90 phút, tăng nhanh khoảng thời gian 90 phút tới 180 phút, tăng chậm từ phút thứ 180 tới 240 không tăng thêm khoảng thời gian Vì vậy, để đạt hiệu cao nhất, chúng tơi đề nghị thực q trình chiết curcumin khoảng thời gian 240 phút (4h) 4.2 Sản xuất thử nghiệm theo điều kiện tối ƣu Dựa vào nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện tới hiệu suất q trình chiết curcumin, tơi đề nghị số điều kiện để hiệu suất quy trình đạt tới tối ưu sau: - Dung môi chiết: Ethanol 85% (theo thể tích) - Nhiệt độ chiết: 65 – 700C - Thời gian chiết: 210 – 240 phút (3,5 – 4h) Tơi tiến hành thí nghiệm lặp lại điều kiện với lượng nguyên liệu ban đầu 10 Kg, lượng dung mơi cho lần sử dụng 15 lít (ngập mặt nguyên liệu) Kết thu lượng curcumin (g) mẻ thí nghiệm sau: Lần Lần Lần Lần Lần 274 276 277 275 276 Lượng curcumin thu trung bình 275,6 ± 1,5 g Như hiệu suất thu hồi curcumin từ củ nghệ khô ~ 2,75% Như vậy, thơng số đưa cho quy trình chiết curcumin sử dụng công nghệ cồn – nước đảm bảo độ ổn định cao 4.3 Kiểm định chất lƣợng sản phẩm Curcumin chiết suất công nghệ cồn – nước có màu vàng cam, điểm nóng chảy khoảng 175 – 1760C Curcumin không tan nước, tan vừa phải rượu lạnh axeton, tan tốt ete etylic, tan kiềm cho sản phẩm màu đỏ sẫm tới tím 4.3.1 Kiểm tra thành phần hàm lƣợng curcumin HPLC Hình 4.3 Sắc đồ HPLC Mẫu curcumin thu tồn ba dạng đồng phân curcumin với tỉ lệ Bisdemethoxycurcumin : Demethoxycurcumin : Curcumin 5,05 : 2,20 : 83,40 Tổng hàm lượng dạng curcumin đạt ~ 95% 4.3.2 Đánh giá số tiêu kim loại nặng có mẫu sản phẩm STT Tên tiêu Đơn vị Hàm lượng Mức tối đa Asen (As) ppm 0,037 0,5 Cadimi (Cd) ppm 0,603 Chì (Pb) ppm 0,300 Thủy ngân (Hg) ppm 0,100 0,1 Như vậy, mẫu sản phẩm curcumin thu theo quy trình cồn đảm bảo tiêu kim loại nặng đạt tiêu chuẩn theo quy định Y tế KẾT QUẢ - Đã tiến hành nghiên cứu hồn thiện quy trình cơng nghệ chiết xuất curcumin sử dụng dung môi etanol - Đã khảo sát số yếu tố ảnh hưởng tới hiệu suất trình chiết curcumin từ củ nghệ vàng Xác định thông số cụ thể, dung môi sử dụng etanol 85%, thời gian chiết 3,5 – 4h, nhiệt độ chiết 65 – 700C Đã xác định hiệu chiết curcumin từ củ nghệ vàng theo quy trình thông số xác định 2,75% Đã kiểm tra số tiêu chất lượng sản phẩm Sản phẩm tồn đầy đủ ba dạng đồng phân curcumin, tiêu kim loại nặng ngưỡng cho phép theo quy định Y tế TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1] Kì Anh (2008), Tác dụng thân kì củ gừng & nghệ phịng & trị bệnh, Nxb Đà Nẵng, TP.Hồ Chí Minh [2] Võ Văn Chi (2005), Cây thuốc An Giang, Nxb Y học, Hồ Chí Minh [3] Nguyễn Cơng Tỷ (2005), Cây thuốc vị thuốc phƣơng Đông, Nxb Tổng hợp thành phố Hồ Chí Minh [4] .Đỗ Tât Lợi (2006), Những thuốc thuốc Việt Nam, Nxb Y dược [5] Phan Hiền Lương, Kĩ thuật HPLC, trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm [6] Lê Anh Đào,Đặng Văn Liêu (2005), Thực hành hóa học hữu cơ, Nxb Đại học Sư Phạm [7] Đào Hữu Vinh, Nguyễn Xuân Dũng, Trần Thị Mỹ Linh, Phạm Hùng Việt (1985) [8] Giang Thị Sơn cộng 1, 15 - 17 (2002) [9] Châu Vĩnh Thị cộng Tạp chí dƣợc học 8/2000,22-25 Tiếng Anh [1] Peter, K.V, Handbook of Herbs and Spices, Woodhead Publishing, 2001, p 300 [2] Ishita Chattopadhyay, Kaushik Biswas, Uday Bandyopadhyay Ranajit K Banerjee, Turmeric and curcumin: Biological actions and medicinal applications, Current Science 87, 1, 44 - 53, 2004 [3] M A Islam, K Kloppstech and H -J Jacobsen, Efficient Procedure for In vitro Microrhizome Induction in Curcuma longa L (Zingiberaceae) – A Medicinal Plant of Tropical Asia, Plant Tissue Cult 14(2), 2004, p 123-134 [4] Mrudul V Shirgurkar, C K John & Rajani S Nadgauda, Factors affecting in vitro microrhizome production in turmeric, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 64, 2001, p 5–11 [5] S Prathanturarug, N Soonthornchareonnon, W Chuakul, Y Phaidee, P Saralamp, High- frequency shoot multiplication in Curcuma longa L using thidiazuron, Plant Cell Rep 21, 2003, [6] Quintanilla Almagro, Eliseo; Diaz Alperi, Joaquin Method for obtaining apolar and polar extracts of curcuma and applications thereof United States Patent 6440468 p 1054–1059 [7] Vilas Gajanan Gaikar, Deepak Vijay Dandekar: Process for extraction of curcuminoids from curcuma species United States Patent 6224877 [8] W Baumann, S V Rodrigues and L M Viana J Chem Eng., Vol 17, No S9oPaulo Sept (2000) [9] Angel L Chassagnez-MendÐz, NÐlio T Machado, Marilena E Araujo, J G Maia, and M Angela A Meireles Ind Eng [10] W Baumann, S V Rodrigues and L M Viana J Chem Eng., Vol 17, No.3 são Paulo sept.(2000) [11] Angel L Chassagnez-MendÐz, NÐlio T Machado, Marilena E Araujo, J G Maia, and M Angela A Meireles Ind Eng Chem Res., 39 (12), 4729 - 4733 http://vi.wikipedia.org/wiki/Curcumin www.curcumin.net/ www.phytochemicals.info/ /curcumin.php http://tailieu.vn/tag/tai-lieu/curcumin.html ftp://ftp.fao.org/es/esn/jecfa/cta/CTA_61_Curcumin.pd http://www.ebook.edu.vn/?page=1.18&view=17721 ... nghiệm.Tơi tiến hành nghiên cứu trích ly curcumin từ củ nghệ vàng với tên đề tài ? ?Nghiên cứu trích ly hợp chất curcuminoid củ nghệ vàng Ethanol? ?? Đối tƣợng nghiên cứu Củ nghệ thu từ nghệ trồng huyện... nghiên cứu Nghiên cứu ly trích hợp chất curcumin củ nghệ vàng Ethanol Phƣơng pháp nghiên cứu - Nghiên cứu tài liệu có liên quan đến đề tài - Tự tìm tịi, tự nghiên cứu - Thu thập, tổng hợp tài liệu,... tỉnh Nghệ An Phạm vi nghiên cứu - Tìm hiểu thành phần,ứng dụng củ nghệ hoạt chất curcumin - Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết: thời gian, tỉ lệ nguyên liệu dung môi chiết - Nghiên cứu ly